姜黄素影响N2a/APP695swe细胞中ABCA1表达的机制研究

目的：研究姜黄素（Curcumin）对N2a/APP695swe细胞钙调神经磷酸酶（Calcineurin,CaN）活性和三磷酸腺苷结合转运子A1（ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1）表达的影响;探讨Curcumin影响N2a/APP695swe细胞中ABCA1表达的可能机制。方法：MTT法分别检测1、5、10、20、40 μmol/L Curcumin或0.1、0.5、1、2、4 μmol/L CaN活性抑制剂环孢素A（Cyclospo－rinA,CsA）对N2a/APP695swe细胞存活率的影响;依据MTT筛选结果,分为正常对照组、模型组、Curcumin组：5 μmol/L Cur－cumin处理24 h的N2a/APP695swe细胞、CsA组：0.5 μmol/L CsA处理48 h的N2a/APP695swe细胞。酶底物显色法检测CaN活性,real-time PCR、Western blot检测ABCA1表达水平的变化。结果：与未处理组比较,5 μmol/L Curcumin组细胞存活率[（110.495±4.005）%]最高（P=0.023）;0.1、0.5、1、2、4 μmol/L CsA组细胞存活率依次为（105.532±4.292）%、（115.211±4.826）%、（76.317±4.475）%、（69.177±5.267）%、（54.687±3.912）%,与未处理组比较,0.5、1、2、4 μmol/L CsA组差异均有统计学意义（P值依次为0.001、0.000、0.000、0.000）;酶底物显色法显示与正常对照组[（18.519±1.664） nmol/mg]比较,模型组CaN活性[（24.488±3.041） nmol/mg]增加（P=0.007）,Curcumin组[（16.717±2.055） nmol/mg]、CsA组[（4.928±1.232）nmol/mg] CaN活性明显受到抑制（P值依次为0.002、0.000）;real-time PCR和Western blot显示Curcumin组ABCA1表达量（real-time PCR：1.988±0.355;West－ern blot：0.294±0.015）高于模型组（real-time PCR：1.000±0.000;Western blot：0.175±0.008）,差异有统计学意义（real-time PCR：P=0.009;Western blot：P=0.000）;与模型组比较,CsA组（real-time PCR：4.000±0.464;Western blot：0.470±0.016）的ABCA1表达水平增加（real-time PCR：P=0.000;Western blot：P=0.000）。结论：Curcumin能上调N2a/APP695swe细胞中ABCA1的表达,其机理可能与抑制CaN活性有关。     

姜黄素改善N2a/APP695swe细胞线粒体功能和抑制细胞凋亡的作用

目的：观察姜黄素（curcumin）对N2a/APP695swe细胞线粒体形态和功能及细胞凋亡的影响;探讨其可能的神经保护机制。方法：实验细胞分为4个组：N2a/APP695组（WT）、N2a/APP695swe组（APP）、溶剂对照组（DMSO,5 μmol/L）、姜黄素组（Curcumin,5 μmol/L）。流式细胞术分别检测细胞凋亡、活性氧水平和膜电位水平、免疫细胞化学检测细胞色素C的表达、电镜观察细胞线粒体形态的改变,Western blot检测Caspase3、Caspase9蛋白表达,分光光度检测Caspase3、Caspase9酶活性。结果：流式细胞术结果显示,Curcumin组细胞的凋亡率、活性氧水平较APP组明显降低[（0.05±0.01） vs. （0.18±0.01）,P=0.000;（49.67±4.16） vs. （197.67±8.08）,P=0.000];而Curcumin组线粒体膜电位较APP组升高[（1.00±0.03） vs. （0.64±0.03）,P=0.000]。电镜结果发现姜黄素可以减轻线粒体的肿胀,改善其形态。同时免疫细胞化学结果显示姜黄素减少了细胞色素C的释放。Western blot检测发现,与APP组相比,Curcumin组Caspase3、Caspase9蛋白的表达均降低[（0.62±0.12） vs. （1.39±0.10）,P=0.000;（0.64±0.20） vs. （1.78±0.03）,P=0.000];并且Curcumin组较APP组的Caspase3与Caspase9的活性明显降低[（0.66±0.04） vs. （2.12±0.06）, P=0.000;（0.58±0.04） vs. （0.93±0.03）, P=0.000]。结论：姜黄素能抑制N2a/APP695swe细胞的凋亡,其机制可能与改善线粒体功能有关。     

