DNMT3a通过STAT3及RAD51影响胰腺癌细胞对奥沙利铂敏感性的研究

目的:检测DNMT3a在胰腺癌细胞中的表达及对奥沙利铂（oxaliplatin，OXA）敏感性的影响，探讨DNMT3a对胰腺癌细胞奥沙利铂敏感性影响的机制。方法:MTT法检测奥沙利铂对人胰腺癌Panc-1细胞的增殖影响，及下调DNMT3a对Panc-1细胞奥沙利铂敏感性的影响。Western blot检测siDNMT3a对DNMT3a蛋白表达的影响，检测奥沙利铂及下调DNMT3a对γ-H2AX、RAD51、p-STAT3和STAT3蛋白表达的影响。流式细胞仪检测奥沙利铂及联合下调DNMT3a对Panc-1细胞凋亡的影响。结果:奥沙利铂能够以浓度依赖方式抑制胰腺癌Panc-1细胞的增殖。奥沙利铂能够引起DNA损伤、γ-H2AX上调及RAD51增高，同时引起STAT3通路的一过性活化。下调DNMT3a表达能够明显增加Panc-1细胞对奥沙利铂的敏感性，抑制STAT3一过性活化，并抑制RAD51表达，促进DNA损伤，进而增加奥沙利铂诱导Panc-1细胞的凋亡。结论:下调DNMT3a表达能够通过抑制STAT3活化及增加DNA损伤增加胰腺癌细胞对奥沙利铂的敏感性，DNMT3a有望成为胰腺癌新的治疗靶点。     

安罗替尼联合吉非替尼对吉非替尼耐药非小细胞肺癌PC9/GR细胞增殖的影响及其可能的作用机制

目的 探讨安罗替尼联合吉非替尼对吉非替尼耐药的人非小细胞肺癌PC9/GR(gefitinib resistance)细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法 依据不同给药情况将PC9/GR细胞分为安罗替尼单药组、吉非替尼单药组、安罗替尼和吉非替尼联合用药组及阴性对照组,用MTT法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞的周期分布,Western blot检测p-ERK1/2和p-AKT蛋白的表达水平。结果 安罗替尼和吉非替尼作用于PC9/GR细胞72 h的半数抑制浓度（half inhibitory concentration,IC50）分别为（1.91±0.18）μmol/L和（4.83±0.15）μmol/L,两药均呈剂量依赖性的抗增殖作用,且两药联合时表现出明显的协同效应,联合指数（combination index,CI）小于1。安罗替尼和吉非替尼单药均可将PC9/GR细胞阻滞于G0/G1期（均P<0.05）。与各单药组比较,联合用药组表现出更明显的G0/G1期阻滞（均P<0.05）,且下调p-ERK1/2和p-AKT蛋白的表达水平（均P<0.05）。结论 安...     

电离辐射克服NSCLC细胞株H1975吉非替尼耐药的体外研究

目的 探讨电离辐射联合吉非替尼对NSCLC耐药株H1975耐药突变、细胞凋亡及相关蛋白表达的影响及其可能机制。方法 实时荧光定量PCR对不同处理组H1975细胞的T790M突变进行相对定量分析;流式细胞仪检测不同处理组H1975细胞的凋亡率;免疫印迹检测不同处理组凋亡相关蛋白的表达水平。结果 2.5 Gy电离辐射组相较于0 Gy对照组,H1975细胞株T790M突变量降为原来的0.67倍,随电离辐射剂量的增高,T790M突变量降低（P＜0.05）;电离辐射联合吉非替尼组的细胞凋亡率为（44.35±8.49）%,相较于单独电离辐射组（21.84±5.62）%或吉非替尼组（17.38±6.78）%明显升高（P＜0.05）;电离辐射联合吉非替尼可诱导H1975细胞中磷酸化表皮生长因子受体（phosphorylated epidermal growth factor receptor, p-EGFR）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B, p-AKT）蛋白表达水平明显下调。结论 在吉非替尼耐药的NSCLC细胞株H1975中,电离辐射可以克服吉非替尼耐药,与吉非替尼有良好的协同作用。     

