GGTA1-/-五指山小型猪SLA I类基因分子特征及与HLA相似性分析

【摘要】 目的 明晰α-1,3半乳糖基转移酶基因敲除（GGTA1-/-）的五指山小型猪SLA经典Ⅰ类基因分子结构特征及其与人HLA的相似性,对研究异种器官移植细胞性排斥反应具有重要意义。 方法 本研究采集6头祖代GGTA1-/- 五指山小型猪耳组织,利用RT-PCR对SLAⅠ类基因（SLA-1、SLA-3、SLA-2）扩增、克隆及测序,对序列进行BLAST分析,并采用生物信息学方法对SLAⅠ类基因分子结构特征及其与人HLA的同源性进行分析。 结果 测序分析表明,共获得6条等位基因序列,其中3条为已公布的等位基因（SLA-2*1102、SLA-3*0401、SLA-3*0403）,另3条为新等位基因(SLA-1*0401wz01、SLA-1*wzs01、SLA-2*wzs01)。五指山小型猪与人HLA同源性为70.5%~72.1%。 SLA-1*0401wz01、SLA-1*wzs01、SLA-2*wzs01、SLA-2*1102和SLA-3*0401的CD8+分子识别的关键结合域与人HLA氨基酸序列比对,均仅在位点225、228处发生了突变（T→S、T→M）,其它位点高度保守。SLA-2*wzs01和SLA-2*1102与人HLAⅠ类基因NK细胞抑制性受体（killer inhibitory receptor,KIR）结合区氨基酸同源性较高,在NKTA-1亚型结合域内仅有1个氨基酸差异,而在NKTA-2 和NKTA-3亚型结合域内有2个氨基酸差异。 结论 从免疫细胞介导的异种排斥反应角度出发,GGTA1-/- 五指山小型猪SLAⅠ类基因氨基酸序列与人HLA高度相似,可作为未来猪-人异种器官移植的良好供体之一。     

CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立

目的：利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法：选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330?sgRNA1和PX330?sgRNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒（pCMV?tdTomato）共转染原代猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts,PFFs）中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果：分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sgRNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/- Six4-/-细胞系为13个。结论：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。     

不同月龄近交系五指山小型猪免疫器官的组织形态学

目的对不同月龄近交系五指山小型猪免疫器官组织特点进行观察,为其用于建立人类免疫相关疾病模型提供基础形态学资料。方法2、4和12月龄小型猪免疫器官被分别固定,常规石蜡切片、HE染色,光镜观察。结果4月龄前,胸腺内胸腺细胞和胸腺小体的数量均随年龄的增长逐渐增多;12月龄时,胸腺细胞数量有所减少,排列比较疏松,胸腺小体的数量和体积基本没有变化;2月龄时胸腺小体周围可见许多大小不同的空泡状细胞和细胞碎片。4月龄前,脾白髓动脉周围组织淋巴鞘和脾小结在也随年龄增长而逐渐增多增大,但12月龄时有所减少并维持在一定水平,其变化与大鼠和鸡的基本一致。2月龄淋巴结皮质靠内,髓质靠外,4月龄两者分界不明显,12月龄淋巴小结较大,淋巴细胞排列疏松,髓质内淋巴细胞较少,毛细血管增多。结论从整体结构上观察,近交系五指山小型猪免疫器官的组织学结构与人和其它哺乳动物之间没有明显的差异。     

人/猪SERPING1同源性比较及猪SERPING1敲除细胞系的建立

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1^-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法 首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果 生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论 人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPI...     