TGF-β1通过Jagged1/Notch激活小鼠肝星状细胞

目的：研究转化生长因子-β1（transforming growth factor β1,TGF-β1）激活小鼠肝星状细胞（mouse hepatic stellate cells,mHSC）的具体机制。方法：实验选用mHSC-T25细胞株为实验对象,随机分为激活组（mHSC-T25+10 ng/mL TGF-β1）、抑制组（mHSC-T25+1 μmol/L TGF-β-R1抑制剂）和对照组（mHSC-T25）。qRT-PCR检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、TGF-β1、转化生长因子β受体1（transforming growth factorβreceptor1,TGF-β-R1）、Jagged1、血管内皮生长因子（vas－cular endothelial growth factor,VEGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）等的mRNA表达;细胞免疫荧光法检测α-SMA、Jagged1等蛋白的表达;Western blot检测TGF-β1、α-SMA、TGF-β-R1、Jagged1、Smad2/3、p-Smad2/3等蛋白的表达。结果：①TGF-β1刺激组中α-SMA、TGF-β1、TGF-β-R1、Jagged1、VEGF、HGF等mRNA表达量均较对照组明显增加而抑制组均明显下降。α-SMA：激活组（315.1±6.2）%,抑制组（34.3±4.5）% （F=3291.956,P=0.000）;TGF-β1：激活组（524.8±14.3）%,抑制组 （29.0±10.7）%（F=469.534,P=0.000）;TGF-β-R1：激活组（235.5±15.2）%,抑制组（17.0±2.8）%（F=392.239,P=0.000）;Jagged1：激活组（548.7±16.6）%,抑制组（17.4±4.7）%（F=364.166,P=0.000）;VEGF：激活组（331.9±19.8）%,抑制组（19.5±3.7）%（F=278.407,P=0.000）;HGF：激活组（376.00±6.51）%,抑制组（16.2±2.7）%（F=640.340,P=0.000）。②激活组高表达α-SMA、Jagged1等蛋白,而对照组、抑制组表达明显较少。α-SMA：激活组0.880±0.016,对照组0.481±0.007,抑制组0.207±0.014 （F=2098.556,P=0.000）;Jagged1：激活组0.796±0.015,对照组0.474±0.021,抑制组0.167±0.005（F=1242.556,P=0.000）。③TGF-β1激活组中TGF-β1、α-SMA、TGF-β-R1、Jagged1、Smad2/3、p-Smad2/3的蛋白表达量均较对照组明显上调而抑制组均明显下调。TGF-β1：激活组1.180±0.138,对照组0.654±0.061,抑制组0.359±0.012（F=67.706,P=0.000）;α-SMA：激活组1.076±0.063,对照组0.689±0.022,抑制组0.374±0.011（F=239.186,P=0.000）;TGF-β-R1：激活组1.192±0.142,对照组0.710±0.380,抑制组0.378±0.069 （F=57.235,P=0.000）;Jagged1：激活组1.582±0.247,对照组0.817±0.116,抑制组0.364±0.059（F=43.649,P=0.000）;Smad2/3：激活组2.057±0.114,对照组1.203±0.105,抑制组0.664±0.063（F=158.856,P=0.000）;p-Smad2/3：激活组2.088±0.120,对照组1.168±0.107,抑制组0.573±0.120 （F=136.369,P=0.000）。上述实验结果提示,激活组、抑制组与对照组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：TGF-β1通过Jagged1/Notch激活小鼠肝星状细胞并调控其相关生物学活性。     

黄芪多糖对CLP诱导的脓毒症小鼠急性肝损伤MDA、caspase-3和ICAM-1的影响研究

目的：探讨黄芪多糖（astragalus polysaccharide,ＡＰＳ）对脓毒症诱导的小鼠急性肝损伤丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde,MDA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）和细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）的影响。方法：将小鼠随机分为假手术组（SHAM组,n=25）、脓毒症组（SEP组,n=25）、APS处理组（APS组,n=25）、生理盐水处理组（NS组,n=25）,采用盲肠结扎穿刺术（cecal ligation puncture,CLP）造模,APS组经腹腔注射APS 50 mg/（kg?d）,NS组经腹腔注射等量生理盐水,SHAM组和SEP组不做特殊处理。染色观察肝脏组织病理变化;检测①血浆中MDA、caspase-3和ICAM-1变化;②肝组织匀浆MDA和caspase-3变化;③肝脏组织中caspase-3蛋白的表达。结果：SEP组12 h开始表现肝细胞水肿进行性加重,48 h达到高峰。APS干预后,肝细胞损害严重程度较SEP组明显改善。通过APS处理后,24、48 h APS组血浆中MDA[（29.69±4.62） mol/ml,P=0.041;（23.95±4.10） mol/ml,P=0.003]、caspase-3[（33.12±9.01） ?滋mol/L,P=0.000;（31.25±8.68） ?滋mol/L,P=0.000]和ICAM-1[（439.49±71.66） ?滋g/L,P=0.009;（321.87±68.64） ?滋g/L,P=0.000]浓度降低,肝组织匀浆MDA与caspase-3浓度亦在相应时相点开始降低。24、48 h APS组caspase-3蛋白[（19.93±4.53） ?滋mol/L,P=0.005;（16.91±4.76） ?滋mol/L,P=0.000]表达较SEP组明显降低。结论：APS可有效减轻急性肝损伤,其作用可能与降低MDA、ICAM-1以及抑制caspase-3表达有关。     

