利用串联亲和纯化结合质谱分析分离和鉴定与蛋白激酶NLK结合的蛋白复合物组分

目的 利用串联亲和纯化结合质谱分析分离和鉴定与蛋白激酶NLK结合的蛋白复合物组分.方法 将RFP、NLK和其突变体NLKK155M克隆至本室改造的带有Flag和Strep双标签的反转录病毒载体pMSCVpuro中,通过酶切鉴定并测序验证其构建的正确性.采用反转录病毒感染结合嘌呤霉素筛选的方法,获得稳定表达RFP、NLK、NLK突变体NLKK155M的HCT-116细胞株,Western blot法检测目的蛋白RFP、NLK和NLKK155M的表达.采用串联亲和纯化结合质谱分析,分离、鉴定与NLK结合的蛋白.结果 构建的pMSCVpuro/N-Flag-Strep-RFP和pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK质粒经酶切鉴定、测序证明质粒构建正确,pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK155M质粒经测序证明构建正确.携带上述基因的反转录病毒感染的HCT-116细胞,Flag-Strep-RFP、Flag-Strep-NLK和Flag-Strep-NLKK155M均正常表达.经串联亲和纯化和质谱分析,发现多个可能与NLK结合的蛋白.结论 本研究采用串联亲和纯化结合质谱分析成功鉴定了若干可能与NLK及其突变体NLKK155M结合的蛋白质.     

巨噬细胞中与原肌球蛋白调节蛋白1相互作用的迁移相关蛋白质分析

目的 利用质谱联合Gene Cards数据库挖掘分析Raw264.7小鼠单核巨噬细胞系中与原肌球蛋白调节蛋白1(TMOD1)相互作用且与迁移相关的蛋白质。方法 使用TMOD1-DDK质粒在Raw264.7细胞中过表达TMOD1,免疫共沉淀联合质谱寻找巨噬细胞中与TMOD1存在相互作用的蛋白质,Gene Cards数据库检索巨噬细胞迁移已知蛋白质,Bioinformatics&Systems Biology在线工具对已知蛋白质与质谱蛋白质进行关联分析找到共同差异蛋白(CO-DEPs),Wo LF PSORT预测CO-DEPs亚细胞定位,Egg NOG数据库对CO-DEPs进行真核生物同源类群(KOG)注释,DAVID数据库对CO-DEPs进行基因本体(GO)注释与京都基因组学和基因组学百科全书(KEGG)通路注释,String数据库对CODEPs进行蛋白互作网络分析、Cyto Scape软件绘图。结果质谱与Gene Cards数据库分析共获得CO-DEPs 41个,CODEPs亚细胞定位主要分布于细胞骨架、细胞质、细胞核,KOG注释主要为O:翻译后修饰、Z:细胞骨架、J:翻译,G...     

宫颈癌组织中TSPAN-1与Ki-67蛋白的表达

目的:探讨肿瘤相关蛋白TSPAN-1与Ki-67在宫颈癌组织中表达及其关联性.方法:应用免疫组织化学SP法检测正常宫颈、宫颈癌及宫颈内瘤样病变(CIN)组织(各30例)中TSPAN-1及Ki-67蛋白的表达.结果:正常宫颈、CIN和宫颈癌组织中TSPAN-1和Ki-67的阳性表达率分别为0(0/30)、36.7%(11/30)、73.3%(22/30)和13.3%(4/30)、53.3%(16/30)、80.0%(24/30),差异有统计学意义(χ2=34.737和27.036,P均<0.001,宫颈癌和CIN组织高于正常宫颈组织.宫颈癌组织中TSPAN-1表达与淋巴结转移有关(P=0.014).宫颈癌组织中TSPAN-1与Ki-67表达有关联性(χ2=8.960,rP=0.539,P<0.001).结论:TSPAN-1过表达与细胞增殖有关,参与宫颈癌的发生发展.     

