Ch1/2对肿瘤细胞凋亡的调节作用

目的:观察顺铂作用下K562细胞及白血病骨髓单个核细胞(BMMNC)的细胞周期变化和转染Chk1／2反义寡核 苷酸对顺铂诱导下K562细胞及白血病BMMNC凋亡的影响。方法:用流式细胞仪检测顺铂作用下。K562细胞及白血病 BMMNC的细胞周期变化。转染Chk1和Chk2反义寡核苷酸于K562细胞及白血病BMMNC,检测顺铂作用下转染细胞的凋亡 率。结果:10μmol／L顺铂作用下K562细胞和白血病BMMNC均出现S期阻滞,转染Chk1／2反义寡核苷酸可明显增加顺铂 诱导下K562细胞凋亡,转染Chk1反义寡核苷酸可明显增加顺铂诱导下白血病BMMNC的凋亡率,但转染Chk2反义寡核苷酸 未增加白血病BMMNC的凋亡率。结论:Chk1在肿瘤细胞凋亡中有重要调节作用,可作为肿瘤增敏治疗的有效靶点,Chk2在 肿瘤细胞凋亡中的作用需进一步研究。     

苦参碱诱导K562白血病细胞分化和凋亡的实验研究

目的：研究苦参碱的抗肿瘤作用。方法：以人红白血病细胞株Ｋ５６２为研究对象,通过形态学观察和细胞化学染色了解不同浓度的苦参碱对肿瘤细胞的诱导分化作用。并利用程序性细胞死亡检测试剂盒检测肿瘤细胞凋亡的情况。结果：０．１ｇ／Ｌ苦参碱能够诱导Ｋ５６２白血病细胞分化,形态学上类似中幼红和晚幼红细胞,联苯胺染色阳性率由１％￣２％上升至７％,细胞化学染色显示糖原由阴性转为强阳性且阳性率为１００％;１．０ｇ／Ｌ苦     

微波和足叶乙甙诱导K562细胞的凋亡

目的：探讨微波和足叶乙甙体外诱导Ｋ５６２细胞凋亡和可能性及其机制。方法：将微波和足叶乙甙分别单位以及联合作用于正常骨髓细胞和Ｋ５６２细胞株,通过细胞凋亡率和ｂｃｌ－２和ｐ２１＾ｒａｓ蛋白阳性率的测定来评价细胞凋亡的程度并研究其机制。结果：微波和足叶乙甙各自都能诱导正常骨髓细胞和Ｋ５６２细胞的少量凋亡,两者联合作用所诱导的细胞凋亡率较之于足叶乙甙有显著性增加（Ｐ〈０．０５）,其中Ｋ５６２细胞凋亡率的     

反义ras基因增强足叶乙甙对白血病K562细胞的诱导凋亡作用

目的 研究ras p21蛋白在bcr-abl p210蛋白抗凋亡信号传导通路中的作用。方法 应用逆转录病毒载体pLXSN将反义N－ras1 cDNA转导到K562细胞系中后，通过足叶乙甙对细胞进行诱导凋亡。结果 转导反义N－ras1 cDNA的K562细胞内N－ras p21表达下降。反义N－ras转民细胞较对照细胞K562易发生凋亡，对药物的敏感性显著增高。结论 ras p21蛋白是bcr-abl p210蛋白介导抗凋亡信号的重要的下游蛋白，阻断该蛋白的功能有可能成为治疗人类慢性髓性白血病的1个选择点。     

榄香烯诱导K562细胞凋亡的流式细胞术分析

应用流式细胞分析技术检测了榄香烯作用前后人白血病Ｋ５６２细胞凋亡峰的出现，细胞凋亡百分率、癌基因ｂｃｌ－２蛋白的表达等指标。     

超声体外诱导白血病细胞K562凋亡的研究

 目的 研究超声对诱导白血病细胞K562凋亡的作用,为超声治疗的临床应用提供实验依据。方法 以人慢性粒细胞白血病急变细胞株K562为研究对象,用频率为1.8 MHz的超声波辐照白血病细胞K562,用光学显微镜观察凋亡细胞形态学改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 超声辐照K562细胞后24 h,8 mV×5 min组及8 mV×10 min组细胞凋亡率分别为2.3 %和8.28 %;10 mV×5 min及10 mV×10 min组细胞凋亡率分别为9.36 %和21.46 %。电压为7mV时,超声辐照K562细胞后0.5 h,1 h,3 h,5 h细胞凋亡率分别为1.9 %,3.6 %,5.7 %,7.7 %。同时光学显微镜下可见凋亡小体形成等典型形态学改变。结论 超声可以诱导白血病K562细胞凋亡。     

