单探针与混合探针底物法在细胞色素P450酶底物酶促动力学中的比较研究

[目的] 研究5种细胞色素P450酶亚型的特异性探针底物非那西丁（CYP1A2）、右美沙芬（CYP2D6）、甲苯磺丁脲（CYP2C9）、奥美拉唑（CYP2C19）、咪达唑仑（CYP3A4）在人和大鼠肝微粒体中的酶动力学特征,比较两种探针底物法的适用性。[方法] 5种特异性探针底物分别经人或大鼠的肝微粒体代谢反应后,采用高效液相色谱法测定特异性探针底物的代谢速率,根据底物浓度-代谢速率曲线计算酶动力学常数。[结果] 单探针与混合探针两种方法在人肝微粒体中所得的V_max、K_m值具有一致性;而在大鼠肝微粒体中所得的K_m具有一定差异,表明该混合探针底物法在用于药物对大鼠肝微粒体中的细胞色素P450酶活性评价时可能会出现一定程度的影响。[结论] 在人肝微粒体中,两种探针底物法的V_max、K_m值具有一致性,因而混合探针底物法可代替单探针法用于细胞色素P450酶活性评价;在大鼠肝微粒体中,探针底物混合后可使得部分探针底物的K_m值升高,与酶亲和力下降,在细胞色素P450酶活性评价中可能出现假阴性结果。     

壮骨关节丸对大鼠肝微粒体P450的影响

[目的] 考察壮骨关节丸对大鼠肝微粒体细胞色素P450的影响。[方法] 壮骨关节丸及其两个新工艺按含生药2.1 g/kg连续给大鼠灌胃7 d,末次药后24 h断头处死大鼠并取肝脏,用钙沉降法制备肝微粒体。在体外用含氨苯砜、非那西丁、奥美拉唑、氯唑沙宗的cocktail探针代谢来考察肝微粒体CYP3A、CYP1A2、CYP2C19、 CYP2E1的活性。[结果] cocktail探针在体外肝微粒体系统中代谢1 h后,包括壮骨关节丸及其两个新工艺的给药组剩余氯唑沙宗浓度显著高于对照组,而奥美拉唑、非那西丁、氨苯砜浓度与对照组之间差异无统计学意义。[结论] 壮骨关节丸可以抑制大鼠肝脏CYP2E1活性,但对CYP1A2、CYP3A及CYP2C19无显著影响。     

合成冰片对大鼠肝CYP450酶含量及CYP3A1 mRNA表达的影响

[目的]研究冰片对大鼠肝脏细胞色素氧化酶(cytochromeP450,CYP450)含量及其亚型CYP3A1m RNA表达的影响。[方法]istar大鼠合成冰片(设0.3gk/g和0.03gk/g剂量组,1次d/,连续7d)灌胃,以溶媒羧甲基纤维素纳(CM C-Na)和苯巴比妥钠为对照组,钙沉积法提取肝微粒体,紫外分光光度法测定CYP450含量,实时定量RT-PCR法检测肝脏CYP3A1m RNA的表达。[结果]0.3gk/g合成冰片口服可诱导大鼠肝脏CYP450酶含量增高(P<0.05),CYP3A1m RNA表达上调(P<0.05)。[结论]高剂量合成冰片口服可能影响肝脏药物代谢。     

阿德福韦混膦酯衍生物体外代谢及稳定性研究

采用超高效液相-飞行时间质谱仪(UPLC-QTOF-MS/MS)和超高效液相-三重四极杆质谱仪(UPLC-MS/MS)考察阿德福韦混膦酯衍生物阿德福韦单L-硫代异亮氨酸乙酯、去氧胆酸丙酯(Q₃-I₂)的稳定性及体外代谢产物,将Q₃-I₂和对照药阿德福韦酯与人工胃液、人工肠液、大鼠空白血浆和大鼠肝微粒体进行体外共孵育,采用UPLC-MS/MS和UPLC-QTOF-MS分别测定各孵育体系中的化合物剩余质量浓度和肝微粒体体系中的代谢产物,并通过底物消除法计算半衰期和清除率。化合物Q₃-I₂在胃肠道中稳定,延长了血浆、肝微粒体半衰期,同时能降解出活性代谢产物。在体外肝微粒体孵育体系中通过UPLC-QTOF-MS正负离子模式共检测到8种代谢产物,主要包括水解、氧化、乙酰化、葡萄糖醛酸化反应。     