宫颈癌中AIB1蛋白的表达及其临床意义

目的观察AIB1蛋自在宫颈癌中的表达,初步探讨其在宫颈癌中的临床意义。方珐采用免疫组化法检测15例正常宫颈组织和33例宫颈癌组织中AIB1蛋白的表达情况,并比较不同临床病理特征之间AIB1蛋白表达的差异,分析其相关性。瞎杲宫颈癌与正常宫颈组织中AIB1蛋白表达阳性率分别为33．3％和13．3％,差异无统计学意义,但不同分化程度宫颈癌组中AIB1蛋白的表达差异有统计学意义,随着肿瘤分化程度的逐渐降低,AIB1蛋白的表达有升高趋势。结论AIB1蛋白的过表达在宫颈癌的发生发展中可能起一定作用。     

宫颈癌中AIB1蛋白表达水平的初步研究

目的初步研究宫颈癌中AIB1蛋白的表达情况。方法应用免疫组化SP法检测10例正常宫颈组织、18例宫颈癌中AIB1蛋白的表达情况。结果AIB1在宫颈癌中的阳性表达率为27.8%。随着肿瘤分化程度的逐渐降低,AIB1蛋白的表达水平有不断增高的趋势。AIB1的阳性表达与宫颈癌的淋巴结转移有相关性。结论AIB1基因的过表达可能与宫颈癌的发生发展有关。     

FoxM1蛋白在宫颈癌的表达及临床意义的meta分析

目的系统评价叉头框蛋白M1(FoxM1)在宫颈癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法计算机检索PubMed、CBM、Cochrane Library、万方、知网、维普等数据库,收集已公开发表的关于宫颈癌组织中FoxM1蛋白表达及其临床病理特征相关的病例随机对照研究,时间为建库起至2020年7月。根据纳入和排除标准筛选文献,应用RevMan5.3软件进行meta分析。结果最终纳入19篇文献,共2 781例受试者,其中宫颈癌患者1 446例,宫颈上皮内瘤变(CIN)患者403例,正常宫颈妇女932例。meta分析结果显示:宫颈癌组中FoxM1蛋白表达明显高于正常宫颈组和CIN组,差异均有统计学意义(P<0.001);CIN组的FoxM1蛋白表达明显高于正常宫颈组,差异有统计学意义(P<0.001);FoxM1蛋白高表达与更高淋巴结转移率(P<0.001)、更低分化程度(P<0.001)和更深肌层浸润(P<0.001)有关,而与年龄(P=0.150)和病理类型(鳞癌或腺癌,P=0.290)无关。结论 FoxM1蛋白参与宫颈癌的发生、发展,可以作为预测宫颈肿...     

宫颈癌组织中Rap1GAP蛋白表达及其与HPV感染的相关性

[目的]探讨Rap1GAP蛋白在宫颈癌组织中的表达变化以及其与HPV感染之间的关系。[方法]免疫组化方法检测20例宫颈癌与20例正常宫颈组织HPV感染和Rap1GAP蛋白表达情况。[结果]HPV检出阳性率在正常宫颈组织和宫颈癌中分别为20%与75%,宫颈癌组明显高于正常宫颈组(P<0.05)。宫颈癌组的Rap1GAP蛋白表达阳性率为15%、弱阳性率为15%,二者均明显低于正常宫颈组(阳性率,55%和弱阳性率,45%)(P均<0.05)。宫颈癌组织中,HPV阳性组Rap1GAP蛋白缺失率为80%,明显高于HPV阴性组的缺失率40%(P<0.05),且二者之间呈正相关(r=0.553,P<0.05)。[结论]宫颈癌组织Rap1GAP蛋白表达下调或缺失可能与HPV感染有关。     

