RNA干扰STMN1基因表达通过Notch信号通路诱导胃癌细胞凋亡及增强化疗敏感性的研究

摘 要：［目的］ 探讨RNA干扰微管不稳定性蛋白(STMN1)基因表达通过Notch信号通路对胃癌细胞凋亡及化疗敏感性的影响。［方法］ RT-PCR及Western blotting分别检测人胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞MKN28、SGC7901、BGC823中STMN1 mRNA及蛋白表达;STMN1-siRNA转染BGC823细胞,同时设定对照组和阴性对照组,转染48h后RT-PCR及Western blotting分别检测STMN1 mRNA及蛋白表达;后续实验分为对照组、STMN1-siRNA组、顺铂组、STMN1-siRNA+顺铂组,细胞培养48h后,CCK8及流式细胞仪分别检测细胞增殖及凋亡情况;Western blotting检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、Notch1、Hes1蛋白表达。［结果］ STMN1在MKN28、BGC823、SGC7901胃癌细胞中的mRNA及蛋白表达均显著高于在GES-1细胞中的表达（P<0.05）,选择BGC823细胞作为研究对象;转染STMN1-siRNA后BGC823细胞中STMN1的mRNA及蛋白表达均显著低于对照组（P<0.05）;STMN1-siRNA组、顺铂组、STMN1-siRNA+顺铂组OD值及Notch1、Hes1蛋白表达均显著低于对照组,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达均显著高于对照组（P<0.05）,STMN1-siRNA+顺铂组OD值及Notch1、Hes1蛋白表达均显著低于STMN1-siRNA组和顺铂组,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达均显著高于STMN1-siRNA组和顺铂组（P<0.05）。［结论］ RNA干扰STMN1表达可通过抑制Notch信号通路增强顺铂对胃癌细胞增殖的抑制及凋亡的促进作用。     

HMGB1基因沉默促进多柔比星诱导的胃癌BGC-823细胞自噬及调亡

目的 探讨高迁移率族蛋白l（high-mobility group box 1,HMGBl）基因沉默对化疗药物多柔比星（doxorubicin, DOX）诱导BGC-823胃癌细胞发生自噬和凋亡的影响。方法 MTT、Western blotting和激光共聚焦显微镜观察方法分别检测DOX对BGC-823细胞增殖及微管相关蛋白轻链3- I （microtubule light chain- I,LC3I）、LC3II表达和自噬小体形成的影响。构建靶向HMGB1的shRNA载体pSuper-shHMGBl及其对照载体pSuper-shNC并转染BGC-823胃癌细胞,建立HMGBl稳定沉默的细胞系。DOX处理不同质粒转染组的BGC-823胃癌细胞,激光共聚焦显微镜观察HMGBl沉默对DOX诱导的自噬小体形成的影响,MTT法、流式细胞术分别检测对细胞增殖和凋亡的影响,Western blot检测对自噬及凋亡相关蛋白（HMGB1, LC3, Bcl-2,Bcl-XL, Mcl-1 and cleaved caspase-3）表达的影响。结果 DOX可上调LC3-II蛋白的水平和促进细胞自噬体的形成(P<0.001)。与对照组相比,HMGBl基因沉默可降低DOX诱导的自噬作用(P<0.001),并促进胃癌细胞发生凋亡[12.37±2.84 % vs 46.12±3.15%, P<0.05],上调激活型caspase-3的表达水平。进一步分析发现,DOX诱导胃癌细胞发生自噬时,抗凋亡蛋白骨髓细胞白血病蛋白1（Mcl-1）的降解增加,而Bcl-2和Bcl-XL表达无明显变化;HMGBl基因沉默可抑制DOX诱导的Mcl-1降解。结论 DOX可诱导胃癌细胞发生自噬;HMGB1基因沉默有助于逆转BGC-823胃癌细胞对DOX耐药性,促进胃癌细胞发生凋亡。     