洛伐他汀克服非小细胞肺癌PC9细胞株吉非替尼耐药的体外研究

目的:研究联合洛伐他汀(lovastatin)和吉非替尼(gefi tinib)对体外诱导吉非替尼获得性耐药的非小细胞肺癌细胞株PC9细胞凋亡以及相关蛋白表达的影响,并探讨其可能的机制。方法:应用洛伐他汀联合吉非替尼处理耐吉非替尼的非小细胞肺癌PC9细胞株后,采用WST-1法检测不同药物处理对PC9细胞增殖的影响,Hoechst33342荧光染色法观察细胞凋亡形态,FCM法观察细胞凋亡状况,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果:洛伐他汀联合吉非替尼可在体外诱导耐吉非替尼的PC9细胞凋亡,抑制其细胞增殖;洛伐他汀联合吉非替尼可诱导耐吉非替尼的PC9细胞中磷酸化表皮生长因子受体(phosphorylated epidermal growth factor receptor,p-EGFR)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)和磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase1/2,p-ERK1/2)蛋白表达水平明显下调。结论:在体外诱导吉非替尼获得性耐药的非小细胞肺癌细胞株PC9中,洛伐他汀可以克服吉非替尼耐药,两者具有良好的协同作用,提示两药联合对于出现吉非替尼耐药的非小细胞肺癌的临床治疗可能具有很大的应用潜力。     

阿法替尼对人乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响及机制研究

  目的  探讨酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）阿法替尼（afatinib）对乳腺癌细胞增殖、周期及凋亡的影响,并就阿法替尼与吉非替尼（gefitinib）对乳腺癌细胞的作用进行比较。  方法  应用MTT法检测人乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、MDAMB-231细胞活性,流式细胞术的PI染色法检测细胞周期变化以及Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡,通过Western blot法检测蛋白表达情况。  结果  阿法替尼对MCF-7、T47D、MDA-MB-231细胞均有明显的抑制作用,IC₅₀分别为0.101、0.141、0.887 μmol/L。阿法替尼对T47D、MDA-MB-231细胞作用24 h后G₀/G₁期细胞比例明显升高,细胞凋亡率增加,晚期的凋亡率分别为88.9%、58.1%,并可促进细胞凋亡通路蛋白PARP、caspase-3发生剪切。阿法替尼、吉非替尼使MDA-MB-231细胞的EGFR磷酸化水平受到明显抑制,相同浓度下,阿法替尼作用较吉非替尼更强、持续时间更长。  结论  阿法替尼可显著抑制乳腺癌细胞增殖、促进其凋亡,且具有明显的量效关系,较吉非替尼具有更有效的作用。      

基因芯片技术筛选Gemcitabine诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡相关基因的研究

目的研究抗癌药吉斯他滨（Gemcitabine）诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡的相关基因。方法应用基因芯片技术检测50．33μg／mL Gemcitabine作用于胰腺癌Panc-1细胞48h后凋亡基因表达的变化。结果Gemcitabine抑制细胞表达14种凋亡相关基因，包括IRF-4、Scotin、14．3．3gamma、PDE4、GRPS、TID1、AFP、STAT5、Sox-4、c-Rel、MYCN、Htt、CatD、Gd。相反，gemcitabine促进了3种凋亡相关基因的表达，包括CyclinB1、ASK1、AKT2。结论Gemcitabine诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡通过非依赖caspase ASK1途径。     

