胸腺素α1基因串联体的构建

0 引言胸腺素α1(Thymosin alpha 1, Tα1)是从胸腺素组分5(TF5)中分离纯化出的热稳定酸性多肽[1],由28个氨基酸组成,Mr为3108. 它是一种具有多种生物学活性的免疫调节剂,已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症和免疫缺陷的研究中. 虽然胸腺素α1有着广泛的应用前景,但由于其基因过短,很难利用基因工程方法实现直接表达,所以目前多是化学合成产品[2],价格比较昂贵,应用的推广受到限制. 为了探索胸腺素α1多聚体的可能的生物学活性及其基因的体外表达,我们利用随机退火与PCR技术相结合的方法构建了胸腺素α1的多串体基因,并成功克隆,从而为进一步研究奠定了基础.     

胸腺素alpha-1的治疗应用研究进展

胸腺素 α1 ( Tα1 )是 Goldstein和 Low及其同事首先从牛胸腺组织 TF5中分离的一种多肽 ,含 2 8个氨基酸 ,分子量 3,1 0 8k D,等电点 4.2 [1 ]。 Tα1 结构保守 ,在各哺育动物中结构一致 ,分布广泛 ,存在于哺育动物各组织器官中 ,尤以胸腺中含量最高。Tα1 的氨基酸序列与原胸腺素 α的 N端 2 8个氨基酸相同。最近 Sarandeses CS等[2 ] 研究发现 ,体内有一种叫溶酶体门冬酰内肽酶的蛋白酶选择性裂解位于前胸腺素原α序列中的门冬酰甘氨酸基序 ,特别是 Asn2 8- Gly2 9和 Asn35 - Gly36,分别产生 Tα1 与Tα2 。这表明 Tα1 是一种正…     

重组胸腺素α1的克隆、表达与纯化

目的利用基因工程方法表达重组胸腺素α1 (Tα1),并进行纯化、鉴定. 方法使用大肠杆菌偏爱密码子,人工合成Ref蛋白(T7噬菌体蛋白)和Tα1的融合基因,并克隆在表达载体pBV220中,转化E.coliDH5α,温度诱导表达,表达的重组蛋白Ref- Tα1经CM-Sepharose FF阳离子柱进行纯化,Western-blot进行鉴定. 结果获得了纯化的重组蛋白Ref-Tα1,相对分子质量约为15 000. 结论用融合基因的方法表达小分子多肽是一种可行的方法,Ref- Tα1的成功表达为进一步研究其生物学活性奠定了基础.     

胸腺素α1二聚体蛋白的克隆、表达、纯化及其生物学活性检测

目的：获得具有生物学活性的重组人胸腺素α1二聚体蛋白.方法：人工合成胸腺素α1二聚体基因,并将该基因克隆入原核表达载体pET-22b（＋）中.转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达重组Tα1②蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测分析以及生物学活性检测.结果：Tα1②Mr约为6.3×10^3,与理论值一致.成功纯化了Tα1②蛋白,该蛋白具有与T1抗体特异性的结合能力并能刺激小鼠T淋巴细胞增殖.结论：成功地克隆、表达和纯化Tα1②蛋白;重组Tα1②具有与化学合成Tα1相同的功能并有更高的生物学活性.     

同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞α1[Ⅰ]及α1[Ⅲ]型胶原mRNA表达的影响

目的 :观察同型半胱氨酸 (Hcy)对血管平滑肌细胞 (VSMCs)胶原合成的影响。方法 :采用体外培养的大鼠 VSMCs,加入不同浓度的 Hcy(0、 0 .1 0、 0 .2 5、 0 .5 0和 1 .0 0 mm ol· L- 1 )作用后 ,通过测定培养基中羟脯氨酸含量和半定量 RT- PCR法检测 Hcy对 VSMCs胶原合成及对 α1 [ ]、 α1 [ ]型胶原 m RNA表达的影响。结果 :Hcy促进 VSMCs胶原合成及 α1 [ ]型、α1 [ ]型胶原 m RNA表达 ,并呈剂量依赖效应。结论 :Hcy促进VSMCs胶原合成 ,可能是通过上调 α1 [ ]、 α1 [ ]型胶原 m RNA表达实现的。     

胸腺素а原的生物学活性及基因表达谱芯片分析

目的 :对一个新的胸腺素α原 (human prothymosinα,Pro Tα)进行生物学活性研究及基因表达谱分析。 方法 :用体外刺激小鼠脾细胞增殖进行实验及 EL ISA法检测 Pro Tα对 IL - 2和 TNF-α的诱导分泌作用 ,并用基因芯片技术对其表达谱进行分析。结果 :Pro Tα对小鼠脾细胞有明显的促进增殖作用 ,对 IL - 2和 TNF-α有明显的诱导分泌作用 (P<0 .0 1)。基因芯片研究发现 Pro Tα对蛋白酪氨酸磷酸酶基因、淋巴细胞抗原 6复合体、增殖相关基因 A等的表达有上调作用。 结论 :该新型Pro Tα在体外实验中有免疫调节活性 ,并诱导一些基因的表达。     