东莨菪内酯在大鼠肝微粒体孵育体系中的代谢产物分析及其含药血清对大鼠肝星状细胞的影响

目的探讨东莨菪内酯在大鼠肝微粒体孵育体系中的代谢产物及其含药血清对大鼠肝星状细胞的影响。方法应用高分辨液质联用技术对东莨菪内酯在大鼠肝微粒体孵育体系中的代谢产物进行分析,并观察其含药血清对大鼠肝星状细胞的影响。采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2. 1 mm内径1. 8μm)和0. 1%甲酸水溶液-0. 1%甲酸乙腈流动相进行梯度洗脱,通过高分辨的二级质谱分析东莨菪内酯的代谢产物。制备各组大鼠含药血清分别运用Annexin V-APC单染法和MTT法检测含药血清诱导大鼠HSC凋亡及抑制其增殖的情况。结果通过大鼠肝微粒体孵育体系统初步鉴定了3个东莨菪内酯的代谢产物,提示其主要代谢途径为脱甲基化和葡萄糖醛酸化反应。含药血清有较弱的诱导大鼠HSC凋亡、抑制HSC增殖作用。结论结合先前的研究,东莨菪内酯的抗肝纤维化作用不直接作用于HSC,应结合其代谢产物情况,进一步进行其作用机制的深入研究,以明确其作用靶点。     

Liguzinediol在不同种属肝微粒体中代谢产物的比较研究

目的 比较研究不同种属间liguzinediol的体外代谢产物。方法 建立liguzinediol及其体外代谢产物的LC-MS/MS检测方法,采用肝微粒体温孵法研究liguzinediol在大鼠、犬、猴、人等多种属肝微粒体中的代谢产物。结果 liguzinediol在肝脏可发生Ⅰ相和Ⅱ相代谢,并且在大鼠、犬、猴、人肝微粒体温孵体系中均孵育有氧化产物和葡萄糖醛酸结合产物。结论 liguzinediol在大鼠、犬和猴等动物的肝微粒体中的Ⅰ相和Ⅱ相代谢产物与人肝微粒体基本一致,该研究结果可为liguzinediol临床前安全性评价的实验动物选择提供依据。      

金三莪对实验性肝纤维化大鼠TGF-β1、Smad3、Smad7及CTGF表达的影响

[目的]观察中药金三莪抗四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的疗效及作用机制。[方法]将50只Wistar大鼠分为正常对照组、模型对照组、中药治疗1组及2组,于造模第1周及第4周开始用金三莪治疗。免疫组化技术检测转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3、Smad7及结缔组织生长因子(CTGF)在肝内表达及其在细胞中的定位,肝组织电镜检查,放射免疫法检测血清透明质酸(HA)含量。[结果]经中药金三莪治疗后肝纤维化大鼠肝组织内TGF-β1、Smad3及CTGF表达降低,而Smad7的表达增加,TGF-β1、Smad3及CTGF的免疫阳性反应信号主要位于纤维间隔中的细胞浆,Smad7则主要在肝细胞浆表达。电镜检查中药治疗组大鼠肝细胞结构趋于正常,纤维组织变薄。模型组血清HA含量明显高于正常组(P<0.01),中药治疗1、2组血清HA含量明显低于模型组(P<0.05)。[结论]中药金三莪能有效地减轻四氯化碳诱导肝纤维化大鼠的损伤及纤维化程度,其机制可能是抑制肝内TGF-β1、Smad3及CTGF并促进Smad7表达。     