氧化砷对K562细胞增殖和凋亡的作用及其机制的初步研究

目的：研究氧化砷（Ａｓ２Ｏ３）对Ｋ５６２细胞增殖和凋亡的作用及其机制。方法：以细胞形态、细胞生长及活力测定,流式细胞仪分析细胞周期相关ＤＮＡ含量并以基因组ＤＮＡ电泳等方面观察Ａｓ２Ｏ３对Ｋ５６２细胞的作用,要用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法就其作用机制进行初步探索。结果：在Ａｓ２Ｏ３作用下Ｋ５６２细胞生长受抑伴随活力下降;基因组ＤＮＡ电泳出现”梯“状条带流式细胞仪检测出”凋亡峰“。实验进一步表明Ａｓ２Ｏ３可降低该细胞ｂｃｒ／ａｂｌ融合蛋白的含量,但不影响ＣＭＬ特异性ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因的ｍＲＮＡ水平。结论：Ａｓ２Ｏ３有抑制Ｋ５６２细胞增殖和诱导该细胞凋亡的作用。初步研究结果表明,Ａｓ２Ｏ３导致ｂｃｒ／ａｂｌ融合蛋白降低,可能参与了作用机制。     

脂质体转染survivin反义寡核苷酸对K562细胞增殖及凋亡的作用

目的:观察脂质体转染survivin反义寡核苷酸(ASODN)对白血病细胞K562的增殖及凋亡的影响。方法:人工合成survivin硫代ASODN,通过脂质体转染K562细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学变化;用MTT法观察转染前后对细胞增生的影响;用细胞凋亡检测法(POD)观察细胞凋亡;RT-PCR检测survivin mRNA的表达。结果:(1)survivin ASODN抑制K562细胞增殖呈时间和剂量依赖性;(2)survivin ASODN可诱导K562细胞的凋亡,凋亡指数呈浓度依赖性;(3)survivinASODN处理组K562细胞survivin mRNA的表达水平显著下降。结论:脂质体转染survivin ASODN能够明显抑制K562细胞增殖,且能诱导细胞凋亡。survivin可能成为肿瘤基因治疗的一个新靶点。     

梁金菇多糖对K562细胞凋亡及相关分子表达的影响

目的 研究梁金菇多糖（ABPS）对人白血病细胞K562凋亡的影响及其机制。方法 应用荧光显微镜观察凋亡细胞形态。应用流式细胞仪检测ABPS对K562细胞周期的改变及凋亡的影响。应用Western blot检测bcl-6及增殖细胞核抗原（PC-NA）的表达情况。结果 荧光显微镜下观察到K562细胞核碎裂，核溶解和凋亡小体形成等典型的凋亡形态学变化。DNA凝胶电泳观察到“阶梯状”条带，用药5天后，G1期细胞数明显增多，占54.5%,42.0%的细胞发生凋亡。bcl-6表达水平升高，PCNA表达水平下降。结论 ABPS能诱导K562细胞发生凋亡，其机制可能与PCNA表达水平下降，bcl-6表达水平升高有关。     

As2S2诱导K562细胞凋亡的分子机制初步研究

目的　探索As2 S2 对K5 6 2细胞的诱导凋亡作用及其机制。方法　细胞凋亡的检测用流式细胞分析、基因组DNA电泳、细胞形态学观察等方法 ,Westernblot方法用于蛋白表达的检测 ,基因表达的变化用半定量RT PCR方法。结果　 3～ 5 μmol L的As2 S2 作用 4 8～ 72h即可诱导K5 6 2细胞凋亡。 3μmol LAs2 S2 作用 72h时 ,细胞凋亡率达 (34.4± 3.3) % ;5 μmol LAs2 S2 作用 4 8,72h时 ,细胞凋亡率分别为 (2 1.8± 3.6 ) %和 (4 6 .0± 5 .2 ) %。 5 μmol LAs2 S2 作用下 ,As2 S2 可降低Bcr Abl和JAK2的蛋白含量。As2 S2 从基因水平上调bax表达 ,下调c myc表达。As2 S2 作用后 ,Caspase 3被激活。As2 S2 也能诱导慢性粒细胞性白血病 (CML)患者单个核细胞凋亡。结论　As2 S2 可诱导CML细胞凋亡 ,Bcr Abl含量的降低可能起了很重要的作用。bax表达的增加、c myc表达的减少、JAK2蛋白含量的降低以及Caspase 3激活也可能参与了该细胞凋亡机制。     

