人FAT1基因启动子的克隆鉴定及其功能浅析

目的：克隆人脂肪非典型钙黏蛋白1（FAT atypical cadherin 1,FAT1）基因启动子,找到核心启动子区域并对其转录调控机制进行初步分析。方法：通过PCR方法获得人FAT1基因5′上游1 163 bp（-1 029~+134 bp）的片段,亚克隆至pGL3?basic载体;通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒。双荧光素酶报告活性分析检测各重组质粒在A549细胞和HEK293T细胞中的活性,找到核心启动子区域。利用生物信息学方法预测核心区域的转录因子结合位点。结果：经测序、酶切鉴定,成功构建了人FAT1启动子荧光素酶活性报告基因重组质粒。与pGL3?basic质粒相比,人FAT1启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加（P < 0.05）。通过生物信息学软件预测人FAT1启动子区域（-233~-110 bp）可能含有TFAP2C、KLF5等转录因子结合位点。结论：成功构建人FAT1启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因重组质粒。通过荧光素酶活性比较,推测人FAT1的核心启动子区域位于-233~+134 bp区域,其中可能含有若干转录因子结合位点。     

人HAS3基因核心启动子区域的初步鉴定与分析

目的对人HAS3基因的核心启动子区域进行初步鉴定和分析,为深入研究HAS3基因的转录调控奠定基础。方法以前期构建的人HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体P(-761/-305)为模板,采用PCR介导的基因定点突变技术构建4个不同的系列删除体,并对HAS3启动子区域中的Sp1结合位点和核心启动子元件进行定点突变,构建相应的定点突变重组体;采用荧光素酶双报告基因分析技术检测各重组体的启动子活性。结果构建了P(-761/-569)、P(-563/-305)、P(-490/-305)和P(-433/-305)4个系列删除体和5个定点突变体;启动子活性分析结果表明,P(-761/-569)无启动子活性,P(-563/-305)、P(-490/-305)和P(-433/-305)均具有较强的启动子活性,Sp1结合位点和核心启动子元件的定点突变可导致HAS3启动子活性的降低。结论 HAS3基因的核心启动子区域主要位于其转录起始位点上游附近-433～-305 bp内,Sp1可能在HAS3的转录调控中起重要作用。     

小鼠STING基因启动子的克隆鉴定及功能初步分析

目的:克隆小鼠干扰素基因刺激因子(STING)基因启动子,并对其启动子活性和转录调控机制进行初步探讨?方法:利用PCR方法扩增小鼠STING基因5′上游1 005 bp(-927~+77)的片段,亚克隆至pGL3-basic质粒,然后通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒?双荧光素酶报告活性分析检测重组质粒在NIH3T3中的活性,并利用生物信息学方法预测转录因子结合位点?结果:经酶切?测序鉴定,成功构建了小鼠STING启动子荧光素酶报告基因重组质粒?与pGL3-basic质粒相比,STING启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加(P < 0.05)?通过生物信息学软件预测小鼠STING启动子区域(-177~-48)可能含有GATA?IK2?MZF1?SP1/SP3?STAT等转录因子结合位点?结论:成功构建小鼠STING不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒?通过活性比较,推测小鼠STING的核心启动子区位于-177~+77区域,其中可能含有多个潜在的转录因子结合序列?     

人短链TSLP启动子区的克隆鉴定及功能分析

目的：构建人短链胸腺基质淋巴生成素（short isoform thymic stromal lymphopoietin,sfTSLP）启动子全长及其长度不等片段的萤光素酶报告质粒,以确定启动子活性区域并预测功能性转录因子结合位点。方法：使用按基因组序列设计的引物,通过PCR分离人sfTSLP启动子片段,并将之插入萤光素酶报告基因载体pGL3?basic中。通过步移缺失构建其截短片段,通过双萤光素酶报告基因系统测定所有启动子缺失克隆在HEK?293细胞中的活性,并使用生物信息学手段预测其潜在的转录结合位点。结果：经菌液PCR、双酶切、测序,成功构建了人sfTSLP启动子及其截短片段萤光素酶报告质粒,并确定其启动子活性区域位于5′侧翼区-200~+25 nt区域内,且可能含有SP1/SP3、SPI1/SPIB、TCF3、ETS1等转录因子结合位点。结论：首次对人sfTSLP启动子区进行了研究,初步确定了其启动子活性区域及可能的转录因子结合位点,为更进一步的研究指明了方向。     