配伍对化瘀通脉方中丹参在大鼠体内的药动学影响

[目的]研究化瘀通脉方在大鼠体内的动力学特征及其不同配伍对组方中有效成分在体内吸收、分布和代谢的影响。[方法]采用Irregular-HC₁₈(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相甲醇-1%冰醋酸(40:60),柱温30℃,波长280 nm,测定灌胃化瘀通脉方及其不同配伍组方后的大鼠血浆和组织中的药物浓度,Kinetica 5.0软件对数据进行统计分析。[结果]建立了同时测定大鼠血浆及组织样品中丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛和阿魏酸四种成分的高效液相色谱(HPLC)法,该方法的精密度、稳定性及回收率等均符合要求,线性关系良好。[结论]配伍对化瘀通脉方中丹参素在大鼠体内吸收、分布和代谢均具有积极的影响。     

柴胡、黄芩及其配伍抗大鼠肝纤维化作用研究

[目的] 研究柴胡、黄芩配伍抗肝纤维化的作用。[方法] 采用饲喂高脂饲料,饮用10%乙醇及皮下注射四氯化碳(CCL4)的复合因素法建立大鼠肝纤维化模型,应用柴胡、黄芩及配伍进行干预,酶联免疫吸附法(ELISA法)检测大鼠血清中透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、层黏蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)的变化,探讨柴胡、黄芩及柴胡、黄芩2:1配伍对肝纤维化大鼠的影响。[结果] 柴胡-黄芩2:1配伍能降低综合因素所致肝纤维化血清中HA、PCⅢ和Ⅳ-C的浓度(P<0.05).[结论] 柴胡、黄芩及配伍具有一定抗肝纤维化作用。     

半楼贝蔹及配伍乌头对大鼠肝细胞色素P450酶含量的影响

[目的]研究中药十八反中半夏、贝母、栝楼、白蔹、白及配伍乌头对大鼠肝细胞色素P⁴⁵⁰ 酶含量的影响。[方法]采用紫外分光光度测定大鼠肝微粒体细胞色素P⁴⁵⁰与细胞色素b5含量。[结果]配伍组与其相应单药组比较可显著降低P⁴⁵⁰酶及b5含量(P<0.001或P<0.05)。[结论]药物配伍后导致P⁴⁵⁰酶变化,对药物的代谢产生影响。     

钩吻素子在人和猪、大鼠、猴、犬肝微粒体的酶促动力学及CYP450酶亚型分析

目的 研究和比较钩吻素子(KM)在人与各种实验动物肝微粒体体外代谢的酶促动力学及选择性CYP450酶抑制剂对其代谢的影响.方法 采用优化的反应体系和UPLC检测方法,测定系列浓度的KM与各种属肝微粒体孵育的降解曲线,以底物消除法计算酶动力学参数;共孵育方法考察选择性CYP450酶抑制剂对KM在各种属肝微粒体代谢的影响.结果 在人肝微粒体,KM的米氏常数(Km)、最大反应速率(Vmax)、半哀期(T1/2)、固有清除率(CLint)分别为(0.135±0.067)mmol/L、(1.89±0.19)μmol·min-1·g-1pro、(712±23)min和(15.7±5.2)mL·min-1·g-1pro.与人相比,犬、猪的Km值较大,大鼠及猴的CLint较高,4种实验动物的Vmax值均较大、T1/2均较短.酮康唑在各种属均可显著抑制KM代谢,在人、猪、犬IC50<1 μmol/L,在大鼠、猴IC50为1~10 μmol/L,可见CYP3A为主要代谢酶.噻氯匹定、奎尼丁和磺胺苯吡唑仅对大鼠,噻氯匹定仅对猴和犬的KM代谢为弱抑制(抑制率20.43%~44.31%),说明在体情况下,CYP2B、CYP2D和CYP2C与KM的代谢可能无关.结论 KM在人与猪、大鼠、犬、猴肝微粒体中的主要代谢途径相同,均由CYP3A酶催化,但酶活性和代谢动力学特征有一定差异.     