顺铂通过ROS促进乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的：探索顺铂（cisplatin）促进乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）复制的分子机制。方法：采用不同浓度的顺铂处理稳定表达HBV的HepAD38细胞,台盼蓝染色检测细胞活力,筛选出顺铂最适浓度,分别采用Real-time PCR和Southern blot检测HBV DNA水平,Western blot检测HBsAg和HBcAg蛋白表达。在顺铂诱导组加或者不加氧化应激抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）,采用CellROX Orange Reagent染料在激光共聚焦显微镜下检测细胞内ROS水平,并且检测HBV DNA 水平、HBsAg及HBcAg的蛋白水平。结果：台盼蓝染色筛选出顺铂的最适浓度为6 μmol/L。Real-time PCR实验结果显示,PBS组,0.5、2.0、6.0 μmol/L顺铂处理后HBV DNA 拷贝数/细胞分别为515.152±18.924、1 215.758±49.001（P=0.000）、1 678.182±117.223（P=0.000）、2 110.606±143.640（P=0.000）;Southern blot结果与Real-time PCR结果一致,顺铂以剂量依赖方式增加HBV DNA水平。Western blot结果表明,与PBS组相比,6.0 μmol/L顺铂组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量分别为3.102±0.099（P=0.000）、4.001±0.200（P=0.000）;顺铂可以促进HBV复制和病毒蛋白的表达。进一步采用NAC与顺铂联合处理HepAD38细胞,Real-time PCR实验结果表明,顺铂组、顺铂+NAC组HBV DNA 拷贝数/细胞分别为2 180.444±82.573（P=0.000）、1 041.778±50.918（P=0.000）,2组差异具有统计学意义。Western blot实验结果表明,顺铂组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量分别为3.139±0.061（P=0.000）、3.812±0.109（P=0.000）,顺铂+NAC组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量分别为2.101±0.088（P=0.000）、1.613±0.073（P=0.000）,2组之间HBsAg、HBcAg蛋白差异均具有统计学意义。结论：顺铂通过增强细胞内ROS水平,促进HBV复制,而NAC可以部分抑制顺铂刺激的HBV复制作用。     

舒尼替尼通过Wnt/β-catenin信号抑制肾癌细胞体外生长和侵袭的实验研究

目的:研究舒尼替尼对肾癌细胞体外生长、侵袭及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法:培养肾癌细胞株ACHN并用不同剂量舒尼替尼(1、2、4、8μmol/L)进行处理,以不含舒尼替尼的处理条件作为阴性对照。处理后24h时,测定细胞中凋亡基因、侵袭基因、Wnt/β-catenin信号通路的mRNA表达量。结果:处理后24h时,1、2、4、8μmol/L舒尼替尼组中NPRL2、Bax、caspase-3、caspase-9的mRNA表达量显著高于阴性对照组,MMP2、MMP9、Vimentin、N-cadherin、Wnt、β-catenin的mRNA表达量显著低于阴性对照组;舒尼替尼剂量越高,细胞中NPRL2、Bax、caspase-3、caspase-9的mRNA表达量越高,MMP2、MMP9、Vimentin、N-cadherin、Wnt、β-catenin的mRNA表达量越低。结论:舒尼替尼能够通过抑制肾癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路来增加凋亡基因的表达、抑制侵袭基因的表达,进而抑制细胞的生长和侵袭。     

ROS介导棕榈酸诱导的肾小球足细胞骨架及裂孔隔膜损伤

目的：探讨棕榈酸（palmitic acid,PA）对足细胞肌动蛋白纤维骨架及裂孔隔膜蛋白损伤的影响。方法：应用PA刺激体外培养的条件永生性小鼠肾小球足细胞株,分为对照组（1% BSA）和PA（150 ?滋mol/L）组。采用Alexa 549-phalloidin染色观察足细胞肌动蛋白纤维骨架的变化;免疫荧光染色法观察检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达;油红“O”、透射电镜以及BODIPY染色检测PA刺激下足细胞内脂质积聚情况。应用不同浓度PA刺激足细胞,分为对照组（1% BSA）、50 ?滋mol/L PA组、150 ?滋mol/L PA组、300 ?滋mol/L PA组。采用Western blot检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达。进一步应用氧自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine,NAC）预处理足细胞,分为对照组（1% BSA）、PA（150 ?滋mol/L）组、NAC组、PA（150 ?滋mol/L）+ NAC组。采用DCFH-DA染色检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生;Alexa 549-phalloidin染色观察足细胞肌动蛋白纤维骨架的变化;Western blot检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达。结果：Western blot结果示300 ?滋mol/L PA组足细胞内Nephrin和Podocin 的表达（0.360±0.030,0.900±0.040）分别与对照（Ctr）组（1.000±0.030,1.000±0.030）和50 ?滋mol/L PA组（0.912±0.020,0.900±0.040）相比都明显减少（P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.003）。免疫荧光显示与Ctr组相比,PA组足细胞Nephrin（t=6.014,P=0.010）和Podocin（t=6.171,P=0.010）蛋白的表达减少。使用NAC预处理足细胞清除ROS,与PA组（1.21±0.04,1.30±0.03）相比,PA+NAC组Nephrin（2.87±0.05）和Podocin（2.69±0.06）的表达减少（P=0.000,P=0.000）。结论：ROS介导了棕榈酸诱导的足细胞骨架及裂孔隔膜损伤。     