敲减cGAS基因对人食管鳞癌细胞TE-1增殖、迁移和凋亡的影响

［摘要］目的: 探究环鸟苷酸腺苷酸合成酶（cyclic guanosine monophosphate adenosine monophosphate synthase,cGAS）蛋白在食管鳞癌组织中的表达及其对人食管鳞癌TE-1细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法: 免疫组化分析60例食管鳞癌患者癌组织与癌旁组织中cGAS的表达。荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测正常食管上皮细胞与食管鳞癌细胞中cGAS的表达。使用慢病毒构建稳定敲减cGAS的细胞系（TE-1）,荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证敲减效率。CCK8和克隆形成实验检测cGAS敲减后TE-1细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移能力,流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果： 免疫组化结果显示cGAS在食管鳞癌组织中的表达明显高于癌旁组织;食管鳞癌细胞系TE-1、KYSE 150中cGAS的mRNA和蛋白表达明显高于食管正常上皮细胞Het 1A。荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,敲减cGAS后,TE-1细胞cGAS mRNA和蛋白水平的表达明显降低。CCK8、克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验表明,敲减cGAS抑制食管鳞癌TE 1细胞增殖、迁移的能力,流式细胞分析显示敲减cGAS促进TE-1细胞凋亡。结论： 敲减cGAS在食管鳞癌细胞增殖、迁移中发挥抑制作用,有效促进细胞凋亡。     

人SAMHD1基因核心启动子区域的初步鉴定和分析

目的 鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制.方法 从HepG2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段.将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入pGL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定.将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染HepG2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性.5'RACE鉴定SAMHD1在HepG2细胞中的转录起始位点.结果 电泳结果显示已经从HepG细胞中提取出基因组DNA.PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段.双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体.双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体pGL3-937、pGL3-667、pGL3-553和pGL3-399.荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0～-399区域(ATG前一个碱基为-1).5'RACE结果显示SAMHD1在HepG2细胞中转录起始位点位于-101.结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101～-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础.     

人iNOS基因启动子克隆鉴定及功能分析

目的 克隆鉴定人iNOS基因启动子序列,并进行功能分析.方法 利用生物信息学方法寻找iNOS潜在启动子区域,PCR克隆至报告载体pGL3-basic,双荧光素酶法检测启动子活性.结果 克隆得到人iNOS基因转录起始点上游1000bp区域,经检测具有启动子活性,可开启报告基因表达.结论克隆构建人iNOS基因启动子成功,可用于后继研究.     

人二硫键氧化还原酶类似蛋白基因启动子克隆和上游抑制元件分析

目的 克隆DsbA-L基因启动子,并对其活性进行初步分析。方法 以人基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增DsbA-L基因5’端2115bp片段（从翻译起始点ATG上游-2128~-14区域）。将PCR产物插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic。随后,构建5’端系列缺失的报告基因质粒。将构建的一系列质粒转染3T3-L1和HEK 293细胞,检测荧光素酶活性。利用在线软件MAPPER预测转录调控关键序列潜在的转录因子结合位点。通过Real-time PCR比较这些转录因子在肥胖和正常人脂肪组织中的表达。结果 成功构建人DsbA-L启动子报告基因质粒。系列缺失分析表明-2128~-1302区域是影响转录活性的关键序列。MAPPER软件预测此区域可能与一些转录因子结合。比较这些转录因子在肥胖患者和正常人脂肪组织中的表达情况,发现其中NF-κB和FOXO1在肥胖患者中表达显著增加,进一步推测NF-κB和FOXO1可能是人DsbA-L基因启动子上游的调控抑制因子。结论 成功构建人DsbA-L基因启动子系列缺失质粒,初步分析了其上游可能存在的关键调控元件,为进一步的转录调控研究奠定了基础。     