版纳小型猪近交系心脏的异种移植解剖学观察

目的 研究中国版纳小型猪心脏的解剖结构及其血液供应，为转基因猪心脏异种移值提供形态学依据。方法 取10头经10％甲醛常规固定的版纳小型猪近交系的心脏进行形态观察和测量。结果 版纳小型猪近交系的心脏外形、内部结构、血管配布以及与心脏相连的大血管等同人的心脏基本相似，但小型猪的奇静脉直接开1：3于右心房，左、右冠状动脉都发出旋支，与人有所不同。结论 版纳小型猪近交系的心脏从形态上，具备异种移植供体条件。     

人/猪OSBPL2同源性比较及猪PFFs靶基因敲除细胞系的建立

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts,PFFs）OSBPL2敲除细胞系,为构建小型猪致聋基因缺陷动物模型奠定重要的前期工作基础。方法：首先通过生物信息学方法对人与猪OSBPL2基因共线性和同源性进行分析,预测并模拟人与猪OSBPL2蛋白质二级、三级结构。其次,设计合成靶向猪OSBPL2第5、6外显子设计单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组载体,转染至猪PFFs中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,T7EN1酶切实验检测靶向效率,序列分析检测单克隆细胞基因型。结果：生物信息学分析结果表明人与猪的OSBPL2在染色体上具有较好的共线性关系,蛋白质氨基酸同源性高达88%,且具有相似的功能结构域。成功构建打靶OSBPL2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染PFFs细胞,药物筛选获得OSBPL2基因双敲的单细胞克隆并测序证实了基因突变型。结论：人和猪OSBPL2基因具有高度的同源性。构建成功的Cas9/sgRNA表达载体在PFFs中预期实现了OSBPL2基因编辑并获得基因双敲的单细胞克隆,为后续OSBPL2基因敲除猪模型构建提供了必需的实验材料。     

五指山小型猪高脂血症模型的建立

目的本研究通过给与五指山小型猪高脂饲料，旨在诱发小型猪的高脂血症。方法将30头小型猪随机分成3组：①对照组（n=6），喂正常猪饲料；②1．5％胆固醇组（n=12），饲喂含1．5％胆固醇、10．0％的牛油、6．0％花生油和0．5％胆盐的饲料；③3％胆固醇组（n=12），饲喂含3．0％胆固醇、10．0％的牛油、6．0％花生油和0．5％胆盐饲料。高脂饮食6个月。每月测定体重和血脂（TG、TC、HDL-C、LDL-C）。结果和结论五指山小型猪对高脂饮食反应敏感，高脂饮食一个月内，高脂饮食组TC、HDL-C和LDL-C从极低水平迅速升高，随后逐月缓慢升高。至高脂饮食4个月时，TC达到15．5～17．7mmol／L，LDL-C达到12～13mmol／L，HDL-C达到4．45～5．76mmol／L，与基线相比，TC升高约10倍，LDL-C升高约15倍，HDL-C升高约7倍，4个月后变化趋于稳定，而对照组没有变化，TG没有明显变化趋势，形成了典型的高胆固醇血症。1．5％胆固醇组和3％胆固醇组血脂指标差异不明显（P〉0．05），提示1．5％的胆固醇含量就足以获得高脂血症模型。     

利用CRISPR/Cas9建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除成体神经干细胞（neural stem cell,NSC）PIN1基因,建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系。方法：取8周龄C57BL/6小鼠脑室下区的脑组织进行体外培养;设计靶向小鼠PIN1基因的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以PX330质粒为骨架,构建PIN1的Cas9打靶载体,转染小鼠的成体神经干细胞,通过puro筛选和测序鉴定获得PIN敲除的单克隆细胞;利用免疫荧光染色和Western blot测定PIN1蛋白表达水平,免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特征性标志物巢蛋白（Nestin）的表达,Beta Ⅲ Tubulin免疫荧光染色鉴定神经干细胞分化为神经元的能力。结果：成功构建PIN1基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得PIN1敲除的神经干细胞克隆9个。免疫荧光染色及Western blot显示PIN1蛋白无表达,免疫荧光染色显示PIN1敲除的神经干细胞Nestin阳性,神经干细胞分化培养时可部分分化为Beta Ⅲ Tubulin阳性的神经元细胞。结论：CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现对小鼠成体神经干细胞PIN1基因的编辑。在PIN1基因敲除后PIN1蛋白无表达,初步表型分析显示,神经干细胞仍表达特征性标志物Nestin,并具有向神经元分化的能力。     