Wnt/β-catenin信号通路在阿尔茨海默病神经元变性中的研究进展

目的：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是目前老年人最常见的痴呆类型,由于AD发病机制复杂,迄今尚未完全阐明。AD最重要的神经病理学特征是β淀粉样蛋白（amyloid-beta eptide, Aβ）沉积、Tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结以及脑内神经炎症反应的激活,并伴随着神经元的损伤及学习记忆功能受损。越来越多的研究指出Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路在神经退行性疾病中,尤其是AD中发挥了重要作用。为明确Wnt/β-catenin信号通路与AD发病、Aβ沉积、Tau 蛋白和神经炎症的相关性及其机制,对相关文献进行综述。方法：选择Wnt/β-catenin信号通路与AD、Aβ神经毒性、Tau 蛋白磷酸化及神经炎症相关的国内外相关文献进行综述。结果：研究表明Wnt/β-catenin信号通路参与AD的发生和发展,当该通路激活时可以抑制Aβ的沉积、Tau的过度磷酸化及神经炎症,反之则促进Aβ的产生、聚集以及Tau蛋白的磷酸化,神经炎症的发生。结论：本文就Wnt/β-catenin信号途径在AD发病中的重要性加以概述,为AD机制的研究提供了理论基础,也提示激活Wnt信号传导途径可以作为治疗AD的潜在治疗靶点。dismutase,SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）和过氧化氢酶（catalase,CAT）水平采用试剂盒检测。qPCR和Western blot检测血浆Klotho的表达。Klotho表达量与氧化应激的相关性采用Pearson相关性分析。甲基化特异性PCR（MS-PCR）检测Klotho甲基化水平。CpG岛甲基化率采用焦磷酸盐测序法。结果：相对于对照组[（94.56±16.40） mU/L],观察组SOD含量[（79.86±18.24） mU/L]明显降低（t=4.487,P=0.000）,观察组MDA水平[（2.87±2.26） pg/mL]与对照组[（2.52±1.06） pg/mL]无统计学差异（t=1.675,P=0.097）,观察组CAT水平[（18.50±4.62） U/mg]与对照组[（25.26±3.54） U/mg]相比明显降低（t=8.605,P=0.000）。观察组（0.66±0.16）比对照组（1.04±0.10）血浆Klotho基因（t=14.93,P=0.000）降低;观察组（0.70±0.20）比对照组（1.04±0.10）血浆Klotho蛋白表达（t=10.92,P=0.000）降低,且Klotho蛋白表达量与SOD水平（r=0.768,P=0.000）和CAT水平（r=0.708,P=0.000）呈正相关。观察组Klotho启动子CpG岛甲基化水平升高。结论：Klotho甲基化可能是NSCLC患者血浆氧化应激状态的一个临床标志物。     

姜黄素调控脂多糖诱导成骨细胞线粒体功能改变及凋亡研究

目的：研究脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和姜黄素（curcumin,Cur）对成骨细胞线粒体功能活性改变及凋亡的影响。方法：体外培养小鼠原代成骨细胞,并将细胞分为4组：无任何处理的对照组（N组）;10 μmol/L姜黄素预处理2 h,使用正常培养基培养24 h组（Cur组）;用1 mg/L LPS处理24 h组（LPS组）;用10 μmol/L姜黄素预处理2 h,然后再用1 mg/L LPS处理成骨细胞24 h组（Cur +LPS组）。利用线粒体荧光探针测量线粒体活性氧的产生,检测线粒体氧化呼吸链酶活性、线粒体膜电位、细胞内ATP的合成及细胞凋亡情况。结果：在经过1 mg/L LPS刺激后,小鼠成骨细胞线粒体内活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成为对照组的2.59倍;与对照组相比,LPS组氧化呼吸链酶Ⅰ活性降低21%,氧化呼吸链酶Ⅲ活性降低26%,氧化呼吸链酶Ⅳ活性降低28%;线粒体细胞膜电位降低32%,ATP合成量为（0.79±0.06） μmol/mg蛋白,细胞凋亡数目增加3.2倍;而Cur+LPS组较LPS组相比,小鼠成骨细胞内ROS水平降低（1.48±0.21 vs. 2.59±0.32,P=0.003）,氧化呼吸链酶Ⅰ活性升高（0.98±0.02 vs. 0.79±0.03,P=0.000）,氧化呼吸链酶Ⅲ活性升高（0.93±0.03 vs. 0.74±0.03,P=0.004）,氧化呼吸链酶Ⅳ活性升高（0.92±0.05 vs. 0.72±0.02,P=0.009）,线粒体膜电位增加（0.91±0.04 vs. 0.68±0.04,P=0.002）,ATP合成量增加（1.53±0.05 vs. 0.79±0.06,P=0.000）,细胞凋亡数目减少（1.67±0.42 vs. 5.33±0.80,P=0.002）。结论：姜黄素预处理组的成骨细胞线粒体功能得以明显改善,并且细胞凋亡数目明显减少,为姜黄素可能被进一步应用于临床治疗慢性牙周炎提供一定的实验依据。     