“Cocktail”体外探针法评价补骨脂素对人肝微粒体P450酶亚型活性的影响

[目的]利用Cocktail体外探针法,测定补骨脂有效成分补骨脂素对人肝微粒体多种P450酶亚型活性的影响,为补骨脂临床联合用药安全提供参考。[方法]建立液质联用方法,同时测定人肝微粒体P450酶中各探针代谢产物6α-OH紫杉醇、α-OH咪达唑仑、4-OH甲苯磺丁脲、去甲基右美沙芬、7-OH香豆素、对乙酰氨基酚和6-OH氯唑沙宗的含量。通过Cocktail体外探针实验中补骨脂素对人肝微粒体P450酶各亚型的影响,证明补骨脂对人体肝脏的代谢有影响作用。[结果]所建立的液质联用方法精密可靠,符合生物样品测定要求,可用于人肝微粒体中各P450酶探针的代谢产物的定量分析。与对照组相比,补骨脂素组各底物的转化率均下降,其中香豆素的转化率下降最为显著,补骨脂素对其转化的抑制率为95.84%,而紫杉醇的转化的抑制最不明显,仅为10.39%。补骨脂素对其他几种底物的转化抑制率均在82%～91%之间。[结论]补骨脂素对人肝微粒体的CYP1A2、2A6、2C8、2C9、2D6、2E1和3A4亚型均有抑制,其中对CYP2A6、1A2和2D6 3种亚型的影响较为显著,表明补骨脂素对人肝微粒体P450酶不同亚型影响差异显著,长期给药补骨脂应关注药物联合用药安全。     

过敏性鼻炎患者肺虚感寒证和肾阳亏虚证血清代谢组学研究

[目的] 基于气相色谱/质谱（GC/MS）技术的代谢组学方法,分析过敏性鼻炎肺虚感寒证和肾阳亏虚证患者血清中的内源性小分子代谢物变化,为两种中医证型的科学辨证提供依据。[方法] 采用GC/MS技术检测过敏性鼻炎患者肺虚感寒证、肾阳亏虚证以及正常人的血清中小分子代谢物,利用SIMCA-P软件进行主成分分析（PCA）及偏最小二乘判别法（PLSA-DA）分析,研究血清中小分子代谢物在各组间的差异。[结果] 过敏性鼻炎肺虚感寒证、肾阳亏虚证患者代谢谱具有良好的分离趋势,并与健康人对照组有明显区分。利用商业化的代谢物谱库（如Wiley和NIST质谱库）及本实验室建立的标准品代谢物谱库鉴定了23个具有统计学意义的差异代谢物。在过敏性鼻炎肺虚感寒证和肾阳亏虚证患者中筛选得到了丙氨酸、十四烷酸、十六烷酸、9,12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸6种差异代谢产物。[结论] 过敏性鼻炎肺虚感寒证和肾阳亏虚证的代谢差异主要体现在氨基酸代谢和脂肪酸代谢方面,基于GC/MS的代谢组学技术可用于临床不同中医证型的分类研究。     

