血小板活化因子受体在人皮肤角质形成细胞中的表达及其调控

目的:观察血小板活化因子受体(PAF-R)在正常人皮肤角质形成细胞中的表达调控特征.方法:应用免疫组织化学法检测PAF-R在正常皮肤组织及HaCaT细胞中的表达,采用RT-PCR法检测PAF-R在HaCaT细胞基因水平的表达特征,并用流式细胞术定量检测刺激因素作用下HaCaT细胞中PAF-R的表达调控情况.结果:PAF-R在正常人角质形成细胞中有强烈的表达,阳性部位位于细胞膜及细胞质.PAF-R在HaCaT细胞转录水平有表达,且组织型mRNA产物高于白细胞型mRNA产物.PAF-R在HaCaT细胞膜内外均有阳性表达,细胞内表达量约是膜表达量的4.82倍.IFN-γ、维甲酸可以上调PAF-R在HaCaT细胞的膜表达量.结论:皮肤角质形成细胞在细胞、蛋白及基因水平均有PAF-R强烈表达,而且这种表达可被炎症因子调控,提示PAF系统可能在皮肤炎症中起重要作用.     

人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养

目的：建立一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法。方法：采用两步消化法对皮肤进行消化，获取角质形成细胞进行体外无血清培养基培养，进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析。结果：该方法可获取较多高纯度的角质形成细胞，且在体外可快速稳定增殖。结论：两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法。     

人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究

目的建立人皮肤角质形成细胞(keratinocyte)成纤维细胞(fibmblast)原代培养和体外连续培养的模型，为组织工程化皮肤提供充足的种子细胞。方法以5-15岁小儿包皮为材料，胰蛋白酶消化后，分离两种细胞，分别用无血清表皮培养液(K-SFM)、DMEM(10％血清)培养，对年轻细胞(2-4代角质形成细胞，10-40代成纤维细胞)均用倒置显微镜进行大体观察，透射电镜进行超微结构观察，并拍照记录，同时进行免疫细胞化学鉴定。结果消化后得到大量细胞，在培养2周后开始传代，光镜下角质形成细胞呈典型铺路石状，透射电镜下呈多边形，符合角质形成细胞特征；成纤维细胞光镜下呈梭形，放射状或漩涡状排列，电镜证实是成纤维细胞。免疫细胞化学检测：角质形成细胞鼠抗人角蛋白(AE1／AE3)单克隆抗体(mouse anti-cytokeratin)染色阳性；成纤维细胞鼠抗人Ⅰ型，Ⅲ型胶原单克隆抗体(mouse anti-TypeⅠ，ⅢCollagen)和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(mouse anti-vim-entin)染色阳性。结论用简便易行，经济实用的方法在体外对角质形成细胞和成纤维细胞进行分离、培养和传代，能同时得到足够数量的组织工程皮肤的种子细胞。     

在培养的角质形成细胞和成纤维细胞中年龄与黑色素细胞刺激因子的相关性

背景:多数与老化有关的皮肤改变由光老化引起,且反映了累积接受光暴露的情况。尽管光化性损伤在皮肤色素沉着中起主要作用,但调查细胞的生理性老化对色素沉着的影响也很重要。皮肤的主要细胞组成除黑色素细胞外还有角质形成细胞和成纤维细胞。这些细胞的年龄相关的变化对皮肤色     

人皮肤角质形成细胞的制备及体外培养

目的 探讨人皮肤角质形成细胞制备及体外培养的方法.方法 皮肤标本用胰酶、胰酶＋分离酶（dispase酶）2种方法消化,并分别以DMEM培养基、RPMI 1640培养基、限制性角质形成细胞无血清培养基（KC-FSM培养基）培养,MTT法通过比色分析测定培养48 h、72 h后细胞的光密度值（D值）,以判断不同培养基对角质形成细胞增殖的影响.结果 胰酶＋分离酶消化可获得较纯的原代角质形成细胞,细胞在限制性KC-FSM培养基中生长良好,培养48 h、72 h后测得的D值显著高于DMEM培养基和RPMI 1640培养基（P＜0.05）.结论 胰酶＋分离酶消化、限制性KC-FSM培养基体外培养是制备和培养人皮肤角质形成细胞的好方法.     