SRY基因启动子不同模块的克隆及功能分析

采用报告基因分析的方法，构建ＳＲＹ基因５’旁侧具有启动效应的５４４ｂｐ以内不同长度片段与荧光素酶报告基因载体ＰＧＬ２－Ｅｎｈａｎｃｅｒ的重组子，并通过脂质体转染技术导入Ｈｅｌａ细胞，检测各重组子报告基因的瞬间表达，由此分析启动子不同模块对基因转录效率的影响。     

Restin基因启动子的克隆及其在HeLa细胞中的转录活性

目的：扩增细胞静息因子（restin）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨其对全反式维甲酸（alltrans retinoic acid,ATRA）刺激的反应．方法：①对restin基因上游约2000bp基因组序列进行计算机生物信息学分析．②利用PCR技术扩增restin基因上游序列,将其克隆入pG5-luc中,插入荧光素酶报告基因上游,取代5个GAL-4结合位点及腺病毒启动子,构建Rp—luc质粒．③将构建的质粒转染入HeLa细胞,ATRA诱导检测该质粒中荧光素酶的表达．结果：酶切及测序结果均证实成功克隆了restin基因上游序列,已将该序列插入到荧光素酶基因的上游;ATRA诱导转入HeLa细胞中的真核表达载体Rp—luc,荧光素酶表达明显增加．结论：成功构建了含有restin基因启动子序列的荧光报告系统,为进一步研究restin基因功能及其转录调控奠定了基础．     

人同源盒基因Nkx3.1启动子的克隆及活性测定

目的：克隆Nkx3．1基因5’上游1．06kb片段，构建pGL3-1．06kb载体，测定其启动子活性。方法：采用PCR方法从人基因组DNA中扩增Nkx3．1基因5’上游1．06kb片段并构建到荧光素酶报道基因pGL3-basic载体中，与内参照质粒pRL-Tk共转染前列腺癌LNCaP细胞，通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果：PCR扩增的1．06kb片段经测序正确无误；pGL3-1．06kb转染LNCaP细胞48h后，双荧光素酶活性测定M1／M2=2．7，为pGL3-control活性的1．5倍，为pGL3-basic活性的50倍。结论：克隆的人Nkx3．1基因5’上游1．06kb片段具有较强的启动子活性。     

人β catenin启动子的克隆及活性分析

目的克隆β catenin基因5′上游1.8?kb启动子,构建启动子 荧光素酶报告基因载体pGL3 1.8?kb,测定其启动子活性,为进一步研究β catenin基因表达调控机制奠定基础。方法采用PCR方法从人基因组DNA中扩增β catenin基因5′上游1.8?kb片段并构建到荧光素酶报道基因pGL3 basic载体中,与内参照质粒pRL Tk共转染前列腺癌PC3细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果PCR扩增的1.8?kb片段经测序正确无误;pGL3 1.8?kb转染PC3细胞48?h后,双荧光素酶活性测定启动子活性（M1／M2）为11.71,是pGL3 control活性的2.43倍,为pGL3 basic活性的206.31倍,为pGL3 promoter活性的21.38倍。结论克隆的β catenin基因5′上游1.8?kb片段具有较强的启动子活性。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑素蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因,连接PGEM-T载体,测序确认,定向克隆入pBV220表达载体,转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因,构建表达载体在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖,为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑索蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因，连接PGEM-T载体，测序确认，定向克隆入pBV220表达载体，转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实，所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因，构建表达载体在大肠杆菌中表达，经SDS-PAGE分析，出现特异性蛋白质条带，并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达．表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖，为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的克隆及在人肝癌细胞的肿瘤特异性分析