Chk1/2和Plk1蛋白在子宫内膜癌中的表达

目的 Chk1/2（checkpoint kinase 1、2）和Plk1（polo like kinase 1）是各细胞周期检测点启动DNA损伤修复的主要激酶,本研究检测3种激酶在子宫内膜癌及正常子宫内膜组织中的表达,探讨3种蛋白在两者之间的表达差异、与子宫内膜癌临床病理特征的关系及3种蛋白表达的相关性。方法 应用免疫组化SP法检测44例子宫内膜癌组织和21例正常子宫内膜组织中Chk1、Chk2和Plk1蛋白的表达情况。结果 Chk1、Chk2和Plk1蛋白在子宫内膜癌患者中的阳性率分别为47.7％、75.0％和31.8％,在正常子宫内膜中的阳性率分别为61.9％、61.9％和4.8％;Plk1蛋白在子宫内膜癌组织中的表达显著高于正常子宫内膜组织（P＜0.01）,而Chk1、Chk2的表达差异无统计学意义（P>0.05）。Chk1、Chk2和Plk1蛋白的表达在不同年龄、病理类型和临床分期的子宫内膜癌患者中差异无统计学意义（P>0.05）;但Chk1的表达在不同分化程度的子宫内膜癌患者中差异有统计学意义（P<0.01）。Spearman等级相关分析,在44例子宫内膜癌患者中,Chk2与Plk1间的表达呈正相关（r＝0.482,P＝0.001）。结论 Plk1可能成为子宫内膜癌比较理想的治疗靶点,而CHK1/2在子宫内膜癌中表达及意义还有待进一步研究。     

Chk1/2和Plk1蛋白在宫颈良恶性病变组织中的表达及其意义

背景与目的：Chk1/2（checkpoint kinase 1/2）和Plk1（polo-like kinase 1）是各细胞周期检测点启动DNA损伤修复的主要激酶.本研究主要探讨3种激酶蛋白在宫颈良恶性病变中的表达差异、与宫颈癌临床病理特征的关系及3种激酶在宫颈癌组织中表达之间的相互关系.方法：应用免疫组化SP法检测43例宫颈癌组织和20例慢性宫颈炎性组织中Chk1、Chk2和Plk1蛋白的表达情况.结果：Chk1、Chk2和Plk1蛋白在宫颈癌患者中的阳性率分别为76.7%、60.5%和32.6%,在慢性宫颈炎患者中的阳性率分别为30.0%、35.0%和0;Chkl和Plk1蛋白在宫颈癌组织中的表达显著高于慢性宫颈炎组织（P＜0.01）,而Chk2的表达差异无显著性（P＞0.05）.Chk1、Chk2和Plk1蛋白的表达在不同年龄、病理类型和临床分期的宫颈癌患者中差异无显著性（P＞0.05）;但Chk1和Plkl的表达在不同分化程度的宫颈癌患者中差异有显著性（P＜0.05）.Spearman等级相关分析,在43例宫颈癌患者中,Chk1与Chk2的表达呈正相关（r=0.492,P=0.001）.结论：Chk1和Plk1可能成为比较理想的宫颈癌治疗靶点.     