HPLC-MS/MS法研究普萘洛尔对映体在不同种属肝微粒体中的代谢差异

目的 采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）建立R-（+）-普萘洛尔和S-（-）-普萘洛尔在肝微粒体孵育体系中的含量测定方法,并分别比较普萘洛尔不同对映体在大鼠、犬、猴以及人4种肝微粒体中的代谢特征。方法 分别将R-（+）-普萘洛尔和S-（-）-普萘洛尔溶解在由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）启动孵育的不同种属的肝微粒体中,在孵育不同的时间后加入乙腈终止反应。使用电喷雾离子源（ESI）,以卡维地洛为内标,在多反应监测模式（MRM）下进行正离子扫描,分别测定各孵育体系中R-（+）-普萘洛尔和S-（-）-普萘洛尔的浓度。以孵育0 min时不同构型的普萘洛尔的质量浓度为参照,分别计算R-（+）-普萘洛尔和S-（-）-普萘洛尔在不同肝微粒体样品中的药物剩余百分比和体外代谢半衰期和固有清除率。结果 普萘洛尔的线性范围为0.05～10.00μg/mL,定量下限为0.05μg/mL;日内、日间精密度的RSD%均小于13%。在4个种属的肝微粒体孵育体系中,R-（+）-普萘洛尔在大鼠肝微粒体中代谢快,在猴肝微粒体中次之,在犬和人肝微粒体中代谢慢,体外消除半衰期依次为大鼠<猴&l...     

芪莲纤化汤减轻大鼠慢性肝损伤的动态观察

[目的]通过对体质量、肝脏病理、肝功能等指标变化的检测,动态观察芪莲纤化汤减轻实验大鼠肝损伤的作用。[方法]采用四氯化碳(Cl₄)伤害的方法复制大鼠慢性肝损伤模型,中药组、西药组分别于造模开始时给予芪莲纤化汤、联苯双酯滴丸进行灌胃。于造模第1、2、3、4、5、6周末,观察大鼠的一般状况及血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)值;于第3、6周末,进行大鼠肝组织苏木精-伊红(HE)、Masson染色,以观察其组织病理学改变。[结果]芪莲纤化汤可以明显改善四氯化碳伤害所致大鼠的一般状况和肝脏病理学改变,降低血清ALT、AST的水平,提高ALB含量。[结论]芪莲纤化汤确可通过减轻肝脏的病理学改变、保护肝功能来减轻大鼠肝损伤的程度。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂S25的代谢稳定性和表型研究

目的:探讨抗癌药物组蛋白去乙酰化酶抑制剂S25在不同种属中代谢稳定性差异并确定S25药物的代谢表型。方法:将S25置于人、小鼠、大鼠、犬和猴的肝微粒体中孵育,运用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS/MS)方法检测经过孵育代谢后S25剩余浓度,分析其代谢稳定性并推导出其在体内的半衰期及清除率;通过肝微粒体中细胞色素P450酶(CYP450)同工酶特异性抑制剂的化学抑制剂方法鉴定S25在小鼠肝微粒体中的代谢表型。结果:S25在人、小鼠、大鼠、犬和猴5个种属肝微粒体中半衰期(t1/2)分别为45.00、187.30、43.31、130.75、198.00 min;肝微粒体中固有清除率CLint分别为30.8、7.4、32、10.6、7/m L·min-1·mg-1;在人肝微粒体中S25主要通过CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19催化代谢。结论:在肝微粒体研究体系中,S25通过多种酶催化而迅速代谢降解;该药在人和小鼠的代谢动力学无差异,小鼠肝微粒体代谢系统可用于S25在人体内发生不良反应的风险评估。     

黄芩拆分组分对正常大鼠物质代谢、能量代谢、内分泌系统及植物神经系统的影响

[目的]通过检测正常大鼠体内物质代谢、能量代谢、内分泌系统及植物神经系统相关酶的含量,考察黄芩拆分组分对其表达的影响,以阐述其寒热属性。[方法]将SD雄性大鼠随机分为空白对照组、全成分组、苷元组、苷类组、多糖组;连续灌胃给药15 d,留取肝脏、心脏、肌肉等脏器,检测物质代谢、能量代谢、内分泌系统及植物神经系统的相关指标。[结果]与空白组相比,黄芩全成分抑制物质代谢、能量代谢、内分泌系统及植物神经系统;苷元和苷类有明显的寒凉药的抑制趋势;多糖组的倾向不明显。[结论]总体来看,黄芩全成分具有寒性,再一次验证了黄芩的寒凉药性;同时可推断苷元和苷类的药性为寒凉,为黄芩寒凉药性的主要物质基础;初步推测多糖的药性可能为微寒,有待于进一步的探究。