肿瘤坏死因子α及其基因多态性与胰岛素抵抗

胰岛素抵抗 ( IR)是机体对一定量的胰岛素的生物学反应低于预计正常水平的一种现象 ,是 2型糖尿病发病的病理生理机制之一 ,多种疾病均存在胰岛素抵抗 ,如高血压、肥胖等。近来研究发现肿瘤坏死因子α( TNF-α)及其基因多态性与胰岛素抵抗的发生密切相关。1　 TNF-α的来源及其生物学活性TNF- α最早于 1 985年从巨噬细胞中分离出来 ,是由 3个同源亚单位组成的多聚体 ,编码 TNF-α的基因位于主要组织相容性复合体 ( MHC )基因区。 TNF-α主要由单核 -巨噬细胞产生 ,中性粒细胞、自然杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、脂肪细胞等均可分泌 TNF- α。生理状态下 TNF- α主要参与机体的防御反应 ,是重要的免疫调节因子和促炎症因子 ,介导细胞凋亡、肿瘤细胞坏死 ,刺激胸腺细胞生长 ,刺激其他细胞因子 (如单核粒细胞集落刺激因子 ,白细胞介素 - 1 )的生成。病理状态下参与败血症性休克、发热、类风湿性关节炎、恶病质等多种过程[1-2 ] 。 TNF-α通过细胞膜上的受体发挥作用 ,TNF- α受体包括两种 ,TNF- R1 (啮齿类动物为P5 5 ,人类为 P60 )和 TNF- R...     

脑出血后出血灶周围炎性细胞因子的表达

0　引言　炎性反应在缺血性脑血管病中的作用已有较多文献报道 [1 ,2 ] ,但脑出血后的相关研究则很少 .为了提高脑出血的治愈率 ,明确脑出血的病理生理机制 ,我们用免疫组化方法对脑出血后不同时间出血灶周围的炎性反应 ,以及炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素 - 1β(IL - 1β)和 6(IL- 6 )在脑出血后 2 4h出血灶周围的表达进行研究 .1　材料和方法1.1　材料　正常雄性 SD大鼠 8只 ,体质量 2 30～ 2 5 0 g,由第四军医大学实验动物中心提供 .图 1　脑出血后病灶周围的 TNF- α免疫阳性表达Fig1　 Expression of TNF- α…     

质粒pCI-S-IRES-ProTα的构建及其体外表达

目的探讨DNA疫苗pCI-S-IRES-ProTα的构建及体外表达.方法选择编码乙肝表面抗原S基因片段、内核糖体进入位点(intemal ribosome entry site,IRES)片段和胸腺素α原(prothymosin α,ProTα)基因片段,利用基因重组技术构建成DNA质粒pCI-S-IRES-ProTα,并将该DNA质粒转染成纤维细胞NIH3T3.结果不仅可通过RT-PCR检测到其RNA的表达,而且ELISA也检测到其抗原表达.结论构建的质粒可作为DNA疫苗,进一步用于免疫动物.     

日达仙联合放化疗治疗非小细胞肺癌疗效分析

胸腺在人体免疫功能的产生和维持中起着重要作用。日达仙(胸腺素α1,Tα1)是从胸腺素第5组分(TF5)中纯化的28肽物质,也是生物学活性和作用机制研究得最为清楚的组分。日达仙联合化疗有     

干扰素γ和肿瘤坏死因子α对乙型肝炎病毒转录后调节序列功能的影响

目的　探讨干扰素γ(IFN γ)和肿瘤坏死因子α(TNF α)对乙型肝炎病毒转录后调节机制的影响。方法　在体外构建含有乙型肝炎病毒转录后调节序列 (HPRE)片段的pDM1 38质粒 (含有CAT报告基因 ) ,应用脂质体介导方法转染HepG2 细胞 ,观察IFN γ和TNF α对重组质粒载体CAT报告基因活性表达的影响 ,CAT基因活性的检测采用ELISA检测试剂盒。结果　成功构建了含有HPRE片段的重组质粒载体。转染重组质粒的HepG2 细胞CAT基因活性表达明显增强 ,而转染空载体的HepG2 细胞仅有本底表达 ,分别为 896pg ml± 2 1 4pg ml和 37pg ml± 1 1pg ml。IFN γ和TNF α对转染重组质粒的HepG2 细胞CAT活性表达的影响均具有浓度依赖性 ,而对空载体CAT活性的表达无影响。转染重组质粒的HepG2 细胞在未加入细胞因子时 ,其CAT表达活性为 896pg ml± 2 1 4pg ml;与IFN γ、TNF α及IFN γ +TNF α孵育后 ,其CAT表达活性分别为 32 4pg ml± 57pg ml,396pg ml± 82pg ml,1 75pg ml± 36pg ml,与未加入时比较 ,t=5 1 9,4 39,6 68,P <0 0 1 ,差异有显著意义。结论　IFN γ和TNF α可能通过抑制HPRE的功能 ,调控乙型肝炎病毒基因的表达     