HepG2细胞中PIG11相互作用蛋白质的初步分离与鉴定

目的探讨人肝细胞癌细胞系（HepG2）并初步鉴定候选肝癌抑癌蛋白肿瘤蛋白P53下游靶基因11号（PIG11）相互作用蛋白,确定PIG11的作用方式。方法课题组前期利用质粒pLXSN构建逆转录病毒载体,转染细胞后建立起PIG11高表达HepG2细胞株。将HepG2分为HepG2对照组,空载体HepG2组和PIG11高表达HepG2组分别培养,流式细胞术检测细胞凋亡。采用免疫共沉淀富集HepG2细胞中PIG11结合蛋白,切取PIG11结合蛋白条带,胶内酶解后进行电喷雾串联质谱得到肽序列标签,通过数据库查询蛋白。结果PIG11蛋白高表达组凋亡率显著高于对照组（P〈0.01）。串联质谱后数据库查询鉴定出11个蛋白,分别是热休克蛋白家族中的HSP60,KH型剪接调节蛋白（KSRP）、脑酸溶性蛋白BASP1、蛋白水解诱导因子（PIF/DCD）、Y染色体RNA结合蛋白、碳酸酐酶、白蛋白以及骨架蛋白中的波形蛋白、α、β-微管蛋白、肌动蛋白。结论PIG11蛋白高表达对HepG2具有诱导凋亡作用;初步鉴定出11个PIG11结合蛋白,为进一步阐明PIG11蛋白的作用机制提供线索。     

宫颈癌HeLa细胞抗顺铂作用的Notch1机制研究

目的 利用宫颈癌HeLa细胞系探讨宫颈癌的抗化疗机制。 方法 利用球形成试验(sphere forming assay)和Western blot法检测顺铂对癌症干细胞形成的影响以及Notch1在HeLa细胞系的表达。基因沉默试验分析Notch1基因是否在宫颈癌HeLa癌症干细胞中发挥关键作用。 结果 顺铂能促进球结构(意味着癌症干细胞形成)的形成。5μmol/L顺铂较1μmol/L顺铂能促进更多球结构形成(P<0.05)。10μmol/L顺铂会抑制球结构形成。5μmol/L顺铂还能提高HeLa 中Notch1的表达(P<0.05),而沉默HeLa细胞的Notch1后,HeLa细胞中形成的球数量降低1.7倍(P<0.05)。 结论 宫颈癌HeLa细胞系具有抗顺铂治疗的特性,尤其是5μmol/L的顺铂,该抗化疗作用与宫颈癌HeLa细胞中的Notch1表达升高,最终促进癌症干细胞自我更新有关。     

免疫共沉淀联合质谱分析筛选克罗恩病中Intelectin-1相互作用蛋白的初步研究

目的 对比克罗恩病患者的病变与正常肠黏膜,筛选与肠凝集素-1(Intelectin-1)相互作用的差异蛋白,探讨Intelectin-1及其相互作用蛋白在克罗恩病发展中的作用.方法 利用免疫共沉淀技术筛选克罗恩病患者病变及正常组织中与Intelectin-1相互作用的蛋白;利用MALDI-TOF/TOF-MS质谱分析技术鉴定与Intelectin-1相互作用蛋白;并使用免疫共沉淀和Western blot分析技术验证所鉴定的Intelectin-1相互作用蛋白.结果 利用免疫共沉淀联合质谱分析技术成功筛选出4个与Intelectin-1相互作用差异蛋白,包括:肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)、腺苷酸三磷酸酶(ATPase)、热休克蛋白90(HSP90)、锌指蛋白(ZNF).结论 Intelectin-1可能通过与TRAF3、ATPase、HSP90、ZNF蛋白相互作用,而影响克罗恩病的发展.     

Fascin-1 蛋白在宫颈癌中的表达 及其临床病理意义

目的 探讨 Fascin-1（FSCN1）蛋白表达在宫颈癌发生、发展中的临床病理意义。 方法 采用免疫组化 En Vision 二 步法检测 40 例正常宫颈组织、40 例低级别上皮内瘤变 （CIN1 级）、49 例高级别上皮内瘤变 （CIN2～3 级）、120 例宫颈癌组织中 FSCN1 蛋白的表达,并分析其与宫颈癌患者临床病理特征的关系。 结果 正常宫颈鳞状上皮组织 FSCN1 蛋白阳性率为 47.5% （19/40）,但其基底层细胞 FSCN1 蛋白阳性率为 100.0%（40/40）。正常宫颈鳞状上皮组织、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、宫 颈癌组织中 FSCN1 蛋白阳性率分别为 47.5%（19/40）、100.0%（40/40）、98.0%（48/49）、99.2%（119/120）。低级别上皮内瘤变、高级别 上皮内瘤变和宫颈癌组织中 FSCN1 蛋白阳性率显著高于正常宫颈鳞状上皮组织（均 P＜0.01）;但低级别上皮内瘤变、高级别上皮内 瘤变和宫颈癌组织 3 者间 FSCN1 蛋白阳性率均无统计学差异（均 P ＞0.05）。在具有不同临床病理特征的患者间比较,FSCN1 蛋白阳 性率均无统计学差异（均 P ＞0.05）。 结论 在病变宫颈组织中 FSCN1 蛋白阳性率显著高于正常宫颈组织,提示其在宫颈癌发生的 过程中起了重要作用,有望成为抗宫颈癌治疗的一个潜在生物学标志。     