CRISPR/Cas9系统构建ROCK2基因敲除肺癌细胞系

目的 利用CRISPR/Cas9编辑系统对人肺癌细胞系A549、H460细胞中Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(ROCK2)基因进行稳定敲除,并对其敲除效果进行验证。初步探讨ROCK2基因敲除肺癌细胞株的细胞水平上的功能改变。方法 利用Rock-2 CRISPR 质粒和Rock-2 HDR 质粒转染构建A549、H460 ROCK2基因敲除稳定细胞株。蛋白质印迹法验证敲除效果、用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ROCK2基因的mRNA表达水平。平板克隆形成实验、MTT法检测各细胞株的增殖能力。结果 A549、H460肺癌细胞中ROCK2基因稳定敲除株构建成功。与原始细胞株相比,ROCK2敲除株细胞中的蛋白表达水平完全缺失,细胞内的mRNA表达水平显著下降,而且能降低A549、H460肺癌细胞的增殖能力。结论 利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得ROCK2基因敲除的肺癌细胞系,为进一步研究ROCK2对肺癌生长的影响奠定基础。     

猪SALL1蛋白分子信息分析及基因敲除细胞系制备

目的：从巴马小型猪SALL1的蛋白结构出发,分析其与人SALL1蛋白的同源性,进一步制备Sall1基因敲除的巴马小型猪胎儿成纤维细胞系,为通过体细胞核移植技术获得猪肾脏发育缺陷模型提供实验材料。方法：利用生物信息学方法分析人、猪、鼠 SALL1 的蛋白结构。利用在线设计软件,在猪 Sall1 基因第 1 外显子区域设计单链引导 RNA(single guide RNA, sgRNA)并将其连接至PX330质粒,构建猪Sall1基因敲除打靶载体。在初步转染细胞的基础上,通过Sall1基因测序分析验证 PX330?sgRNA载体打靶效率,最后将打靶载体转染至原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过药物筛选获得单克隆细胞并鉴定其基因型。结果：生物信息学分析表明,相比小鼠,猪的SALL1蛋白与人SALL1蛋白具有更高的同源性。成功构建猪Sall1基因敲除打靶载体,并获得33个单克隆细胞系,经基因测序鉴定得到16个Sall1双等位基因敲除的细胞系。结论：生物信息学方法验证了人和猪SALL1蛋白具有更高的同源性。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得Sall1基因敲除细胞系,为研究Sall1基因在猪肾脏发育过程中的作用提供研究材料,并为下一步获得猪肾脏缺失模型奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除HeLa细胞中YAF2基因

目的 利用CRISPR/Cas9技术建立YAF2（YY1 associated factor 2）基因敲除的宫颈癌HeLa细胞株,用于YAF2基因在宫颈癌细胞中分子功能的研究。方法 首先利用CRISPR/Cas9序列设计网站,设计两对靶向YAF2基因第2外显子不同位点的向导RNA（single-guide RNA,sgRNA）。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,分别克隆至质粒pX335中,测序确认插入片段正确的克隆。先用一对重组载体转染HeLa细胞,7天后,再用另一对转染HeLa细胞,第2对转染3天后,取培养细胞的2/3提取基因组DNA,对敲除位点附近的片段进行PCR扩增后通过DNA测序对敲除效率进行分析,剩余细胞在96孔平板上通过有限稀释法筛选YAF2敲除的细胞株。用蛋白质免疫印迹实验初步鉴定YAF2蛋白质表达缺失的细胞克隆,提取其基因组DNA,对敲除位点附近的序列进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pGEM-T easy载体,通过DNA测序确认YAF2基因纯合敲除的细胞株。结果 成功构建两对针对人YAF2基因第二外显子的pX335-sgRNA质粒;PCR产物测序证明两对重组载体均有YAF2基因敲除活性;得到2株YAF2敲除的HeLa细胞株。结论 利用CRISPR/Cas9技术在HeLa细胞中成功敲除YAF2基因,为在HeLa细胞中研究YAF2的分子功能奠定基础。     

