复方芩兰口服液调控流感病毒感染致重症肺炎动物模型免疫功能的机制研究

目的:探究复方芩兰口服液通过NF-κB通路对流感病毒感染致重症肺炎(severe pneumonia,SP)动物模型免疫功能的调控机制.方法:将60只小鼠分为对照组、模型组和观察组,其中模型组和观察组制备流感病毒感染的SP模型,在滴入H1N1第二天观察组使用复方芩兰口服液灌胃.HE染色ELISA检测肺组织损伤和炎性因子[白细胞介素1β(interlenkin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interlenkin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)],流式细胞术检测T辅助细胞17(T helper cells 17,Th17)和调节T细胞(regulatory T cells,Treg),qPCR和Western blot检测淋巴细胞中NFκB通路水平.结果:模型组及观察组肺指数、IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著高于对照组(P<0.05),且观察组以上指标水平显著低于模型组(P<0.05).模型组的Th17和Th17/Treg显著高于对照组而Treg显著低于对照组(P<0.05);观察组的Th17和Th17/Treg显著低于模型组而Treg显著高于模型组(P<0.05).与对照组比较,模型组及观察组的RORγt mRNA,NF-κB、RelB mRNA及蛋白水平均高于对照组(P<0.05),FOXP3 mRNA水平低于对照组(P<0.05);且观察组的RORγt、NF-κB、RelB mRNA及蛋白水平显著低于模型组(P<0.05),FOXP3 mRNA水平高于模型组(P<0.05).结论:复方芩兰口服液可以通过抑制NF-κB通路诱导Treg而抑制Th17,从而调节免疫炎性反应,缓解由流感病毒引起的SP.     

养阴方对HSP65攻击下ApoE~(-/-)小鼠Th17、Treg细胞失衡的作用研究

目的考察在热休克蛋白(HSP)65攻击下养阴方对载脂蛋白E敲除(ApoE~(-/-))小鼠动脉粥样硬化(AS)的病变及辅助性T细胞17(Th17)、调节性T细胞(Treg)的影响及可能机制。方法将ApoE~(-/-)小鼠分别饲喂普通和高脂饲料,并分别sc无菌PBS或HSP65,以辛伐他汀为阳性药,研究养阴方对AS模型小鼠血脂、斑块、Th17细胞与Treg细胞比例(Th17/Treg)及相关炎症指标的影响。给药方式皆为ig给药,并以等体积生理盐水做对照。采用酯酶法检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)水平;油红O染色法测定主动脉斑块面积;流式细胞术测定抗凝血中IL-17A~+CD4~+Th17及Foxp3~+CD25~+CD4~+Treg细胞数量;ELISA法测定血清白细胞介素-6(IL-6)、IL-17、IL-2、转化生长因子-β(TGF-β)、IL-10水平;实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法测定脾脏中Stat3、Stat5a、Foxp3和主动脉中Stat3、Stat5a mRNA表达;Western blotting法测定脾脏中磷酸化STAT3(pSTAT3)、磷酸化STAT5(pSTAT5)、FOXP3和主动脉中pSTAT3蛋白表达。结果养阴方使小鼠血清TC、TG、LDL水平显著降低(P0.01),HDL显著升高(P0.05);主动脉斑块面积明显减小(P0.01);外周血IL-17A~+CD4~+Th17细胞显著减少(P0.05),Foxp3~+CD25~+CD4~+Treg显著增加(P0.05),Th17/Treg值大幅下降(P0.01);血清IL-6水平显著下降(P0.05),IL-2(P0.01)、TGF-β(P0.05)、IL-10(P0.05)水平显著升高;脾脏pSTAT3蛋白水平下降(P0.01),pSTAT5(P0.01)和FOXP3(P0.05)蛋白水平上升;主动脉Stat3 mRNA(P0.01)和pSTAT3蛋白(P0.05)水平下降。结论养阴方能够改善HSP65攻击下ApoE~(-/-)小鼠的高脂血症及AS,同时调节外周血中Th17/Treg的平衡和炎症因子的分泌从而改善炎症。养阴方对Th17、Treg的效应可能与减弱的IL-6/pSTAT3和增强的IL-2/pSTAT5信号有关。     

补元汤干预COPD大鼠Th17细胞分化及其相关炎症因子分泌的影响

目的 观察补元汤对COPD模型大鼠T细胞辅助细胞17(Th17)及相关细胞因子之间的影响。方法 将36只SD大鼠随机分为对照组,模型组,补元汤低、中、高剂量组,氨茶碱组,每组6只。使用烟熏联合气道内滴注脂多糖(LPS)建立COPD大鼠模型,造模4周后开始药物干预,连续给药4周。分别于末次烟熏及末次给药后检测大鼠肺功能：TV、PEF、f、RT。HE染色观察大鼠肺组织病理改变;实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot检测大鼠肺组织RORγt、IL-17A、IL-21的mRNA及蛋白表达;免疫荧光双标记法检测肺组织RORγt/IL-17A、STAT3/IL-17A及IL-21/IL-17A共定位表达情况,流式细胞术检测肺组织中CD3⁺ CD4⁺ IL17A⁺ Th17细胞占CD4⁺ T细胞比例。结果 与模型组比较,补元汤各剂量组与氨茶碱组大鼠TV、PEF、f、RT指标均明显改善,肺组织病理损伤显著减轻,RORγt、IL-17A、IL-21的mRNA及蛋白含量明显下降,RORγt/IL-17...     