雌二醇对人羊膜间充质干细胞增殖、凋亡的影响

目的：研究不同浓度雌二醇（estradiol,E2）对人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stromal cells,HAMSCs）体外培养中增殖、凋亡的影响。方法：采用改良酶消化法提取HAMSCs,流式细胞学方法和免疫荧光法鉴定提取细胞。HAMSCs培养方法分为对照组和E2组（分别加入浓度为10-5、10-6、10-7、10-8 mol/L E2）。CCK-8检测各组HAMSCs增殖情况;qRT-PCR检测干细胞特异基因Oct-4和凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果：CCK-8检测显示各浓度E2组和对照组的HAMSCs增殖活性在1~6 d都随时间的变化而变化（F时间=2 418.132,P时间=0.000）;各浓度E2组在1~4 d的增殖率与对照组无明显差异;4 d后,各浓度E2组的增殖率明显高于对照组（F组别=246.601,P组别=0.000）,各浓度组间无明显差异。qRT-PCR检测显示10-6 mol/L E2组（1.00±0.10）的Oct-4 mRNA表达水平较对照组（0.58±0.16）和其他E2浓度组（1.31±0.22、0.81±0.04、0.78±0.07）上调（P=0.000,P=0.020,P=0.001,P=0.000）;除10-6 mol/L E2组（0.83±0.47,P=0.084）外,其他E2浓度组（0.49±0.25、0.38±0.19、0.32±0.10）抗凋亡基因Bcl-2基因表达量均较对照组（1.06±0.13）下调（P=0.038,P=0.015,P=0.010）。10-5 mol/L E2组（2.20±0.58）的Bax基因较对照组、其他E2浓度组（1.00±0.05、1.52±0.38、1.38±0.17、1.17±0.19）上调（P=0.001,P=0.028,P=0.012,P=0.003）。Western blot检测提示10-5 mol/L E2组（0.514±0.014）的促凋亡蛋白表达Bax较对照组（0.201±0.017）明显上调（P=0.000）,而抗凋亡蛋白Bcl-2（0.366±0.024）与对照组（0.215±0.080）之间差异无统计学意义（P=0.055）。而10-6 mol/L E2组（0.378±0.016）的促凋亡蛋白Bax较其他浓度E2组（0.514±0.014、0.547±0.036、0.577±0.028）表达降低（P=0.000）。结论：E2促进HAMSCs的增殖呈时间依赖性,高浓度E2（10-5 mol/L）促进HAMSCs凋亡,较高浓度E2（10-6 mol/L）维持HAMSCs活性并保护其分化潜能。     

PBEF对HPMEC和A549细胞的影响及对ARDS发病机制的研究

目的：探讨前B细胞克隆增强因子（pre-B cell colony enhancing factor,PBEF）在急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）发病机制中的作用。方法：体外培养人肺微血管内皮细胞株（HPMEC）和人肺泡Ⅱ型上皮细胞株（A549）,采用不同浓度（0、50、100、500、1 000、2 000 ng/mL）重组人PBEF（rPBEF）分别作用于细胞,采用四甲基偶氮唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测细胞活性。选用100和1 000 ng/mL rPBEF刺激细胞,并设置空白对照组,采用流式细胞术法检测细胞周期和细胞凋亡率;采用透射电子显微镜观察细胞凋亡的形态学变化;采用蛋白印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cas－pase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma/leukemia-2 gene,Bcl-2）的蛋白表达水平;采用实时荧光定量PCR法和蛋白印迹法检测水通道蛋白-1（aquaporin 1,AQP1）、白细胞介素-8（interleukin-8,IL-8）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）的mRNA和蛋白表达情况。结果：100、500、1 000、2 000 ng/mL rPBEF组相比空白对照组明显抑制了细胞活性（P<0.05）。流式细胞仪检测可见,与对照组[HPMEC：（19.347±2.052）%;A549：（17.297±0.800）%]比较,100和1 000 ng/mL rPBEF组细胞S期百分比[HPMEC：（43.847±1.272）%、（63.300±2.102）%;A549：（36.247±2.045）%、（46.400±1.346）%]明显增多（P=0.000）;与对照组[HPMEC：（8.433±0.600）%;A549：（3.877±0.666）%]相比,100和1 000 ng/mL rPBEF组细胞凋亡率[HPMEC：（11.317±0.533）%、（15.227±0.637）%;A549：（6.120±0.439）%、（8.633±0.497）%]明显升高（PHPMEC=0.001,PHPMEC=0.000;PA549=0.002,PA549=0.000）。1 000 ng/mL rPBEF处理细胞后透射电子显微镜下可见典型凋亡细胞和凋亡小体。同时,与对照组[HPMEC：（1.279±0.077）;A549：（2.824±0.129）]相比,100和1 000 ng/mL rPBEF组Bcl-2蛋白表达水平[HPMEC：（0.418±0.043）、（0.190±0.012）;A549：（1.276±0.212）、（0.601±0.164）]明显下调（均P=0.000）,而caspase-3蛋白表达水平[HPMEC：（0.763±0.030）、（1.170±0.056）;A549：（0.217±0.010）、（0.375±0.032）]较对照组[HPMEC：（0.459±0.032）;A549：（0.114±0.007）]明显升高（PHPMEC=0.000,PHPMEC=0.000;PA549=0.001,PA549=0.000）;AQP1 mRNA和蛋白表达水平明显下降[mRNA：HPMEC（0.543±0.113）、（0.287±0.093） vs. （1.050±0.155）（P=0.002,P=0.000）;A549（0.823±0.104）、（0.463±0.184） vs. （1.317±0.215） （P=0.013,P=0.001）;蛋白：HPMEC（0.494±0.038）、（0.233±0.030） vs. （0.824±0.067）（均P=0.000）;A549（0.850±0.157）、（0.484±0.118） vs. （1.344±0.136）（P=0.005,P=0.000）],而IL-8、IL-1β基因和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论：PBEF可能通过下调Bcl-2基因表达,使caspase-3表达水平增加,从而诱导HPMEC和A549细胞凋亡,并通过下调AQP1表达参与急性呼吸窘迫综合征的发生发展。     