AQP1和AQP3在宫颈癌新辅助化疗前后的表达变化及意义

目的观察新辅助化疗前后宫颈癌组织中水通道蛋白1（AQP1）与水通道蛋白3（AQP3）表达的变化,探讨两者在宫颈癌新辅助化疗中的意义。方法选择宫颈鳞癌患者30例,术前接受以顺铂为基础的有效新辅助化疗。化疗前和手术中分别取癌组织标本,应用RT-PCR法、Westernblot法和免疫组化法对水通道蛋白（AQPs）的mRNA、蛋白和组织分布进行检测。结果化疗后AQP1和AQP3的mRNA表达量约为化疗前的3倍和2.7倍,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。AQP1和AQP3蛋白在宫颈癌组织中大量表达,在细胞膜和胞质中均有分布,化疗后表达量提高,以胞质更为明显。30例患者经过化疗后,其中19例完全缓解,11例部分缓解。完全缓解组患者化疗后AQP1和AQP3的mRNA和蛋白表达的增值虽然均大于部分缓解组,但差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论AQP1和AQP3在新辅助化疗后宫颈癌组织中的表达增加,增幅可能与化疗效果相关。     

干扰INHBA-AS1通过抑制糖酵解途径促进宫颈癌细胞凋亡的作用及机制

目的 观察干扰INHBA-AS1通过糖酵解对宫颈癌细胞Hela增殖和凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 将宫颈癌细胞Hela细胞分为空白对照组、阴性对照组、干扰INHBA-AS1组、Prosapogenin A（10 μM,处理48 h）组、阴性对照+Prosapogenin A组（10 μM,处理48 h后转染）和干扰INHBA-AS1+Prosapogenin A（10 μM,处理48 h后转染）组。CCK8检测细胞增殖,TUNEL检测细胞凋亡,测试盒检测葡萄糖、乳酸和ATP含量,qRT-PCR检测细胞INHBA-AS1、HK2、PDK1、GLUT1、LDHA的mRNA表达,Western blot法检测HK2、PDK1、GLUT1、LDHA的蛋白表达情况。结果 与对照组相比,干扰INHBA-AS1或Prosapogenin A组细胞的增殖被抑制（P＜0.05）,凋亡被促进,葡萄糖含量显著上升（P＜0.05）,乳酸、ATP含量显著下降（P＜0.05）,HK2、PDK1、GLUT1、LDHA的mRNA和蛋白表达均显著下降（P＜0.05）;而同时使用干扰INHBA-AS1和Prosapogenin A处理细胞会加重上述现象（P＜0.05）。结论 干扰INHBA-AS1通过抑制糖酵解使宫颈癌细胞Hela的增殖被抑制,凋亡被促进,其机制可能与PDK1相关     

宫颈癌组织中VEGF、Galectin-1的检测意义

目的:探讨VEGF(血管内皮生长因子)、Galectin-1(半乳糖凝集素-1)的检测在宫颈癌组织中的价值.方法:分析在本院接受手术切除术治疗的39例宫颈癌患者的宫颈癌和正常宫颈组织标本.比较两种组织的VEGF、Galectin-1表达差异,并探讨两者与宫颈癌组织的病理特征的相关性.结果:本研究共纳入标本共计39个,其中宫颈癌标本和正常宫颈组织标本各39个,宫颈癌组织的Galectin-1和VEGF阳性表达率均明显高于正常宫颈组织,差异具有统计学意义(P＜0.01);宫颈癌组织中的Galec-tin-1阳性表达率与VEGF表达呈现正相关的关系(r=0.334,P=0.039);宫颈癌组织中的Galectin-1、VEGF阳性表达率与组织的分化程度、FIGO分期、淋巴结转移情况均有明显相关性(P＜0.05),且组织分化程度越低、FIGO分期越高、淋巴结出现转移,相应的组织Galectin-1、VEGF阳性表达率越高.结论:VEGF、Galectin-1与宫颈癌组织的发生、发展有着密切的联系.     