Th17/Treg平衡在湿热型结肠炎大鼠中的变化及黄芩汤的调节作用

目的:观察湿热型结肠炎大鼠模型中Th17/Treg的平衡变化以及黄芩汤对Th17/Treg的调节作用,从免疫学的角度探讨其治疗湿热型结肠炎的机制。方法:应用高脂、高糖饲料联合人工气候箱法等复合因素造出大鼠湿热模型,再结合三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠法建立湿热+TNBS结肠炎模型;将60只大鼠随机分为空白组、湿热+TNBS结肠炎模型组、黄芩汤组、美沙拉嗪组。对大鼠进行一般临床观察,采用酶联免疫吸附法(ELISA)分析大鼠血清中白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)和转化生长因子β(TGF-β)水平,用Western blot方法检测结肠组织中Treg转录因子FOXP3和Th17转录因子RORγt的表达水平。结果:黄芩汤免煎剂0.12g/100g能够有效的缓解湿热型结肠炎的炎症反应,与对照组比较,湿热+TNBS结肠炎大鼠模型中Th17/Treg表达失衡,Th17类细胞因子IL-17和IL-6和转录因子RORγt表达升高而Treg类细胞因子IL-10和TGF-β和转录因子FOXP3表达降低;与模型组相比,黄芩汤能够降低IL-17、IL-6和RORγt的水平而增强IL-10、TGF-β和FOXP3的表达。结论:Th17/Treg失衡可能与湿热型结肠炎的发生发展密切相关,黄芩汤能够有效的调节Th17/Treg的平衡关系,这可能是其治疗湿热型结肠炎的免疫机制之一。     

千金苇茎汤对香烟烟雾暴露模型大鼠肺组织Th17/Treg分化及其相关细胞因子表达的影响

目的:观察千金苇茎汤对香烟烟雾暴露模型大鼠肺组织辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)分化及其相关细胞因子表达的影响。方法:雄性大鼠60只,随机分为正常组,烟雾模型组,乙酰半胱氨酸组、千金苇茎汤高、中、低剂量组,共6组,每组10只。香烟烟雾造模30 d后,药物分别干预30 d,后处死各组大鼠并取组织;实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime PCR)检测维甲酸相关孤儿受体(ROR-γt),叉头状/翼状螺旋转录因子3(Foxp3)mRNA表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测肺组织白细胞介素-17(IL~(-1)7),IL-6,IL~(-1)0,转化生长因子-β_1(TGF-β_1)含量,苏木素-伊红(HE)染色切片观察肺组织病理,流式细胞术检测Treg(Foxp3~+CD25~+)比例,Th17(CD4~+IL~(-1)7~+)比例,Treg/Th17。结果:与正常组比较,模型组ROR-γt mRNA表达显著升高(P0.01);与模型组比较,千金苇茎汤高、中、低剂量组干预后都能够降低其表达(P0.05,P0.01);与正常组比较,模型组Foxp3 mRNA表达明显降低(P0.05),与模型组比较,千金苇茎汤中低剂量组干预后表达明显升高(P0.05)。与正常组比较,模型组IL~(-1)7,IL-6含量明显升高,IL~(-1)0,TGF-β1含量明显降低(P0.05,P0.01);与模型组比较,千金苇茎汤高、中、低剂量组干预后能够降低肺组织IL~(-1)7,IL-6含量,同时升高IL~(-1)0的含量(P0.05),与Real-time PCR检测的结果趋势一致。流式细胞术检测显示,千金苇茎汤中、低剂量组干预后Th17(CD4~+IL~(-1)7~+)比例降低,Treg/Th17增加(P0.05,P0.01)。结论:千金苇茎汤能调节Treg/Th17,使Th17/Treg达到平衡状态。     