MiR-374a通过PTEN/AKT信号通路调节乳腺癌细胞的增殖和凋亡

摘 要：［目的］ 探讨miR-374a在乳腺癌细胞增殖和凋亡中的作用，并进一步探讨其机制。［方法］ 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测人乳腺癌细胞MCF-7及正常人乳腺细胞Hs 578Bst的miR-374a及PTEN mRNA转录水平，Western blot法测定MCF-7、Hs 578Bst组细胞及对照、 miR-374a抑制剂组细胞的PTEN、p-AKT蛋白表达变化，用CCK-8法及Tunel法分别观察对照组和miR-374a抑制剂组细胞的增殖和凋亡，并用Western blot法检测两组细胞的凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9表达。［结果］ 与人正常乳腺Hs 578Bst细胞相比，乳腺癌MCF-7细胞的miR-374a表达水平显著性增高（P<0.001），PTEN mRNA及蛋白的表达水平显著性降低（P<0.001），而p-AKT蛋白表达水平明显升高（P<0.001）。miR-374a抑制剂可抑制乳腺癌细胞的增殖（P<0.001），并促进其凋亡的发生（P<0.001），降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平（P<0.001）的同时活化凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9（P<0.001）。miR-374a 通过靶点PTEN影响AKT通路，miR-374a组细胞PTEN mRNA表达水平显著性降低（P<0.001），而miR-374a抑制剂处理后，PTEN蛋白水平显著性升高（P<0.001），p-AKT表达降低（P<0.001）。［结论］ miR-374a在乳腺癌细胞高表达，并通过调节PTEN/AKT信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖，促进凋亡的发生。miR-374a/PTEN/AKT信号通路有望成为乳腺癌的新治疗靶点。     

PKM2对人胃癌细胞HMGB1释放的影响

目的:探讨M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)对胃癌细胞高迁移率族蛋白B-1(high mobility group box 1,HMGB1)释放的作用。方法:通过siRNA干扰抑制人胃癌BGC823细胞PKM2的表达,Western blot检测各组细胞PKM2蛋白的表达,以评价PKM2 siRNA的转染效率;CCK-8法检测各组细胞活力,分析干扰PKM2的表达对胃癌BGC823细胞增殖的影响;Western blot检测各组细胞HMGB1的表达以及ELISA检测各组细胞培养液HMGB1的水平,分析PKM2对胃癌BGC823细胞HMGB1的作用。结果:与空载体pU6组相比,PKM2 siRNA 组PKM2的表达显著降低(P＜0.01),表明siRNA有效地抑制胃癌BGC823细胞PKM2的表达;CCK-8结果显示,PKM2 siRNA 组细胞活力明显低于空载体pU6组(P＜0.001),表明干扰PKM2抑制胃癌BGC823细胞增殖;此外,PKM2 siRNA 组HMGB1的表达以及细胞外HMGB1的水平显著降低(P＜0.01),表明干扰PKM2抑制人胃癌BGC823细胞HMGB1的释放。结论:PKM2促进人胃癌BGC823细胞HMGB1的释放。     

冬凌草甲素逆转黑色素瘤细胞顺铂耐药的作用及机制

目的：探讨冬凌草甲素（Ori）逆转人黑色素瘤细胞顺铂（DDP）耐药的作用及其机制。方法：分别将黑色素瘤DDP耐药细胞A375/DDP和M14/DDP分为对照组、2μmol/L Ori组、4 mg/L DDP组和2μmol/L Ori+4 mg/L DDP组。CCK-8法、Transwell实验、Annexin Ⅴ-FITC/PI染色流式细胞术分别检测各组细胞的增殖活力、侵袭和迁移能力及凋亡水平，透射电子显微镜观察自噬小体，免疫荧光染色法观察微管相关蛋白轻链3(LC3)点状结构，WB法检测A375/DDP细胞自噬相关蛋白Beclin-1、p62、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的表达。结果:与4 mg/L DDP组相比，2μmol/L Ori+4 mg/L DDP组细胞增殖活力、迁移和侵袭能力均显著下降（均P<0.01），凋亡水平显著升高（P<0.01）。4 mg/L DDP组细胞中可见大量自噬小体以及LC3点状染色，但2μmol/L Ori+4 mg/L DDP组仅可见少量。与对照组相比，4 mg/L DDP组细胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达水平均显著升高（均P<...     