硫链丝菌肽抑制FoxM1表达后对鼻咽癌细胞凋亡的影响及机制探讨

目的：探讨硫链丝菌肽（thiostrepton,TST）抑制鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）细胞CNE-2中叉头框M1（fork－head box M1,FoxM1）表达后凋亡作用的增强及可能机制。方法：细胞培养传代后过夜培养,将细胞分为3组：对照组未加TST、只加0.1%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）的培养液,4 μmol/L TST组, 8 μmol/L TST组,培养48 h后,进行不同的实验手段观察处理。显微镜下观察TST作用CNE-2后细胞形态学改变;Hoechst33342染色后显微镜下计数凋亡细胞个数,检测TST对CNE-2细胞凋亡的影响;流式细胞术检测TST作用CNE-2细胞后,细胞凋亡率的变化;Western blot检测TST作用CNE-2后细胞中FoxM1及凋亡相关蛋白的表达变化。结果：TST作用CNE-2细胞后细胞形态逐渐向凋亡发展,呈剂量依赖性;Hoechst33342染色检测凋亡结果显示各组凋亡细胞数为：对照组（0.1% DMSO）,4 μmol/L TST组和8 μmol/L TST组细胞凋亡数目分别为：0.60±0.55,3.60±0.89,7.00±1.58,TST对CNE-2细胞凋亡的影响呈剂量依赖性增加,对照组与TST组比较差别有统计学意义（F=42.72,P<0.01）;流式细胞术检测凋亡结果显示：对照组（0.1% DMSO）（1.87±0.74）%;4 μmol/L TST组（10.55±0.75）%;8 μmol/L TST组（19.35±2.49）%,随着TST浓度增加,CNE-2细胞凋亡率增加,对照组与TST组比较差别有统计学意义（F=94.50,P<0.01）;Western blot检测发现TST作用CNE-2后细胞中FoxM1蛋白表达下降,凋亡相关蛋白表达发生变化。结论：硫链丝菌肽在体外可以有效降低NPC CNE-2细胞中FoxM1表达,并抑制NPC CNE-2细胞生长,诱导其凋亡。     

Kindlin-2 RNA干扰经Wnt信号通路抑制血管平滑肌细胞增殖

目的：观察Kindlin-2 RNA干扰（RNA interference,RNAi）对大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）增殖的影响并探讨相关的作用机制。方法：构建并制备Kindlin-2 siRNA慢病毒载体并感染大鼠VSMC,CCK-8和BrdU技术检测重组Wnt3a蛋白诱导的VSMC增殖情况,实时定量PCR测定VSMC中Kindlin-2、c-Myc和cyclin D1 mRNA的表达水平,免疫共沉淀了解Kindlin-2和β-catenin的关系,Western blot检测VSMC中Kindlin-2、β-catenin、磷酸化β-catenin（Ser675）、GSK-3β和磷酸化GSK-3β（Ser9）蛋白的表达。结果：Kindlin-2 siRNA慢病毒载体能有效感染大鼠VSMC。CCK-8和BrdU结果表明Kindlin-2 RNAi能够显著抑制Wnt3a诱导的VSMC增殖（1.12±0.14 vs. 2.25±0.15,P=0.000;0.162±0.017 vs. 0.288±0.019,P=0.000）。与阴性对照组相比,Kindlin-2 RNAi组和Kindlin-2 RNAi+Wnt3a组中Kindlin-2、c-Myc和cyclin D1 mRNA表达水平均明显下降（0.964±0.014 vs. 0.530±0.029,P=0.000;0.980±0.025 vs. 0.572±0.022,P=0.000;0.979±0.009 vs. 0.590±0.035,P=0.002和0.964±0.014 vs. 0.569±0.027,P=0.000;0.980±0.025 vs. 0.741±0.026,P=0.001;0.979±0.009 vs. 0.769±0.017,P=0.023）。免疫共沉淀证实VSMC中Kindlin-2可以与β-catenin结合,而且Kindlin-2 RNAi+Wnt3a组中Kindlin-2、磷酸化β-catenin（Ser675）和磷酸化GSK-3β（Ser9）蛋白的表达水平较阴性对照+Wnt3a组明显降低（0.468±0.029 vs. 0.725±0.033,P=0.001;1.058±0.109 vs. 1.478±0.045,P=0.001;0.624±0.048 vs. 0.809±0.067,P=0.020）。但各组中总β-catenin和总GSK-3β蛋白水平没有明显变化（F=0.638,P=0.647;F=0.781,P=0.563）。结论：Kindlin-2 RNAi可以通过Wnt信号通路发挥作用并抑制VSMC增殖。     

葛根素对成骨细胞体外增殖及Wnt/β-catenin信号通路表达的影响

目的:葛根素对成骨细胞体外增殖及Wnt/β-catenin信号通路表达的影响。方法:培养成骨细胞MC3T3-E1并分为对照组及10-6 mol/L PUE组、10~(-7) mol/L PUE组、10~(-8) mol/L PUE组,处理24小时后检测成骨细胞标志基因、凋亡基因、Wnt/β-catenin通路基因的mRNA表达量。结果:10-6 mol/L PUE组、10~(-7) mol/L PUE组、10~(-8) mol/L PUE组细胞ALP、Runx2、OC。Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt10b、β-catenin的mRNA表达量均显著高于对照组,caspase-3、caspase-8、caspase-9、caspase-12的mRNA表达量均显著低于对照组(P<0.05);且葛根素剂量越大,细胞中ALP、Runx2、OC、Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt10b、β-catenin的mRNA表达量越高,caspase-3、caspase-8、caspase-9、caspase-12的mRNA表达量越低(P<0.05)。结论:葛根素能够有效促进成骨细胞的增殖及Wnt/β-catenin通路的活化。     