重组胸腺素α1的克隆、表达与纯化

目的 利用基因工程方法表达胸腺素α1（thymosin alpha 1,Tα1）的串联体并进行纯化、鉴定。方法 将Tα1的基因拆发为4个片段进行合成,退火后经PCR获得串联体基因,测序正确后克隆在硫氧还蛋白（thioredoxin)融合蛋白表达载体pThioHisA中,转化大肠杆菌TOP10菌株,IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经过80℃热处理及阴离子交换柱Q－Sepharose Fast Flow进行纯化,Western-blot进行鉴定。结果 获得了纯化的Thioredoxin-Tα1③,分子质量约为31ku。结论 用基因串联思路表达小分子多肽是一种可行的方法,Tα1③的成功表达为检测其生物学活性奠定了基础。     

人胸腺素β_4基因对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 研究胸腺素β4基因对人肾小管上皮细胞株(HKC)上皮-肌成纤维细胞转分化(EMT)的影响.方法 采用 RT-PCR和 T-A克隆技术,从SW480细胞中扩增胸腺素β4基因全长 cDNA,克隆到T载体中,再亚克隆到 pIRES2-EGFP质粒载体,得到表达胸腺素β4基因的真核表达载体和阴性对照载体,转染HKC,得到胸腺素β4表达增强的HKC-Tβ4和胸腺素β4表达未受影响的HKC-EGFP.分别采用RT-PCR和Western blot检测HKC、HKC-Tβ4和HKC-EGFP 3组细胞胸腺素β4、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏素表达.结果 与HKC组及HKC-EGFP组相比,HKC-Tβ4组胸腺素β4和α-SMA表达显著增高,E-钙黏素表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.01).结论 胸腺素β4基因转染能诱导HKC发生EMT,提示胸腺素β4是诱导EMT的重要分子,可能成为肾纤维化治疗的靶目标.     

胃癌中E-cadherin/catenins复合物的表达

目的:克隆人胸腺素原α cDNA并在大肠杆菌系统内表达.方法:利用RT-PCR技术从健康男性外周血PBMC中扩增胸腺素原α cDNA,纯化后用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切PCR产物,然后将该基因插入经同样双酶切的原核表达载体PBV220中,在PLPR启动子控制下,热诱导天然表达胸腺素原α,表达产物部分纯化后利用淋巴细胞玫瑰花结实验进行了初步的活性测定.结果:凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为300 bp左右,重组质粒测序结果表明,插入片段与人胸腺素原α的序列完全一致,DE3重组菌在热诱导下高效表达相对分子质量为12 000的蛋白,该蛋白能提高淋巴细胞玫瑰花结形成率,表明具有一定活性.结论:成功克隆人胸腺素原α基因并在大肠杆菌中得到表达.     

期刊文摘

过氧化物酶体增殖物激活受体对小鼠原代肝细胞即时反应基因和细胞周期蛋白D1表达的影响[陈德烽,张万广,陈孝平.中华实验外科杂志,2005,22(8):910~912]为探讨转染小鼠pSG5-过氧化物酶体增殖物激活受体α(pSG5-mPPARα)质粒对小鼠原代肝细胞细胞周期调节基因表达的影响,在小鼠原代肝细胞培养中转染pSG5-mPPARα质粒及加入PPARα配体(WY-14643)后,检测即时反应基因(IEG)如fos癌基因(c-fos)、jun癌基因(c-jun)和早期生长反应基因-1(EGR-1),细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达的变化。发现EGR-1基因表达在小鼠原代肝细胞培养中转染pSG5…     

人α防御素的稳定表达和活性鉴定

目的: 制备有较高生物学活性的分泌型人α防御素1与α防御素3,并初步鉴定其抗菌活性;方法: 将真核表达质粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO-HNP1,3与含有dhfr基因的质粒pDCH1P11共转染入CHO-dhfr-,ELISA检测到培养上清中重组蛋白的表达,对阳性表达的细胞进行G418筛选,对其中9个表达量较高的阳性克隆进行氨甲喋呤(MTX)加压扩增, ELISA法、RT-PCR法及间接免疫荧光(IFA)分析蛋白表达情况,并同步测定其体外抗菌活性.结果: α防御素1的表达量是18.85～47.46 mg/L*48 h*106个细胞; α防御素3的表达量是16.89～35.57 mg/L*48h*106 个细胞.用RT-PCR从稳定表达的细胞株中扩增出全长约303 bp的片段;IFA 显示稳定转染的细胞胞质核周质中有强的绿色荧光;K-B纸片琼脂扩散法显示α防御素1,3在大肠埃希菌MH平板上形成了明显的抑菌圈.结论: 成功高效地表达了分泌型的α防御素1,3,并具有良好的生物学活性,为进一步探讨α防御素1,3对HIV-1的抑制作用提供了物质基础.     