下调Chk1和Chk2基因促进射线照射后HeLa细胞凋亡

目的 探讨下调Chk1和Chk2基因对HeLa细胞射线照射后细胞周期和凋亡的影响及其作用机制.方法 应用流式细胞仪检测不同剂量60Co照射引起的HeLa细胞周期和凋亡的动力学变化,以激光共聚焦显微镜和Western blot法检测转染Chk1和Chk2正义寡核苷酸(sODN)和反义寡核苷酸(AsODN)对Chk1和Chk2蛋白表达的影响,以AnnexinV-PI法、凋亡细胞的周期特异性检测法及透射电镜观察单独或联合转染Chk1和Chk2反义寡核苷酸对射线照射后HeLa细胞凋亡的影响.结果 不同剂量的60Co照射可引起Hela细胞小同程度的G2/M期阻滞,15 Gy的60Co照射48 h后,G2/M期细胞可达75.53%±3.72%.当细胞周期阻滞解除后,细胞凋亡明显增加.转染Chk1 AsODN组的早期凋亡、晚期凋亡和死亡细胞共有94.42%±4.78%,明显高于转染Chk1 sODN组(44.35%±2.08%,P<0.0001);转染Chk2 AsODN组的凋亡细胞共有93.08%±5.24%,明显高于转染Chk2 sODN组(48.98%±3.35%,P<0.0001);而共转染Chk1和Chk2 AsODN组的凋亡细胞共有94.26%±4.92%,明显高于共转染Chk1和Chk2 sODN组(42.46%±2.56%,P<0.0001);共转染Chk1和Chk2AsODN组与仅转染Chk1 AsODN或Chk2 AsODN组比较,差异无统计学意义(P>0.05).凋亡细胞的周期特异性检测结果显示,转染Chk1和Chk2 sODN引起的凋亡主要来自于G1期细胞,而转染Chk1 AsODN或Chk2 AsODN后,G1期、S期、G2/M期的凋亡细胞均较对应sODN转染组明显增加,尤其共转染Chk1和Chk2 AsODN组更为显著.结论 射线照射激活细胞周期检测点信号传导通路引起细胞自我保护,是临床上产生放疗抵抗的主要原因,而阻断该信号通路的关键激酶Chk1或Chk2,可显著增强细胞的放射敏感性,其机制在于改变了凋亡细胞的周期特异性,凋亡细胞可以来自G1、S、G2/M各周期的细胞.     

Mangrove dolabrane‐type of diterpenes tagalsins suppresses tumor growth via ROS‐mediated apoptosis and ATM/ATR–Chk1/Chk2‐regulated cell cycle arrest

Natural compounds are an important source for drug development. With an increasing cancer rate worldwide there is an urgent quest for new anti‐cancer drugs. In this study, we show that a group of dolabrane‐type of diterpenes, collectively named tagalsins, isolated from the Chinese mangrove genus Ceriops has potent cytotoxicity on a panel of hematologic cancer cells. Investigation of the molecular mechanisms by which tagalsins kill malignant cells revealed that it induces a ROS‐mediated damage of DNA. This event leads to apoptosis induction and blockage of cell cycle progression at S‐G2 phase via activation of the ATM/ATR—Chk1/Chk2 check point pathway. We further show that tagalsins suppress growth of human T‐cell leukemia xenografts in vivo. Tagalsins show only minor toxicity on healthy cells and are well tolerated by mice. Our study shows a therapeutic potential of tagalsins for the treatment of hematologic malignancies and a new source of anticancer drugs.     

DNA damage-induced S and G2/M cell cycle arrest requires mTORC2-dependent regulation of Chk1

mTOR signalling is commonly dysregulated in cancer. Concordantly, mTOR inhibitors have demonstrated efficacy in a subset of tumors and are in clinical trials as combination therapies. Although mTOR is associated with promoting cell survival after DNA damage, the exact mechanisms are not well understood. Moreover, since mTOR exists as two complexes, mTORC1 and mTORC2, the role of mTORC2 in cancer and in the DNA damage response is less well explored. Here, we report that mTOR protein levels and kinase activity are transiently increased by DNA damage in an ATM and ATR-dependent manner. We show that inactivation of mTOR with siRNA or pharmacological inhibition of mTORC1/2 kinase prevents etoposide-induced S and G2/M cell cycle arrest. Further results show that Chk1, a key regulator of the cell cycle arrest, is important for this since ablation of mTOR prevents DNA damage-induced Chk1 phosphorylation and decreases Chk1 protein production. Furthermore, mTORC2 was essential and mTORC1 dispensable, for this role. Importantly, we show that mTORC1/2 inhibition sensitizes breast cancer cells to chemotherapy. Taken together, these results suggest that breast cancer cells may rely on mTORC2-Chk1 pathway for survival and provide evidence that mTOR kinase inhibitors may overcome resistance to DNA-damage based therapies in breast cancer.     