细胞毒性化疗药物表柔比星对HBV复制水平影响的体外试验

目的：在体外研究细胞毒性化疗药物表柔比星对乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）复制水平的影响。方法：3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]法检测0、0.1、0.5、1.0 μmol/L不同浓度表柔比星对HBV稳定细胞系HepG2.2.15细胞和HepG2-HBV1.1细胞活力的影响。将药物直接添加在HepG2.2.15细胞和HepG2-HBV1.1细胞中,提取细胞内及上清中的HBV复制中间体,通过real-time PCR法和southern-blot法检测HBV DNA拷贝量。结果：HepG2.2.15细胞分别经0、0.1、0.2、0.5 μmol/L表柔比星处理后,细胞内HBV病毒拷贝量（×106）分别是3.53±0.26、5.39±0.23、9.40±0.92、19.07±1.47,各组间有统计学差异（F=10.984,P=0.005）。同样,HepG2-HBV1.1细胞也分别经0、0.1、0.2、0.5 μmol/L表柔比星处理后,细胞内HBV病毒拷贝量（×106）分别是2.80±0.37、5.14±0.49、14.24±1.29、26.59±1.98,各组间有统计学差异（F=13.122,P=0.003）。Southern-blot检测表明HepG2.2.15细胞内HBV DNA复制中间体相对量在对照组（0 μmol/L表柔比星）和处理组（0.5 μmol/L表柔比星）中分别为（1.00±0.01）和（1.53±0.05）,对照组和药物处理组比较有统计学差异（t=19.202,P=0.002）。同样,HepG2-HBV1.1细胞内HBV DNA复制中间体相对量,在对照组和处理组中分别为1.01±0.02、3.12±0.20,对照组和药物处理组比较有统计学差异（t=18.034,P=0.003）。上述结果提示表柔比星促进细胞内HBV的复制。HepG2.2.15细胞分别经0、0.1、0.2、0.5 μmol/L表柔比星处理后,细胞上清液中HBV病毒拷贝量（×106）分别是2.37± 0.22、3.50±0.27、6.02±0.56、17.74±0.96,各组间有统计学差异（F=20.726,P=0.001）。同样,HepG2-HBV1.1细胞也分别经0、0.1、0.2、0.5 μmol/L表柔比星处理后,细胞上清液中HBV病毒拷贝量（×106）分别是3.75±0.35、6.05±0.48、10.28±1.01、20.86±1.81,各组间有统计学差异（F=14.761,P=0.002）。Southern-blot检测表明HepG2.2.15细胞上清中HBV DNA复制中间体相对量,在对照组和药物处理组中分别为1.08±0.02和2.69±0.05,对照组和药物处理组比较有统计学差异（t=58.33,P=0.000）。同样,HepG2-HBV1.1细胞内HBV DNA复制中间体相对量,在对照组和药物处理组中分别为1.03±0.01、3.52±0.05,对照组和药物处理组比较有统计学差异（t=85.801,P=0.000）。该结果提示表柔比星促进细胞分泌或释放更多的HBV到细胞上清液中。结论：表柔比星有直接的促HBV复制的作用,该作用可能成为化疗后HBV再激活的新机制。     

二甲双胍通过干预上皮-间质转化逆转尼古丁诱导的肺癌吉非替尼耐药

目的：探讨尼古丁（nicotine,NIC）诱导EGFR敏感突变PC-9肺癌细胞株吉非替尼耐药及二甲双胍对其作用。方法：PC-9分成4组：空白组、尼古丁组、二甲双胍组、尼古丁和二甲双胍组,利用定量反转录聚合酶连锁反应（quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测E-cadherin和Vimentin信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,mRNA）的表达,Western blot检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达,细胞计数试剂盒（cell counting Kit-8,CCK-8）检测不同分组细胞对吉非替尼药物敏感情况。Transwell小室实验检测细胞侵袭迁移。结果：尼古丁诱导PC-9细胞上皮间质转化呈时间浓度依赖,在10 μmol/L尼古丁处理72 h后,发生E-cadherin下调和Vimentin上调最明显,故选该条件做以下实验。CCK-8提示,相比空白组,尼古丁组PC-9细胞对吉非替尼敏感性减弱,在吉非替尼浓度为0.05 μmol/L最明显（P=0.000）。Matrigel侵袭实验提示尼古丁组穿膜细胞数较空白组明显增多[（15.70±1.53）个/高倍视野 vs. （32.70±2.08）个/高倍视野,F=75.406,P=0.000,P=0.000];迁移实验的结果与之相似。与空白组相比,尼古丁组E-cadherin mRNA 表达水平明显降低[（0.932±0.100） vs. （0.459±0.024）,F=25.924,P=0.000,P=0.000）],Vimentin mRNA表达水平明显升高[（1.200±0.200） vs. （1.973±0.129）,F=20.998,P=0.000,P=0.000]。蛋白水平变化与之相同。尼古丁＋二甲双胍组可以增加尼古丁作用PC-9对吉非替尼的敏感性,在吉非替尼浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μmol/L时有统计学意义。尼古丁＋二甲双胍组可以减弱尼古丁组的穿膜数[（17.00±2.00）个/高倍视野vs. （32.70±2.08）个/高倍视野,F=75.406,P=0.000,P=0.000],迁移实验呈现相同的结果。相比于尼古丁组,尼古丁＋二甲双胍组上调E-cadherin mRNA[（0.459±0.024） vs. （0.838±0.058）,F=25.924,P=0.000,P=0.000）],下调Vimentin mRNA[（1.973±0.129） vs. （1.467±0.115）,F=20.998,P=0.000,P=0.003）]。结论：尼古丁通过上皮间质转化诱导PC-9细胞吉非替尼耐药,二甲双胍可以逆转上述现象。     