基于CRISPR/Cas9技术建立敲除OSBPL2基因的HeLa细胞株

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建OSBPL2基因敲除的稳定HeLa细胞株?方法:设计3个单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),分别靶向OSBPL2基因的第2?3和5外显子,以PGK1.1为载体,构建出3个重组真核表达载体?分别转染HeLa细胞后,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,CruiserTM敲除检测实验和测序共同检验载体靶向效率?选出靶向效率最高的质粒转染HeLa细胞,进行单克隆细胞培养,最后用Western blot 鉴定敲除效果?结果:sgRNA正确插入到PGK1.1载体,靶向第2外显子的重组载体转染HeLa细胞并筛选单克隆后,细胞未检测出OSBPL2蛋白的表达?结论:敲除OSBPL2基因的稳定HeLa细胞株构建成功?     

应用CRISPR/Cas9技术建立敲除AIFM1基因的稳定肺癌细胞株

目的 利用CRISPR/Cas9技术在肺癌细胞系A549和NCI-H3255中敲除凋亡诱导因子1(AIFM1)基因,并通过筛选,获得稳定的细胞株。方法 利用在线数据库GEPIA、CPTAC、Prognosis和SangerBox分析AIF在肺癌的表达和功能。以AIFM1基因为靶点,设计向导RNA(sgRNA)并利用CRISPR RGEN Tools分析其脱靶效率,CRISPR/Cas9技术敲除肺癌细胞的AIFM1基因和倍比稀释法筛选稳定的单克隆细胞株。采用Western blot检测细胞AIF表达水平。结果 TCGA和GTEx数据集结果显示,AIF蛋白在肺癌组织阳性表达率比正常组织高,差异有统计学意义（P<0.05）;单因素cox和多因素cox分析发现,pT分期和pN分期是独立危险因素（P<0.05）;CPTAC数据库显示,与正常阶段相比,AIF蛋白在肺癌的不同分级分期阶段的表达增加（P<0.05）。AIFM1基因在TCA循环、亨廷顿氏症疾病、氨基酸-核苷酸-糖的代谢和氧化性磷酸化通路中富集显著,差异有统计学意义（|NES|>1,P<0.05）;3条sgR...     

利用CRISPR/Cas9技术高效构建巴马小型猪F9基因敲除细胞系

目的：利用CRISP/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪F9基因敲除的胚胎成纤维（porcine fetal fibroblast,PFF）细胞系,为后续构建血友病乙巴马小型猪模型提供原材料。方法：首先通过生物信息学方法对人和猪F9基因同源性进行分析,模拟并分析人和猪FⅨ二级、三级结构的相似性;其次选取猪F9基因的第2外显子为敲除靶点,利用CRISPR在线靶点设计工具（http：//www.e?crisp.org/E?CRISP/designcrispr.html）设计并合成单链向导 RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为骨架构建打靶载体,同G418抗性质粒一同转染至野生巴马小型猪的PFF中,经药物G418筛选获得抗性单细胞克隆,测序并鉴定其基因型。结果：生物信息学分析表明人和猪的F9基因具有较近的遗传距离,FⅨ的氨基酸序列相似值为83.33%,三维结构的均方根偏差（root mean square deviation,RMSD）值为0.149。成功构建打靶载体并转染PFF细胞,药筛后共获得55个单细胞克隆,经过测序显示有25个单细胞克隆的F9基因发生突变,计算敲除率为45.5%。结论：人和猪F9基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA 表达载体可以高效编辑PFF中的F9 基因。最终获取F9基因敲除的单细胞克隆,为构建乙型血友病巴马小型猪模型奠定了重要的前期工作基础。     