HMGB1 基因沉默促进多柔比星诱导的胃癌BGC-823细胞自噬及凋亡

目的：探讨高迁移率族蛋白1（high-mobility group box 1, HMGB1 ）基因沉默对化疗药物多柔比星（doxorubicin, DOX）诱导BGC-823胃癌细胞发生自噬和凋亡的影响。方法：MTT、Western blotting和激光共聚焦显微镜分别检测DOX对BGC-823细胞增殖及微管相关蛋白轻链3-Ⅰ （microtubule light chain-3Ⅰ,LC3Ⅰ）、LC3Ⅱ表达和自噬小体形成的影响。构建靶向 HMGB1 的shRNA载体pSuper-shHMGBl及其对照载体pSuper-shNC并转染BGC-823胃癌细胞,建立 HMGB1 稳定沉默的细胞系。DOX处理不同质粒转染组的BGC-823胃癌细胞,激光共聚焦显微镜观察 HMGB1 沉默对DOX诱导的自噬小体形成的影响,MTT法、流式细胞术分别检测对细胞增殖和凋亡的影响,Western blotting检测对自噬及凋亡相关蛋白（HMGB1、LC3、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1和激活型caspase-3）表达的影响。结果：DOX可上调BGC-823细胞中LC3-Ⅱ蛋白的水平和促进细胞自噬体的形成（ P <0.01 ）。与对照组相比, HMGB1 基因沉默可减少DOX诱导的胃癌细胞自噬\[(19.33±2.96)% v (71.67±3.38)%, P <0. 01 \],促进胃癌细胞发生凋亡\[（46.12±3.15）% vs （12.37±2.84）%, P <0.05\],上调激活型caspase-3的表达水平。进一步分析发现,DOX诱导胃癌细胞发生自噬时,Mcl-1的降解增加,而Bcl-2和Bcl-XL表达无明显变化; HMGB1 基因沉默可抑制DOX诱导的Mcl-1降解。结论：DOX可诱导BGC-823胃癌细胞发生自噬, HMGB1 基因沉默有助于逆转胃癌细胞对DOX的耐药性,促进胃癌细胞发生凋亡。     

miR-216b-5p靶向ATG5介导自噬逆转食管癌Eca109细胞的顺铂耐药性

目的：探讨miR-216b-5p 对食管癌Eca109 细胞顺铂（DDP）耐药性的影响及其作用机制。方法:采用qPCR 法检测miR-216b-5p 在食管癌细胞TE-1、KYSE-150、Eca109 和耐药细胞Eca109/DDP 中的表达水平。利用脂质体转染技术分别将miR-216b-5p mimic 及mimic NC、自噬相关蛋白5（ATG5）过表达质粒转染到Eca109/DDP 细胞中,用CCK-8、EdU 法和FCM分别检测转染后细胞的增殖和凋亡;mRFP-eGFP-LC3双荧光标记实验检测mRFP-eGFP-LC3慢病毒感染后各组细胞自噬发生情况, WB法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1和P62 表达。用荧光素酶报告基因实验验证miR-216b-5p与ATG5的靶向关系,WB法检测ATG5的表达。建立裸鼠Eca109/DDP细胞移植瘤模型,观察miR-216b-5p过表达对移植瘤生长的影响。结果：miR-216b-5p在TE-1、KYSE-150、Eca109 和Eca109/DDP 细胞中均呈低表达（均P<0.05）。过表达miR-216b-5p可显著抑制Eca109/DDP 细胞的增殖并诱导凋亡（均P<0.05）,减少细胞中自噬小体数量（P<0.05）,下调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin 1蛋白水平、上调P62 蛋白水平（均P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实miR-216b-5p靶向并负调控ATG5的表达（P<0.05）,过表达ATG5 可使miR-216b-5p mimic 对Eca109/DDP 细胞增殖、自噬的抑制作用和凋亡的诱导作用明显减弱（均P<0.05）,自噬相关蛋白P62 表达降低、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin 1 表达升高（均P<0.05）。荷瘤实验结果表明,miR-216b-5p 过表达可显著抑制裸鼠移植瘤的生长（P<0.05）。结论：miR-216b-5p过表达可逆转食管癌Eca109/DDP细胞对DDP的耐药性,其机制可能与靶向负调控ATG5表达并影响细胞自噬有关。     