成人不同部位角质形成细胞的生物学特性比较

目的:观察成人不同部位角质形成细胞的生物学差异,探讨用来构建自体组织工程皮肤的最佳表皮细胞来源. 方法: 体外分离培养成年男性头皮、躯干、下肢及包皮来源的角质形成细胞,分别利用绘制细胞生长曲线、3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入、流式细胞仪检测等方法比较细胞在生长增殖、细胞周期及代谢等方面的生物学差异. 结果: 在细胞的生长增殖及DNA合成代谢方面,头皮与包皮来源的角质形成细胞之间无统计学差异(P>0.05),躯干与肢体来源的细胞之间亦无统计学差异(P>0.05),但前两者均高于后两者(P<0.05);细胞周期分析表明,头皮及包皮来源的角质形成细胞S期比例高于躯干及肢体组. 结论: 头皮及包皮组织来源的角质形成细胞可作为构建自体组织工程皮肤的表皮细胞来源.     

硫酸镍诱导人角质形成细胞NFκB活性和表皮ICAM-1的表达

目的探讨接触性致敏原硫酸镍（NiSO4）对表皮的细胞间黏附分子1（ICAM-1）及角质形成细胞核转录因子（NFκB）活化的影响。方法细胞免疫化学法检测NFκB活化;组织免疫化学法检测ICAM-1的表达。结果硫酸镍可增加角质形成细胞NFκB（P65）核转位活性（P〈0．01）,并使表皮ICAM-1表达显著上调（P〈0．05）。结论硫酸镍可刺激体外培养皮肤组织的表皮高表达ICAM-1,NFκ3的被激活可能是硫酸镍致敏的途径之一。     

人表皮角质形成细胞的体外改良培养

目的:探讨人表皮角质形成细胞的体外改良培养方法。方法:取皮肤标本,先用 2. 5g/L胰蛋白酶 4℃浸泡 22h(冷消化法),以便于表皮真皮分离;分离后刮除真皮面 (真皮刮除法 )以获取基底细胞;收集表皮及基底细胞并混合,制成细胞悬液进行培养。培养至第 5d,采用人工纯化法去除成纤维细胞。其他操作同人表皮细胞常规培养法。培养结束后,以台盼蓝染色法检测细胞存活率,观察细胞生长状态,并与传统培养方法相比较。实验重复 3次。结果:改良组 3次培养细胞存活率分别为 87%, 91%和 95%,均高于对照组 ( 82%, 82%和 85% ) (P<0. 05)。改良组生长速度亦较快。结论:采用人工纯化法、冷消化法和真皮刮除法等改良方法可提高体外培养的人表皮角质细胞存活率及生长速度。     

角质形成细胞凋亡与银屑病病情的关系

目的：探讨角质形成细胞（KC）凋亡与银屑病病情的相关性。方法：比色法检测30例银屑病患者皮损中活性半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（caspase-3）的含量;TUNEL技术检测KC凋亡并计算凋亡指数（AI）;采用银屑病皮损面积和严重性指数（PASI）及局部病变的严重程度评分对其中26例寻常型银屑病患者予以病情程度评分。结果：30例银屑病中,脓疱型银屑病AI高于寻常型银屑病（P〈0．05）;26例寻常型银屑病患者中,进行期患者AI、活性caspase-3的含量均显著高于静止期和消退期（P〈0．05）;而静止期和消退期患者之间差别无统计学意义（P〉0．05）;PASI评分与AI及活性caspase-3含量之间均无直线相关性（P〉0．05）;银屑病皮损局部病变的严重程度评分与AI、活性caspase-3含量均呈直线正相关（P〈0．05）。结论：KC凋亡的程度与银屑病的不同型别、疾病的不同分期有关,与局部病变的严重程度有关,与银屑病病情严重性指数无关。     

人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养

目的 :建立一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法。方法 :采用两步消化法对皮肤进行消化 ,获取角质形成细胞进行体外无血清培养基培养 ,进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析。结果 :该方法可获取较多高纯度的角质形成细胞 ,且在体外可快速稳定增殖。结论 :两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法     

电离辐射诱导人正常角化细胞衰老死亡的作用机制研究

目的 研究电离辐射对人正常角化细胞的影响,探讨放射治疗引起口腔黏膜炎的可能作用机制.方法 原代培养正常人角化细胞在5 Gy辐射后,SA β-Gal染色法检测细胞衰老情况,CM-H2DCF-DH染色法检测细胞活性氧产生情况,实时荧光定量PCR检测氧化酶基因表达情况,γ-H2AX免疫荧光染色检测细胞DNA修复能力.结果 电离辐射可引起人正常角化细胞衰老死亡,细胞内活性氧大量产生,氧化酶基因表达明显增高,细胞DNA双链断裂.结论 电离辐射引起的正常角化细胞衰老死亡与活性氧产生和DNA损伤有关,这可能是放射治疗引起口腔黏膜炎的作用机制之一.     