TFPI-2基因对Panc-1细胞凋亡的影响

[目的]研究TFPI-2基因对胰腺癌细胞系Panc-1细胞增殖及凋亡的影响。[方法]测定Panc-1-TFPI-2、Panc-1-V和Panc-1-P三组细胞的生长曲线．DNA片段化实验检测细胞凋亡，并用流式细胞仪分析三组细胞的细胞增殖、细胞周期情况。[结果]Panc-1-TFPI-2细胞同Panc-1-V和Panc-1-P细胞相比，细胞生长缓慢，细胞生长受到抑制，被阻滞于G0～G1期；DNA片段化实验显示Panc-1-TFPI-2细胞呈现凋亡细胞特有的“梯状”条带．而Panc-1-V和Panc-1-P细胞无明显“梯状”条带：流式细胞仪分析显示早期Panc-1-TFPI-2细胞凋亡率（6．93％± 0．53％）较Panc-1-V（3．01％± 0．39％）和Panc-1-P细胞凋亡率（3．52％±0．41％）增加，有显著性差异（P〈0．05）。[结论]TFPI-2能够抑制胰腺癌细胞生长、诱导胰腺癌细胞凋亡．可能具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。     

吉非替尼对A549细胞增殖及细胞周期、凋亡的作用

目的：观察吉非替尼对人非小细胞肺癌A549的生长增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法：用5—40μmol／L浓度范围内的吉非替尼和A549细胞共培养24、48、72h,采用四甲基偶氮唑蓝（MTr）法检测吉非替尼对细胞增殖的影响;用流式细胞仪检测其对细胞凋亡及细胞周期分布的影响;利用抗Capspase-3的ELISA（酶联免疫吸附）法检测是否发生细胞凋亡。结果：在5—40μmol／L浓度范围内,吉非替尼对A549细胞的增殖有明显的抑制作用,并呈时间和剂量依赖性,以40μmol／L作用72h时的抑制率最高。流式细胞仪检测显示10μmol／L-401μmol／L的吉非替尼作用可使细胞发生G0／G,期阻滞,但即使作用48h也未发现凋亡细胞。ELISA法显示48h内,吉非替尼组与正常细胞组的Capspase-3浓度无统计学差异,但作用72h时出现凋亡。结论：吉非替尼在5—40μmol／L浓度下作用时间小于48h时,其对A549细胞的增殖抑制可能是通过阻滞A549细胞于G0／G1期而非引起细胞凋亡实现的,但作用时间达到72h时,其可以诱导A549发生细胞凋亡。     

TFPI-2基因在调控胰腺癌细胞凋亡中的作用

背景与目的：组织因子途径抑制物2（tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI-2）是新近发现的一种丝氨酸蛋白酶抑制物,与多种肿瘤发生发展有关。本实验研究将外源性TFPI-2基因转入对胰腺癌细胞株Panc-1观察TFPI-2对该细胞细胞增殖及凋亡的影响。方法：TFPI-2基因真核表达载体、空载体分别转染Panc-1细胞,并命名为Panc-1-TFPI-2,Panc-1-V细胞与未转染的对照细胞Panc-1分别测定细胞生长曲线,DNA片段化实验检测细胞凋亡,并用流式细胞仪分析3组细胞的细胞增殖、细胞周期情况。结果：Panc-1-TFPI-2细胞同Panc-1-V和Panc-1细胞相比,细胞生长缓慢,细胞生长受到抑制,被阻滞于G0-G1期;DNA片段化实验显示Panc-1-TFPI-2细胞呈现凋亡细胞特有的“梯状”条带,而Panc-1-V和Panc-1细胞无明显“梯状”条带;流式细胞仪分析显示早期Panc-1-TFPI-2细胞凋亡率（6.9±0.5）%较Panc-1-V和Panc-1细胞凋亡率[（3.0±0.4）%,（3.5±0.4）%]增加（P〈0.05）,统计学差异有显著性。结论：外源性TFPI-2基因能够抑制胰腺癌细胞生长、诱导胰腺癌细胞凋亡,可能具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。     