Chk1蛋白激酶及其抑制剂的研究进展

Chk1(checkpoint kinase 1,Chk1)属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员,在DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）中是细胞周期检测点的核心蛋白。很多研究表明,Chk1蛋白激酶具有促进肿瘤细胞增生的功能,它的缺乏能使肿瘤细胞对放疗或化疗更加敏感,且其抑制剂与其它分子靶向药物联合应用具有“合成致死”的效应,因此Chk1可作为今后肿瘤治疗的新靶点。本文就Chk1蛋白激酶及其在肿瘤治疗中的作用作一综述。     

The natural anticancer compound rocaglamide selectively inhibits the G1‐S‐phase transition in cancer cells through the ATM/ATR‐mediated Chk1/2 cell cycle checkpoints

Targeting the cancer cell cycle machinery is an important strategy for cancer treatment. Cdc25A is an essential regulator of cycle progression and checkpoint response. Over‐expression of Cdc25A occurs often in human cancers. In this study, we show that Rocaglamide‐A (Roc‐A), a natural anticancer compound isolated from the medicinal plant Aglaia, induces a rapid phosphorylation of Cdc25A and its subsequent degradation and, thereby, blocks cell cycle progression of tumor cells at the G1‐S phase. Roc‐A has previously been shown to inhibit tumor proliferation by blocking protein synthesis. In this study, we demonstrate that besides the translation inhibition Roc‐A can induce a rapid degradation of Cdc25A by activation of the ATM/ATR‐Chk1/Chk2 checkpoint pathway. However, Roc‐A has no influence on cell cycle progression in proliferating normal T lymphocytes. Investigation of the molecular basis of tumor selectivity of Roc‐A by a time‐resolved microarray analysis of leukemic vs. proliferating normal T lymphocytes revealed that Roc‐A activates different sets of genes in tumor cells compared with normal cells. In particular, Roc‐A selectively stimulates a set of genes responsive to DNA replication stress in leukemic but not in normal T lymphocytes. These findings further support the development of Rocaglamide for antitumor therapy.     

ERK1/2-Sp1信号通路对肺癌细胞VEGF的调控作用

背景与目的:了解ERK1/2-Sp1信号通路对肺癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)基因的调控作用.材料与方法:采用激酶特异抑制剂PD98059抑制ERK1/2的活性,Western blot检测ERK1/2的表达.RNA干扰技术沉默Sp1基因,Mercury信号通路系统检测Sp1的转录活性.RT-PCR检测VEGF和Sp1基因的变化. 结果:ERK1/2激酶的活性几乎可被150μmol/L PD98059完全抑制,ERK1/2激酶活性下调伴随VEGF的表达下降.PD98059下调Sp1转录因子的活性.Sp1基因沉默后VEGF的表达量下调. 结论:在肺癌细胞中存在ERK1/2-Sp1-VEGF信号通路,ERK1/2激酶调控VEGF的表达可能部分依赖于转录因子Sp1的活性.     

沉默Chk1基因对姜黄素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡敏感度的影响

目的探讨siRNA沉默Chk1基因表达对姜黄素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡和细胞周期的影响,评价其作为姜黄素治疗胃癌增敏靶点的有效性。方法采用RNAi技术在胃癌细胞SG-7901中将Chk1基因沉默,采用Western blot检测转染前后Chk1蛋白表达的变化,采用流式细胞术检测Chk1基因沉默对姜黄素诱导胃癌细胞凋亡及细胞周期变化的影响。结果转染Chk1 siRNA后,胃癌细胞SGC7901中Chk1蛋白表达受抑制,明显低于对照组(P＜0.05)。FCM检测结果显示,si-Chk1组较空白对照组G₂/M期百分比有所降低(P＜0.05),si-Chk1+Curcumin组G₂/M期比例明显低于Empty vector+Curcumin组(P＜0.05)。siRNA沉默Chk1基因使姜黄素诱导的细胞凋亡率由(14.7±1.1)%上升到(28.9±1.8)%。结论siRNA沉默Chk1基因可明显消除G₂/M期阻滞,并显著增强姜黄素诱导胃癌细胞SGC-7901凋亡的敏感度,提示Chk1可作为姜黄素治疗胃癌的有效增敏靶点。