阻抑素基因在诱导胃癌BGC823细胞凋亡过程中的作用研究

目的:研究阻抑素(prohibitin,PHB)基因在诱导胃癌BGC823细胞凋亡过程中的作用.方法:使用RNA干扰技术和基因转染技术,分别获得PHB基因低表达和高表达的胃癌BGC823细胞.然后采用MTT法和FCM法分别检测PHB基因低表达和高表达的胃癌细胞的增殖率、细胞周期和凋亡情况,Western印迹法检测Bax、Bcl-2和细胞质内细胞色素c的表达水平,并且检测 caspase-3和caspase-9的激活情况.结果:PHB基因转染胃癌BGC823细胞后,细胞生长速度减缓,G1期细胞所占比例明显下降,G2期细胞比例略有上升,S期细胞比例和细胞凋亡率明显上升,Bax表达上调,Bcl-2表达下调,细胞质内细胞色素c水平显著上升,caspase-3和caspase-9的激活程度增加.PHB基因特异性RNA干扰胃癌细胞BGC823后,细胞生长加速,G1期和G2期细胞所占比例变化不大,S期细胞比例略有上升,细胞凋亡率小幅下降,Bax表达下调,Bcl-2表达上调,caspase-3和caspase-9的激活程度减弱.结论:PHB是抑制胃癌细胞生长和诱导细胞凋亡的重要因子之一,推测该作用可能是通过线粒体途径实现的.     

EGFR对胃癌细胞SGC7901化疗敏感性及细胞中STAT3磷酸化水平的影响

目的:探讨表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)对胃癌细胞SGC7901化疗敏感性及细胞中信号转导和转录因子3(STAT3)磷酸化水平的影响.方法:收集胃癌组织及对应的癌旁组织,体外培养胃癌细胞MKM28、SGC7901、BGC823和胃黏膜上皮细胞GES-1,Western blot检测胃癌组织、癌旁组织及胃癌细胞MKM28、SGC7901、BGC823和胃黏膜上皮细胞GES-1中EGFR的表达水平.细胞转染小干扰RNA对照序列(siRNA control组)和EGFR小干扰RNA(EGFR siRNA组),同时设置对照组(只加入转染试剂)、化疗组(细胞培养液中加入8 μmol/L 5-氟尿嘧啶)、联合组(转染EGFR siRNA后的细胞,细胞培养液中加入8 μmol/L 5-氟尿嘧啶),培养48 h后,Western blot检测细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、信号转导和转录因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)、EGFR表达水平,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果:EGFR在胃癌组织中表达水平明显高于癌旁组织,在胃癌细胞中的表达水平明显高于胃黏膜上皮细胞.EGFR siRNA组细胞中EGFR水平明显降低.EGFR siRNA组、化疗组、联合组细胞存活率及p-STAT3表达水平明显低于对照组,而凋亡率及细胞中Cleaved Caspase-3水平明显高于对照组。联合组细胞存活率及p-STAT3表达水平明显低于化疗组,而凋亡率及细胞中Cleaved Caspase-3水平明显高于化疗组。结论:EGFR在胃癌中过表达.抑制EGFR表达后,胃癌细胞增殖受到抑制,凋亡增多,化疗敏感性增加,作用机制可能与STAT3磷酸化水平有关.     

ATG7对神经母细胞瘤增殖和耐药的影响及机制研究

摘 要：［目的］ 研究自噬相关基因ATG7对神经母细胞瘤增殖和化疗耐药性的影响,初步探索其分子机制,为神经母细胞瘤临床治疗提供新的线索和理论依据。［方法］ 在神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y和SK-N-BE2中,慢病毒转染敲减ATG7基因,采用MTT染色检测ATG7对细胞增殖能力的影响,同时通过Western blotting方法检测细胞内自噬标志性蛋白LC3表达量来反映细胞内自噬水平;通过检测Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相关蛋白研究ATG7对细胞凋亡的影响。SH-SY5Y细胞经阿霉素处理后,采用实时无标记细胞分析仪连续监测细胞增殖情况,探讨ATG7在神经母细胞瘤耐药中作用。［结果］ 敲减ATG7基因能显著抑制细胞内自噬水平,而且ATG7敲减后细胞在第4、5d的增殖倍数分别为3.05±0.05和3.92±0.08,低于对照组的3.40±0.05和4.35±0.13（P=0.0012,P=0.0085）;与对照组相比,ATG7敲减组其凋亡抑制蛋白Bcl-2表达明显降低,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达显著升高（P<0.05）。经阿霉素处理后,ATG7敲减组细胞增殖率明显低于对照组（P<0.05）。［结论］ 由于ATG7基因介导细胞自噬过程,ATG7基因在神经母细胞瘤中可能通过自噬作用促进肿瘤细胞异常增殖,抑制细胞凋亡,进而增强细胞耐药性。