角质细胞叉头框蛋白O1基因调节血管内皮生长因子A的表达

目的 通过体外实验在角质细胞中过表达或沉默叉头框蛋白O1 (FOXO1)基因,研究其对血管内皮生长因子A (VEGF-A)蛋白水平和转录活性的影响.方法 采用体外细胞培养和转染方法,分别用ON-TARGET plusSMART pool人FOXO1 siRNA和对照siRNA (ON-TARGET plus Non-targeting Control Pool)转染人永生化牙龈角质细胞(human immortalized gingival keratinocyte,HIGK),用免疫荧光法检测HIGK中FOXO1和VEGF-A的免疫荧光强度,荧光酶素实验分别检测FOXO1过表达和FOXO1沉默时VEGF-A的活性.结果 与未转染组相比,使用FOXO1 siRNA转染的HIGK中VEGF-A的蛋白水平降低了57％ (P＜0.05).荧光酶素实验分析结果显示,在HIGK中过表达FOXO1后VEGF-A的转录活性增加了2.1倍(P＜0.05),而FOXO1沉默时VEGF-A的转录活性减少了20％～43％(P＜0.05).结论 角质细胞中FOXO1参与VEGF-A的表达调控.     

基因干扰lncRNA SPRY4-IT1对GBC-SD细胞干样性及线粒体膜电位的影响

目的 通过基因干扰长链非编码RNA(lncRNAs)SPRY4-IT1,探究其对胆囊癌(GBC)细胞GBC-SD肿瘤干细胞样特性及线粒体膜电位变化的影响.方法 设计合成SPRY4-IT1 shRNA,将shRNA-SPRY4-IT1转染GBC-SD细胞,RT-PCR检测SPRY4-IT1的表达水平;BrdU染色检测细胞...     

FEZ1基因在食管鳞癌中的表达及意义

目的探讨肿瘤抑制基因FEZ1在食管鳞癌组织中的表达及其与食管鳞癌临床病理特征之间的关系。方法采用原位杂交法检测50例食管鳞癌及正常食管组织中FEZ1 mRNA的表达情况,采用Western blot法检测FEZ1蛋白在低分化食管癌细胞株EC-1和高分化细胞株EC9706中的表达,分析其与食管鳞癌患者各临床病理指标的关系。结果FEZ1 mRNA在食管鳞癌组织中的阳性表达率为42.0%,显著低于正常食管组织(86.0%)(P=0.000);随肿瘤分化程度的升高,FEZ1 mRNA的阳性表达率也逐渐增加(P=0.007),并且其在食管鳞癌组织中的阳性表达率与淋巴结转移密切相关(P=0.013)。Western blot结果显示FEZ1蛋白在食管癌低分化细胞株中的表达水平低于食管癌高分化细胞株,但差异无统计学意义(P=0.062)。结论在食管鳞癌组织中存在FEZ1基因的失表达,其缺失与食管鳞癌的分化和转移有关。     

TWEAK及Fn14在衰老大鼠血管平滑肌细胞中的表达及意义

目的 探讨肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)及其受体成纤维细胞生长因子诱导蛋白14(fibroblast growth factor-inducing protein 14,Fn14)对血管平滑肌细胞衰老的...     

乳腺癌特异基因1在乳腺癌表达的意义

目的 检测乳腺癌特异基因1(BCSG1)在乳腺癌中的表达,评价其表达与乳腺癌临床病理因素的相关性。方法 利用逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR法)检测28例乳腺癌、7例乳腺增生症及5例乳腺纤维瘤中BCSG1的表达。结果 28例乳腺癌中有BCSG1表达12例(42．9％),其中Ⅲ／Ⅳ期乳腺癌的表达率为69.2％(9／13例),乳腺良性病变中BCSG1无一例表达。BCSG1的表达与乳腺癌分期密切相关(P=0．02),与患者年龄、月经、肿瘤部位以及雌激素受体、孕激素受体、核增殖抗原、C—erbB2的表达等无相关性。结论 BCSG1可能是与肿瘤恶性进展有关的肿瘤标记物,是乳腺癌发生过程中的中晚期事件,为判定乳腺癌预后的新指标。     