宫颈上皮内瘤变及早期宫颈癌组织中P16、HPV L-1壳蛋白的表达分析

目的 探讨P16、HPV L-1 壳蛋白的表达及在早期宫颈癌、宫颈上皮内瘤变中的筛查价值。方法 本次研究纳入67 例CIN 患者及15 例早期宫颈鳞状上皮细胞癌患者,另选取慢性宫颈炎患者31 例,应用第二代杂交捕获法及免疫组化法检测HR-HPV 载量、P16 及HPV L-1 壳蛋白表达并对相关性进行分析。结果P16 蛋白在早期宫颈癌、HSIL、LSIL 及慢性宫颈炎阳性表达率升高,HPV L-1 壳蛋白阳性表达率有显著差异（P＜0.05）。随着病毒载量不断增加,HPV L-1 及P16 蛋白阳性表达率均出现变化（P＜0.05）。慢性宫颈炎P16 蛋白表达阳性率及高危型HPV 病毒呈正相关（P＜0.05）。LSIL 病变中P16 蛋白表达阳性率与高危型HPV 病毒呈正相关（P＜0.05）。HSIL病变中P16 蛋白表达阳性率与高危型HPV 病毒无相关性（P＞0.05）。结论 P16、HPV L-1 壳蛋白表达阳性在CIN及早期宫颈癌筛查中的应用价值较高。     

影响人宫颈癌细胞株Hela/DDP顺铂化疗敏感性的作用

探讨叉头盒蛋白M1（FOXM1）对人宫颈癌细胞株Hela/DDP顺铂化疗敏感性的作用。方法 将含有正义FOXM1 互补的脱氧核糖核酸（cDNA）的真核表达载体、空质粒的真核表达载体采用脂质体转染法转染至人宫颈癌细胞株Hela/DDP,分别记为过表达组、过表达对照组;另构建干扰FOXM1基因表达的重组载体、空载载体,利用脂质体介导将其转染至人宫颈癌细胞株Hela/DDP,分别记为沉默组、沉默对照组;并设置空白组、抑制剂组。上述每组5个复孔,均加入顺铂,抑制剂组另加入硫链丝菌肽,培养48 h。实时逆转录荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测各组FOXM1 信使核糖核酸（mRNA）及蛋白表达;倒置显微镜观察细胞形态学改变;噻唑蓝（MTT）法检测各组细胞增殖抑制率;流式细胞仪双染法检测各组细胞凋亡率;RT-qPCR、Western Blot检测各组细胞周期蛋白B1（Cyclin B1）、细胞分裂周期因子25B（CDC25B）、存活蛋白（Survivin）、p21 mRNA及蛋白表达。结果 与空白组比较,沉默组和抑制剂组FOXM1、Cyclin B1、CDC25B、Survivin mRNA及蛋白表达均下降（P＜0.05）,过表达组上述指标均升高（P＜0.05）;与空白组比较,沉默组和抑制剂组增殖抑制率、凋亡率、p21 mRNA及蛋白表达均升高（P＜0.05）,过表达组上述指标均下降（P＜0.05）;空白组、沉默对照组、过表达对照组细胞连接紧密、形态均匀、轮廓清楚,过表达组细胞连接致密,沉默组和抑制剂组细胞减少,轮廓不清、形态不均、大小不一,且可见细胞皱缩及细胞碎片。结论 FOXM1表达下调可增加人宫颈癌细胞株Hela/DDP顺铂化疗敏感性,FOXM1表达上调则可降低其化疗敏感性,推测与正反馈调节Cyclin B1、CDC25B、Survivin表达,负反馈调节p21表达有关。     