目的:克隆hTERT基因启动子并检测其在不同肝癌细胞系和正常组织细胞中的转录活性,为肝癌靶向性基因治疗提供依据.方法:采用PCR法扩增获得hTERT基因的启动子片段,将之克隆到表达虫荧光素酶基因的报告质粒上,通过测定荧光素酶报告基因的表达,检测hTERT基因启动子在肝癌细胞系和正常组织中的转录活性,并将之与甲胎蛋白(alpha-fetal-protein,AFP)基因启动子活性相比较,评价其作为肝癌基因治疗中应用的肿瘤特异性启动子的可行性.结果:成功克隆了hTERT启动子,证实hTERT启动子在肝癌细胞中具有相当强的转录活性,其活性水平为AFP启动子的14～30倍;在原代培养的成纤维细胞中其启动子未表现转录活性.结论:hTERT启动子在肝癌细胞系中具有较强的启动活性和显著的肿瘤特异性,可望开发成为新型的肝癌靶向性基因治疗工具.     

新基因MIP2的克隆和特性分析

目的 克隆1个大鼠心肌缺血-再灌诱导表达上调的新基因MIP2,并分析其相关特性.方法 采用生物信息学方法.克隆了1个大鼠心肌缺血-再灌诱导表达上调的新基因MIP2,分析了新基因的若干特性:采用PCB从cDNA文库中克隆MIP2的开放阅读框.结果 MIP2定位于大鼠染色体1q42.12,含14个外显子和13个内含子,开放阅读框(ORF)为1 497 bp,编码498个氨基酸.在其编码蛋白的N-端含1个CTLH结构域.C-端有5个WD重复序列;MIP2的开放阅读框经测序证实与预测的完全一样;多组织膜RNA印迹证实了MIP2转录本的存在,且显示该基因在心与骨骼肌表达最高.其次是脾和睾丸,在其他组织表达较低或无表达.结论 成功克隆了1个大鼠心肌缺血一再灌诱导表迭上调的新基因MIP2.     

人REV3基因启动子区的克隆和生物信息学分析及其对MNNG的反应

目的：了解人REV3基因对化学致癌物N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱发转录上调的机制。方法：根据BLAST序列比对、启动子和转录因子结合部位预测软件，对人REV3基因促进子区进行生物信息学分析；用巢式PCR技术克隆了人REV3基因启动子区；用瞬时转染二重荧光素酶报道基因系统检测人REV3启动子对化学致癌物MNNG的反应。结果：生物信息学分析显示，人REV3基因启动子区位于6号染色体PAC克隆RP3-415N12，假设的启动子区有启动子序列、富含cpG岛和包括AP-1／c-Jun／c-Fos、AP-2、STAT、CREBP和NF-kB等的转录因子识别部位。将启动子区2582bp的片段插入荧光素酶报道基因载体pGL3-Basic中，构建了重组体质粒pGL3-2582。瞬时转染检测显示，该假设的启动子区确有启动子功能，对MNNG发生反应。结论：成功地克隆了人REV3基因启动子区，并证明其对MNNG发生反应。提示当细胞处于基因毒应激状态下可在转录水平调节REV3基因。     

细胞自身分化抗原-1启动子区域的克隆及其特性分析

目的：克隆不同长度的细胞自身分化抗原-1（CDA1)启动子区域并测定它们的活性,为进一步研究不同长度细胞自身分化抗原-1启动子（CDA1P）区域的功能打下基础。方法：以小鼠肝脏的全基因序列为模板,用PCR方法获得不同长度的目的片段,连接到pGL3-basic真核表达载体（pGL3-basic-mCDA1P）,纯化pGL3-basic mCDA1P质粒后,瞬时转染到Leuwis肺癌细胞和单核巨噬细胞(RAW264.7),48 h后收集转染细胞,测定萤光素酶活性,明确不同长度的CDA1P的活性。结果：①通过PCR法成功获得不同长度的CDA1P DNA片段,并用酶切法证实;②成功构建携带有CDA1P的pGL3-basic真核表达载体,并通过酶切法及测序证实; ③转染Leuwis肺癌细胞和单核巨噬细胞后测定萤光素酶活性发现不同长度的CDA1P活性不同,相同长度的CDA1P在Leuwis肺癌细胞和单核巨噬细胞中活性亦不相同。结论：CDA1P在不同细胞中活性可能存在差异。