毫米波对人角质形成细胞基因表达的影响

目的:研究低强度毫米波对人角质形成细胞(HaCaT)基因表达的影响。方法:采用30.16 GHz、强度为1.0和3.5 mW/cm2的毫米波分别每天连续辐照HaCaT细胞30 min。细胞经不同次数辐照后,用基因芯片技术筛选毫米波反应基因,并以RT-PCR验证基因芯片筛选得到的结果。结果:经基因芯片筛选和RT-PCR证实,30.16 GHz、3.5 mW/cm2的毫米波辐照4次后,人角质形成细胞PAR-2、ERGIC-53基因表达明显上调(相对值分别为1.72±0.11 vs 1.24±0.09、1.52±0.21 vs 0.86±0.09,P均<0.01),而经1次毫米波辐照的细胞,均未见上述基因表达上调;30.16GHz、1.0 mW/cm2的毫米波辐照4次后,ERGIC-53基因表达亦明显上调(相对值为1.49±0.19 vs0.84±0.09,P<0.01),而PAR-2基因表达未见明显改变。结论:毫米波辐照影响基因的表达,基因表达的改变与辐照功率密度的大小和次数有关。     

人白细胞介素-2基因在转染角质形成细胞中的稳定表达

目的观察人白细胞介素-2(IL-2)基因在转基因角质形成细胞中的稳定表达、分泌情况以及角质形成细胞作为基因治疗靶细胞的可行性. 方法分离原代皮肤角质形成细胞,无血清培养基培养,Lipofectamine介导转染,G418筛选,DNA斑点杂交、RNA斑点杂交、原位杂交、免疫组织化学、Western blot分析及MTT法检测IL-2在细胞中的表达及分泌情况. 结果 DNA斑点杂交、RNA斑点杂交、原位杂交及免疫组织化学染色均显示转染细胞组有阳性信号;Western blot分析显示转染组在相对分子质量(Mr)15000处出现一条特异性染色带,其大小与IL-2一致;第二代、第四代转染细胞培养上清中IL-2的活性分别是27.7 U*mL-1和15 U*mL-1. 结论外源基因在角质形成细胞中能稳定表达基因产物,并能分泌具有生物学活性的蛋白质,以角朊细胞作靶细胞进行基因转染、基因表达、甚至基因治疗的设计是可行的.     

人白细胞介素2基因转染角朊细胞稳定表达的检测

目的 观察人白细胞介素２（ＩＬ－２）基因皮肤角朊细胞中的稳定表达及分泌情况。方法 ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导法转染,以Ｇ４１８筛选出阳性克隆并做扩大培养用ＤＮＡ斑点杂交,ＲＮＡ斑点杂交,细胞铺片原位杂交,免疫组织化学,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交分析及噻唑蓝（ＭＴＴ）法检测外源基因在角朊细胞内的表达及分泌情况。结果 ＤＮＡ斑点杂交ＲＮＡ斑点杂交,原位杂交和免疫组织化学以均显著转染组有阳性信号,Ｗｅｓ     

快速老化小鼠耳蜗组织MeCP2的增龄性变化

目的 探讨快速老化小鼠听觉功能、以及耳蜗组织中甲基化结合蛋白-2(methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)的增龄性变化.方法 本研究选3、5、7、9月龄的快速老化小鼠亚系1(Senescence acceler-ated mouse/prone 1,SAMP 1)作为实验组.而同龄抗快速老化亚系1(Senescence accelerated mouse/resistance 1,SAMK 1)作为SAMP 1的正常对照组.应用听觉诱发反应仪检测其听觉脑干反应阈值;应用RT-PCR和Western印迹杂炙对耳蜗组织中MeCP2 mRNA和蛋白的表达水平进行半定量分析.结果 第7、9月龄SAMP 1脑干反应阅值较同龄SAMR 1明显增高(P<0.05);MeCP2 mKNA和蛋白在不同月龄快速老化小鼠耳蜗组织中均有表达,第7、9月龄SAMP 1小鼠耳蜗组织中的MeCP2 mRNA和蛋白较同龄SAMR 1小鼠明显降低(P<0.05).结论 MeCP2 mKNA和蛋白的表达水平随着快速老化小鼠听觉功能增龄性减退而降低,说明MeCP2可能与维持耳蜗的功能状态有关.