SU11274逆转肝细胞生长因子诱导不同EGFR基因型非小细胞肺癌细胞株对吉非替尼耐药

背景与目的：肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)诱导敏感非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)耐药,其机制与c-Met激活有关。本研究探讨c-Met抑制剂SU11274逆转HGF诱导的不同EGFR基因型NSCLC细胞株对吉非替尼耐药及逆转耐药机制。方法：选择人NSCLC细胞株PC9(EGFR突变型)、H292(EGFR野生型)和A549(EGFR野生型),应用吉非替尼和SU11274单独或联合作用于HGF诱导的细胞株。实验分为6组：C组(不加药对照组)、H组(HGF处理组)、G组(吉非替尼处理组)、S(SU11274处理组)、HG组(HGF+吉非替尼处理组)和HGS组(HGF+吉非替尼+SU11274处理组)。MTT法检测对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡的影响;应用蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中c-Met及其下游通道Stat3、Akt和Erk1/2蛋白表达水平。结果：吉非替尼对3种细胞的生长抑制作用均呈浓度依赖性,HGF处理能够缓解吉非替尼的增殖抑制作用(P<0.05);不同浓度吉非替尼联合SU11274作用于HGF诱导细胞时,3种细胞株存活率比吉非替尼单独作用于HGF诱导细胞时明显降低(P<0.05);HGS组的细胞凋亡比HG组明显增加(P<0.05);HGS组的c-Met、Stat3、Akt和Erk1/2活化蛋白量比HG组明显减少。结论：c-Met抑制剂SU11274可逆转HGF诱导的不同EGFR基因型NSCLC细胞株对吉非替尼耐药,其机制可能与抑制HGF活化的c-Met及其下游通道蛋白表达有关。     

STAT3基因沉默对胰腺癌细胞放射敏感性的影响及其机制

目的:探讨信号转导和转录激活因子3（STAT3）基因沉默对人胰腺癌细胞AsPC-1和PANC-1放射敏感性的影响及其机制。方法:体外培养人胰腺癌细胞AsPC-1和PANC-1，通过脂质体转染STAT3 shRNA作为实验组（shSTAT3组），设置阴性对照（shNC组）和空白对照组（NC组）。采用qRT-PCR检测转染后各组AsPC-1和PANC-1细胞中STAT3 mRNA表达水平，Western blot检测细胞中STAT3蛋白表达水平。MTT实验检测各组细胞增殖能力，流式细胞仪检测各组细胞电子射线照射后的凋亡情况，qRT-PCR和Western blot分别检测各组细胞电子射线照射后的Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA和蛋白的表达情况。结果:shSTAT3组AsPC-1和PANC-1细胞中STAT3 mRNA和蛋白表达水平比NC组和shNC组明显降低（P<0.05）。接受电子射线照射后，shSTAT3组AsPC-1和PANC-1细胞增殖率显著低于shNC组（P<0.05），其细胞凋亡率较shNC组明显升高（P<0.05）。接受电子射线照射后，转染STAT3 shRNA后能够明显上调细胞中Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2的表达（P<0.05）。结论:沉默STAT3基因能够通过上调Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2的表达促进细胞凋亡，增强胰腺癌细胞的放射敏感性。     

阻断STAT3信号转导通路对人胰腺癌细胞生长的影响

目的：探讨Janus激酶（Janus kinase，JAK）特异性抑制剂AG490阻断STAT3信号转导通路对高表达STAT3的人胰腺癌细胞系SW1990生长增殖的怍用及其机制。方法：使用AG490处理人胰腺癌细胞系SW1990，MTT法检测细胞增殖状态，流式细胞仪检测细胞凋亡，Western blot检测STAT3信号转导通路成员的表达。结果：AG490作用于人胰腺癌细胞系SW1990后，细胞增殖水平明显下降（P〈0．05）；细胞凋亡百分比显著升高（P〈0．05）；Western blot显示SW1990细胞中磷酸化STAT3（p-STAT3）、bcl-xL和cyclin D1蛋白表达明显降低（P〈0．05）。结论：STAT3信号转导通路在胰腺癌进展过程中起着重要作用；阻断STAT3信号转导通路可抑制人胰腺癌细胞增殖，促进其凋亡；以STAT3信号转导通路为靶点的治疗策略可能为胰腺癌治疗提供新的思路。     