姜黄素通过Wnt/β-catenin信号通路诱导人晶状体上皮细胞的凋亡和细胞周期阻滞

目的 探讨姜黄素对人晶状体上皮细胞株SRA01/04（HLEC-SRA01/04）细胞周期和凋亡的影响及其相关分子机制,为姜黄素治疗和预防后发性白内障提供理论依据。方法 体外培养HLEC-SRA01/04细胞,加入终浓度分别为0 μmol/L（对照组）以 及20、40和60 μmol/L的姜黄素处理孵育24 h或48 h后,MTT法检测各组细胞的增殖抑制率;流式细胞仪检测HLEC-SRA01/04细胞周期、线粒体膜电位和细胞凋亡率;Western blot法检测姜黄素对HLEC-SRA01/04细胞中caspase-9、caspase-3、Bcl-2、Bax、Cyclin B1、CDK1、β-catenin、c-myc、Cyclin D1蛋白水平表达的影响。结果 MTT显示：随着姜黄素的浓度逐渐增加,HLEC-SRA01/04细胞较对照组抑制率逐渐增高（P<0.001）;随着作用时间的延长,各实验组HLEC-SRA01/04细胞增殖抑制率均逐渐增高（P<0.001）;流式细胞仪结果显示：各组中HLEC-SRA01/04细胞凋亡率和细胞G2/M期比例随姜黄素浓度增加逐渐增高,而线粒体膜电位随着姜黄素浓度增加逐渐下降（P<0.001）。Western blot 实验显示：随着姜黄素浓度的增加,HLEC- SRA01/04细胞中caspase-3、caspase-9和Bax的表达量逐渐增高,Bcl-2、Cyclin B1、CDK1和β-catenin的表达量逐渐降低,同时Wnt/β-catenin信号通路下游靶蛋白Cyclin D1和c-myc表达量也逐渐降低。结论 姜黄素可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路进而抑制HLEC-SRA01/04细胞增殖,并将细胞周期阻滞在G2/M期,从而诱导其凋亡。     

原花青素对宫颈癌Hela细胞livin和caspase-3基因表达的影响

目的探讨原花青素对宫颈癌Hela细胞livin和cospose-3基因表达的影响。方法用不同终浓度原花青素（0～600μmol／L）处理宫颈癌Hela细胞24h，采用MTT比色法分析细胞存活率，Hoechst 33258-PI荧光染色法检测凋亡，RT—PCR检测livin、cospose-3 mRNA表达变化，Western blot检测livin、cospose-3 P17蛋白表达的变化，用比色法检测caspose-3相对活性。结果随着原花青剂量的增加，宫颈癌Hela细胞存活率降低，凋亡明显增加，livin mRNA表达和蛋白表达水平逐渐减少，而cospose-3逐渐增加；随原花青素浓度从75—600μmol／L增加，caspase-3相对活性增加（P〈0．05），在600μmol／L原花青素时caspose-3相对活性达最大值。结论原花青素可剂量依赖性的减少livin mRNA和蛋白表达；原花青素可剂量依赖性的增加caspose-3 mRNA、蛋白表达和增加cospose-3活性。     

雄激素受体干预对包皮成纤维细胞Mafb基因表达的影响

目的：探讨双氢睾酮（dihydrotestosterone,DHT）与氟他胺（flutamide,Flu）对Mafb基因表达的影响。方法：利用原代培养的正常儿童包皮成纤维细胞株,分别采取不同浓度DHT与Flu干预,通过RT-PCR、免疫细胞荧光和Western blot检测Mafb的转录表达情况。结果：在DHT浓度为3.0×10-8 mol/L与3.0×10-6 mol/L干预条件下,Mafb mRNA的表达量分别为0.372±0.003、0.594±0.045,与正常组（0.444±0.007）相比,DHT 3.0×10-6 mol/L组明显上调（P=0.005）,而DHT 3.0×10-8 mol/L组上调差异不明显（P=0.145）;Flu 15 μmol/L干预条件下,Mafb mRNA的表达量为0.221±0.013,与正常组相比,表达量明显下降（P=0.000）。细胞免疫荧光分析表明,与正常对照组相比（0.027±0.006）,DHT 3.0×10-8 mol/L组（0.046±0.004）、3.0×10-6 mol/L组（0.076±0.003）Mafb表达量明显上调（P=0.010,P=0.000）,而Flu组（0.006±0.002）明显下调（P=0.009）。同样Western blot结果显示,较对照组蛋白水平（0.163±0.001）相比,DHT 3.0×10-8 mol /L组（0.146±0.001）上调无统计学差异（P=0.960）,DHT 3.0×10-6 mol/L组（0.598±0.087）Mafb表达量上调差异有统计学意义（P=0.000）,而Flu组（0.066±0.002）明显下调（P=0.040）。结论：在体外培养包皮成纤维细胞株中,Mafb基因的表达受DHT和Flu的调控。Mafb作为雄激素受体下游调控蛋白,可能是雄激素受体信号通路促进尿道发育的重要机制。