五指山小型猪腹腔粘连模型的建立

目的 建立五指山小型猪的腹腔粘连模型.方法 五指山小型猪术前禁食不禁水过夜,手术前用速眠新Ⅱ、戊巴比妥钠联合麻醉,然后采用浆膜物理损伤、化学损伤、血管结扎、腹膜壁层结扎等多因素方法建立五指山小型猪腹腔粘连模型.结果 术后1d即可观察到五指山小型猪形成了腹腔粘连,粘连程度评分可达2分,粘连面积评分也达到2～3分;术后3d观察发现形成较为严重的粘连,粘连程度和面积评分达到3～4分;腹腔粘连维持时间较长,术后12个月仍可见粘连,粘连程度和面积评分达到2～3分.性别间比较,腹腔粘连的程度及面积差别并不明显.结论 采用多因素方法成功建立了五指山小型猪腹腔粘连模型.     

GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2(G protein-coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF),为构建GPRASP2基因敲...     

用CRISPR/Cas9技术编辑KLF4基因对GES-1细胞生物学行为的影响

目的 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建靶向KLF4的基因编辑质粒,建立CRISPR/Cas9-sgKLF4人正常胃黏膜GES-1细胞株,观察KLF4基因敲除效果及其对细胞生物学行为的影响.方法 设计靶向KLF4基因的sgRNA序列,将合成的片段插入到CRISPR/Cas9质粒骨架载体pX459中,再将重组后的质粒做转化,挑取克隆,扩增后提质粒进行测序验证正确性.将构建好的重组质粒体外转染入人胃黏膜细胞GES-1中,利用嘌呤霉素进行筛选获得KLF4敲除的克隆细胞,应用Western blot技术检测未转染细胞和克隆细胞中KLF4蛋白的表达情况,平板克隆实验检测KLF4敲低后克隆形成能力,MTT实验检测其增殖能力,Transwell实验检测其迁移能力.结果 经测序验证,成功构建了靶向KLF4的重组质粒pX459-KLF4-sgRNA,经Western blot方法验证,转染该重组质粒后人胃黏膜上皮细胞株GES-1的KLF4蛋白表达量明显降低,行为学实验结果表明,GES-1细胞敲低KLF4基因后克隆形成能力、增殖能力以及迁移能力都明显增强.结论 成功构建了靶向KLF4的CRISPR/Cas9基因编辑质粒载体及KLF4基因敲低的稳定细胞株GES-1,KLF4基因敲低后GES-1细胞生物学行为的改变证实其抑癌基因活性.     

Rev-erbβ基因敲除对肝癌HepG2细胞增殖和迁移侵袭的影响

  目的  探讨核受体Rev-erbβ基因敲除对肝癌HepG2细胞增殖和迁移的影响。  方法  首先采用对靶向基因进行特定DNA修饰的CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建Rev-erbβ基因敲除的HepG2细胞系。用Rev-erbβ打靶载体共转染到HepG2细胞,通过筛选、克隆化构建Rev-erbβ基因敲除HepG2细胞系,并采用PCR、测序和Western blot鉴定。以正常HepG2细胞为对照,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Rev-erbβ基因敲除对肿瘤迁移、侵袭相关基因表达的影响,采用MTT、细胞划痕、Transwell等实验检测Rev-erbβ基因敲除对HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的影响。  结果  成功构建一株Rev-erbβ基因完全敲除单克隆细胞系(经PCR、测序和Western blot鉴定),命名为HepG2 C5(Rev-erbβ-/-)。qRT-PCR结果显示,Rev-erbβ基因敲除可以导致基质金属蛋白酶-2,-9基因(MMP2,MMP9)、细胞外基质蛋白1基因(ECM1)表达上调(P均＜0.05),细胞黏附相关基因E-钙黏蛋白基因(CDH1)下降(P=0.05);MTT、细胞划痕、Transwell实验显示,并且HepG2 C5比对照细胞有更强的增殖、迁移与侵袭能力(P＜0.05)。  结论  Rev-erbβ基因敲除可以改变HepG2细胞与迁移、黏附相关基因的表达,进而影响HepG2细胞增殖、迁移与侵袭能力。