bFGF对大鼠成骨细胞膜integrin α2、α5、β1 mRNA表达的调控作用

目的 探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养大鼠成骨细胞膜上整合索(integrin)亚基mRNA表达的影响.方法 用含不同浓度bFGF F12培养基对大鼠成骨细胞进行24 h预孵后,接种于喷砂处理的钛片上,第3 d收集成骨细胞,利用实时荧光定量RT-PCR的方法检测成骨细胞膜上integrin α2、α5、β1mRNA的表达.结果 体外培养的大鼠成骨细胞膜上integrinβ1mRNA表达水平最高,其次为integrin α2,integrinα5相对最低.bFGF能不同程度有效上调成骨细胞integrin α2、α5、β1mRNA的表达,但促进integrin α2,α5、β1mRNA表达的bFGF的有效浓度范围不同.结论 bFGF能促进大鼠成骨细胞膜上integrin α2、α5、β1mRNA的表达.     

HIF-1α基因慢病毒载体的构建和鉴定

[目的]构建带有大鼠HIF-1α基因的慢病毒表达载体,并进行病毒颗粒的包装与对293T的转染.[方法]从pEGFP-N1-HIF-1α载体中扩增出HIF-1α基因片段,将目的基因与pLenti6.3-MCS-RES2-EGFP载体连接,获得慢病毒表达载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,并用磷酸钙转染法将其与慢病毒包装系统共同转染到293T细胞内进行病毒包装,48h后收集上清液并过滤,按不同感染复数感染293T细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达来测定病毒滴度和感染效率.[结果]构建了共表达HIF-1α基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,经PCR及测序结果证实,并对其成功包装出慢病毒,病毒滴度为4×106TU/ml.[结论]成功构建出HIF-1α基因重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP并能有效的包装出慢病毒.     

逆转录病毒介导人肿瘤坏死因子-α基因抑制胆管癌细胞的生长

[目的 ]研究逆转录病毒介导的人肿瘤坏死因子α(TNFα)基因转染对人胆管癌细胞生长的抑制作用。 [方法 ]构建逆转录病毒 -TNFα(pLNCX -TNFα)复合体 ,转染人胆管癌细胞得到稳定表达 ,通过聚合酶链式反应 (PCR)、流式细胞仪 (FCM )、免疫组织化学等方法检测基因表达、细胞生长增殖和细胞凋亡等情况。 [结果 ]pLNCX -TNFα基因转染人胆管癌细胞后 ,pLNCX空质粒转染组、pLNCX -TNFα基因转染组的细胞均能扩增出 70 8bp的基因片断 ,而未转染组则无 ;pLNCX -TNFα基因转染组的细胞克隆抑制率为 6 4% ,与对照组和 pLNCX空质粒转染组相比 ,差异性非常显著 (P <0 .0 1 ) ;转染的人胆管癌细胞G1期比例从 2 9.0 7%增加到 5 4.2 4 % ,G2 -M期和S期比例分别从 5 2 .0 3%下降到 2 .0 2 % ,1 8.32 %下降到 1 0 .34% ;凋亡细胞数从 5 .83%增加到34.76 %。[结论 ]TNFα基因通过诱导胆管癌细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞抑制胆管癌细胞的生长。     

直肠癌患者IL-2、IL-6、IL-8、TGF-α表达变化及临床意义

目的　研究IL 2、IL 6、IL 8、TGF α表达与直肠癌生物学行为关系及临床意义。方法　用ELISA法检测直肠癌患者血清IL 2、IL 6、IL 8的蛋白浓度 ,用免疫组织化学方法检测直肠癌患者TGF αmRNA表达。结果　直肠癌患者TGF α阳性率为5 3.1 %。原发灶中IL 6、IL 8、TGF α的表达随癌组织浸润肠壁深度呈升高趋势 ,且差异显著 (P <0 .0 5 )。有远处转移者IL 6、IL 8、TGF α表达显著高于无远处者 (P <0 .0 5 )。IL 6、IL 8、TGF α表达水平随Dukes’A～D分期而呈显著升高 (P <0 .0 5 )。而IL 2表达则完全相反。结论　IL 2、IL 6、IL 8、TGF α共同参与了直肠癌肿瘤的发生、发展 ,并与直肠癌的生物学行为有关