YB-1高表达与宫颈癌患者预后的关系

目的研究YB-1在宫颈癌中的高表达与宫颈癌病人预后的关系。方法用免疫组化方法,分析2002年1月～2009年1月经病理证实的46例宫颈癌标本组织中YB-1的表达,探讨YB-1与宫颈癌的关系,并用SPSS软件对结果进行分析。结果 YB-1高表达的宫颈癌患者复发率更高,并且有更短的无病进展期（P=0.035）和总的生存时间（P=0.013）,多因素回归分析显示YB-1高表达是宫颈癌的独立预后因素。结论本项研究中,YB-1高表达患者预后差,YB-1高表达可能是宫颈癌独立预后因素。     

HPV永生化细胞系与SiHa细胞系蛋白质表达差异的质谱分析

目的：分析人乳头瘤病毒（HPV）永生化细胞系与SiHa细胞系之间的蛋白质表达差异,探讨从HPV感染到宫颈癌发生间的变化。方法高效液相色谱（LC）与质谱（MS）联用对HPV永生化细胞系与SiHa细胞系的蛋白质进行鉴定,然后通过蛋白质组学和生物信息学分析两种细胞系之间的蛋白表达,及一种新型翻译后修饰－琥珀酰化修饰的差异。结果在两种细胞系中,质谱鉴定到的蛋白总数为10691个,琥珀酰化修饰位点共6342个;非标定量分析共发现572种差异表达蛋白。HPV永生化细胞系中高表达的273种蛋白多集中在疾病的相关通路,而宫颈癌细胞系中高表达的299种蛋白多集中在代谢通路和核糖体通路。琥珀酰化修饰无差异,但发现一个新的琥珀酰化修饰位点———血清和糖皮质激素激酶1（SGK1）K41琥珀酰化。结论与HPV永生化细胞系相比,SiHa细胞系代谢能力及翻译蛋白能力更强;而HPV永生化细胞中高表达蛋白则大多与疾病相关,且更易发生恶化。     

人乳头状瘤病毒L1壳蛋白对宫颈癌前病变及宫颈癌的诊断价值分析

目的 探讨人乳头状瘤病毒(HPV)L1壳蛋白在不同宫颈病变中的表达情况及相关性.方法 选择2011年1月～2013年1月于新疆维吾尔自治区人民医院妇科就诊的高危型HPV阳性宫颈病变患者171例作为研究对象,其中慢性宫颈炎组23例,宫颈上皮内瘤变组121例(CINⅠ组48例、CINⅡ组34例、CINⅢ组39例)、宫颈鳞状细胞癌(SCC)组患者27例,采用免疫组化方法检测HPV L1壳蛋白在5种宫颈病变组织的表达情况.结果 171例患者中,HPV L1阳性表达63例,阳性率为36.8％,其中在慢性宫颈炎患者中,HPV L1蛋白阳性表达为17例,阳性率为73.9％;CIN Ⅰ患者中,HPV L1蛋白阳性表达为32例,阳性率为66.7％; CINⅡ患者中,HPV L1蛋白阳性表达为12例,阳性率为35.3％;CINⅢ患者中,HPV L1蛋白阳性表达为2例,阳性表达率为5.1％,SCC组中无HPV L1蛋白表达.五组患者HPV L1蛋白阳性表达率整体比较,差异有统计学意义(P＜0.05);炎症组与CINⅡ组、CINⅢ组、SCC组比较,差异有统计学意义(P＜ 0.05);CINⅠ组与CINⅡ组、ClNⅢ组、SCC组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).以患者的病理检查结果作为金标准,绘制ROC曲线,面积为0.799,标准误为0.062,95％CI为0.677～0.921,灵敏度为0.769,特异度为0.750.结论 HPVL1壳蛋白在宫颈上皮内瘤变中的阳性表达随病变程度的加重而呈下降趋势,提示其有望成为预测宫颈癌前病变程度的标志物,对于宫颈癌前病变的筛查和预防具有重要的意义.