miR-125a-5p通过靶向STAT3 抑制肾癌细胞增殖和侵袭及其可能机制

目的：探究miR-125a-5p 靶向STAT3 对肾癌细胞增殖和侵袭的影响,并初步分析其作用机制。方法：选取2017 年3月至2018 年2 月于北部战区空军医院泌尿外科接受肾癌手术治疗的癌组织及配对的癌旁组织灶边缘（距癌缘>3 cm）标本各48例,体外培养正常肾细胞HK-2、和肾癌细胞A498、GRC-1、786-O及ACHN,采用qPCR 检测组织和细胞中miR-125a-5p 的表达。分别将miR-125a-5p-NC、miR-125a-5p-mimics、pLV-STAT3 及pLV-STAT3+miR-125a-5p mimics 转染A498 细胞作为NC组（阴性对照组）、miR-125a-5p-mimics 组、pLV-STAT3 组及pLV-STAT3+mimics 组,另外以正常培养A498 细胞作为空白对照组（Control,Ctrl）,采用qPCR检测各组细胞中miR-125a-5p、信号转导和转录激活因子3（STAT3）mRNA的表达。应用生物信息学预测软件和双荧光素酶法分析miR-125a-5p 与STAT3 的靶向关系;采用CCK-8 检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室法检测细胞侵袭能力;WB检测细胞中STAT3、B 细胞淋巴瘤/白血病-2 蛋白(Bcl-2)、B 细胞淋巴瘤/白血病-2 相关X 蛋白(BAX)、活化半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3 蛋白（cl-caspase-3）、抑癌基因p21、神经钙黏素（N-cadherin）、钙黏蛋白（E-cadherin）、血管内皮生长因子（VEGF）及缺氧诱导因子-1（HIF-1）的表达。结果：miR-125a-5p 在肾癌组织和细胞中表达显著低于癌旁组织和正常肾细胞（均P<0.05）;相较于NC组,转染miR-125a-5p-mimics 后A498 细胞中miR-125a-5p 的表达显著上升、STAT3mRNA的表达显著下降（均P<0.01）。实验证实STAT3 为miR-125a-5p 的靶基因。与NC组相比,miR-125a-5pmimics 组细胞增殖活性、侵袭细胞数及Bcl-2、N-cadherin、VEGF、HIF-1、STAT3 及其磷酸化水平均显著下降（均P<0.05）,凋亡率及BAX、p21、cl-caspase-3 及E-cadherin 表达显著上升（均P<0.05）;pLV-STAT3 组细胞增殖活性、侵袭细胞数及Bcl-2、N-cadherin、VEGF、HIF-1、STAT3 及其磷酸化水平显著上升（均P<0.05）,凋亡率及BAX、p21、cl-caspase-3、E-cadherin 表达显著下降（均P<0.05）。与pLVSTAT3组相比,pLV-STAT3 mimics 组细胞增殖活性、侵袭细胞数、Bcl-2、N-cadherin、VEGF、HIF-1、STAT3 及其磷酸化水平显著下降（均P<0.05）,凋亡率、BAX、p21、cl-caspase-3 及E-cadherin 表达显著上升（均P<0.05）。结论：miR-125a-5p 在肾癌组织和细胞中呈低表达,可通过下调其靶基因STAT3 抑制A498 细胞的增殖和侵袭,并促进其凋亡。     