黄芪糖蛋白对胶原诱导性关节炎小鼠Th17/Treg细胞免疫平衡的影响

目的研究16k D黄芪糖蛋白对胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型小鼠Th17/Treg细胞免疫平衡的影响,探讨黄芪糖蛋白治疗胶原诱导性关节炎小鼠的免疫作用机理。方法采用雄性Balb/c小鼠建立牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎小鼠模型,将造模成功的小鼠随机分为CIA模型组、氢化可的松阳性对照组、黄芪糖蛋白高、中、低剂量组,另设空白对照组;各治疗组腹腔注射药物14天,对照组与模型组注射等体积生理盐水。采用流式细胞术检测各组小鼠外周血CD3~+CD4~+IL-17A~+Th17细胞、CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞比例;Western blot法检测各组小鼠脾组织中维甲酸相关孤独受体γt(retinoid-related orphan receptorγt,RORγt)和叉头状转录因子3(forkhead box protein 3,Foxp3)的蛋白表达水平。结果流式检测结果显示,黄芪糖蛋白可显著降低模型组小鼠外周血中CD3~+CD4~+IL-17A~+Th17细胞比例(P0.01),提高CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞的比例(P0.01)。Western blot结果显示黄芪糖蛋白可显著降低模型组小鼠脾组织中RORγt的表达(P0.01),提高Foxp3的表达(P0.01)。结论黄芪糖蛋白提高Foxp3的表达水平,降低RORγt的表达水平,恢复Th17/Treg细胞之间的平衡,可能是黄芪糖蛋白治疗胶原诱导性关节炎小鼠的机制之一。     

大鼠ig毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷后尿中代谢产物的分离和鉴定

目的研究大鼠ig毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷后尿中代谢产物。方法采用制备液相进行分离和纯化,通过核磁和质谱数据确定化合物的结构。结果从大鼠ig毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷后的尿中提取分离得到5个代谢产物,分别为毛蕊异黄酮(M_1)、3′,4′,7-三羟基异黄酮(M_2)、大豆素(M_3)、毛蕊异黄酮-3′-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(M_4)、毛蕊异黄酮-3′-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯苷(M_5)。结论代谢产物M_5为新的化合物。     

活血药、益气活血药对肺癌转移过程中Th17/Treg细胞平衡及其机制影响

目的:观察苏木、苏木+黄芪对Lewis荷瘤小鼠肺癌转移过程脾Th17/Treg细胞及其平衡机制影响,为中药逆转肿瘤炎性微环境中免疫逃逸和抑制肿瘤转移机制提供实验依据。方法:复制C57BL/6小鼠Lewis肺癌动物模型,观察肺转移抑制率;流式细胞术检测各组小鼠脾Th17/Treg细胞百分比动态变化;RT-PCR检测各组小鼠CD4+T淋巴细胞Foxp3、RORγtmRNA动态表达水平。结果:从各组药物抑制肺转移率看出,益气活血药苏木+黄芪优于单纯活血药苏木(P<0.05),与环磷酰胺组相似(P>0.05);除苏木黄芪组外,各荷瘤组小鼠脾Th17与Treg细胞随时间迁移呈现出上升趋势,且苏木黄芪组较其余各组有显著差异(P<0.05),Th17/Treg比值亦随时间迁移呈现出上升趋势,与正常组比较均存在比值的平衡失调;Th17与Treg细胞关键转录分子RORγt、Foxp3呈现出与Th17和Treg细胞相应的动态改变。结论:益气活血药苏木+黄芪组在抑制肿瘤形成过程中的炎性微环境优于单纯活血药苏木组和环磷酰胺组;各组药物对肿瘤转移机制均有一定的抑制作用,但益气活血药优于单纯活血药和化疗药物。     

小柴胡汤对CFA大鼠滑膜组织NF-κB信号通路作用的探讨

目的:观察小柴胡汤治疗后弗氏完全佐剂(CFA)大鼠滑膜组织核转录因子(NF)-κB信号通路中肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域(TARDD),NF-κB抑制蛋白α(IκBα),IκB激酶-α(IKKα),NF-κB p65蛋白的表达。方法:将SPF级健康成年雌性Wistar大鼠应用弗氏完全佐剂和牛Ⅱ型胶原制备CFA动物模型。根据随机数字表,将大鼠随机分为正常组、模型组、小柴胡汤低、中、高剂量组、雷公藤多苷组。各组于造模后7 d开始灌胃给药,正常组及模型组均予注射用水,小柴胡汤低、中、高剂量组(5. 94,11. 88,23. 76 g·kg~(-1)),雷公藤多苷片(0. 006 3 g·kg~(-1)),分别2 mL/次,每天3次灌胃,连续给药28 d后观察实验大鼠踝关节组织病理学及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测NF-κB信号通路中TARDD,IKKα,IκBα,NF-κB p65蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠右后踝关节组织病理评分显著增加(P 0. 01),NF-κB信号通路中TARDD,IKKα,IκBα,NF-κB p65蛋白表达显著增高(P 0. 01)。与模型组比较,随着小柴胡汤剂量的增加,实验大鼠右后踝关节组织病理评分显著减少(P 0. 01),在大鼠踝关节组织标本NF-κB信号通路中TARDD,IKKα,IκBα,NF-κB p65关键蛋白的表达上,小柴胡汤低剂量组蛋白表达明显减低(P 0. 05),而小柴胡汤中剂量组、小柴胡汤高剂量组、雷公藤多苷组蛋白表达显著减低(P 0. 01)。结论:研究显示小柴胡汤随着剂量的增加,可以有效地改善滑膜炎症,抑制NF-κB炎症信号通路中关键蛋白的表达,从而阻止炎症而抑制骨侵蚀。