化学合成siRNA对卵巢癌SKOV3细胞中STAT3基因表达的抑制作用

目的:观察小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对卵巢癌SKOV3细胞STAT3表达的抑制作用及其诱导凋亡作用的机制。方法:将STAT3 siRNA经LipofectamineTM2000脂质体介导的方法将其转染到卵巢癌细胞株SKOV3。实验分为以下3组:空白对照组(未经转染的人卵巢癌SKOV3细胞)、阴性对照转染组(阴性干扰STAT3)及特异性转染组(干扰STAT3)。用MTT法检测siRNA转染后SKOV3细胞增殖活性;流式细胞仪检测其对细胞凋亡的影响,免疫荧光法检测STAT3蛋白水平的变化,qRT-PCR和Western blot方法分别检测STAT3 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:成功转染STAT3干扰片段,转染率达90%。siRNA干扰STAT3组明显抑制卵巢癌细胞增殖活性,细胞凋亡率33.7%,并且下调STAT3蛋白在SKOV3细胞中的表达。RT-PCR和Western blot结果显示:siRNA STAT3组明显抑制人卵巢癌细胞SKOV3中STAT3 mRNA和蛋白的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:特异性转染组48h后能有效地抑制SK-OV3细胞内STAT3的表达、抑制细胞增殖,其抑制卵巢癌细胞的机制可能与抑制了STAT3信号通路,促进细胞凋亡有关,为卵巢癌的生物治疗提供了一定的依据。     

凋亡抑制蛋白XIAP和促凋亡因子Smac在胰腺癌化疗抵抗中的调控作用

Objective： To investigate the relation of X-linked inhibitor of apoptosis （XIAP） and second mitochondria-derived activator of caspase （Smac） signaling pathway to chemoresistance in human pancreatic cancer Panc-1 and BXPC-3 cells. Methods： Apoptosis and the changes of XIAP expression in permeabilized cells induced by cisplatin and 5-fluorouracil （FU） were measured by flow cytometry. The cytosolic expression of XIAP, Smac and caspase-3 was detected by Western blot. A recombinant plasmid vector pEGFP-N1/Smac was constructed and transfected into of Pancol cells. The effect of cytosolic overexpression of Smac on apoptosis of Panc-1 cells was evaluated by flow cytometry. Results： Panc-1 was more resistant to cisplatin or 5-FU induced apoptosis than BXPC-3. Western blot revealed that chemoresistant Panc-1 highly expressed XIAP, and increased cytosolic expression of Smac might be responsible for the marked down-regulation of XIAP in chemo-sensitive BXPC-3 cells after exposure to cisplatin or 5-FU. Furthermore, cytosolic overexpression of Smac could significantly down-regulate the levels of XIAP and promote the activity of caspase-3, as well as sensitize Panc-1 cells to anticancer drug-induced apoptosis. Conclusion： Anticancer drug-induced apoptosis requires mitochondrial release of Smac and downregulation of XIAP, which may be an important determinant of chemo-sensitivity in pancreatic cancer cells. Up-regulation of cytosolic expression of Smac may act as an effective modifying signal to overcome apoptosis resistance to chemotherapy in pancreatic cancer cells.     

Curcumin augments gemcitabine cytotoxic effect on pancreatic adenocarcinoma cell lines

Background and aim: Gemcitabine, the first-line agent in pancreatic adenocarcinoma, has shown limited clinical benefit. Cyclooxygenase-2 (COX-2) represent one of the most promising targets for cancer prevention and treatment. In this study, we investigated whether the phytochemical curcumin, a natural COX-2 inhibitor, can potentiate gemcitabine effect on survival of human pancreatic cancer cells. Methods: P34 (high COX-2 expression) and Panc-1 (low COX-2 expression) pancreatic cancer cell lines were exposed to different concentrations of gemcitabine (0.1-10 μM), curcumin (0-50 μM), and their combination. Cell viability was evaluated by XTT assay. Cell cycle and apoptosis were assessed by flow cytometry. COX-2, EGFR, and p-ERK1/2 expression was measured by Western blot analysis. Results: Curcumin increased the inhibitory effect of gemcitabine on cell viability as well as its pro-apoptotic effect in COX-2 positive, p34 cells, but not in COX-2 negative, Panc-1 cells. In p34 cells, combination of curcumin and gemcitabine downregulated both COX-2 and p-ERK1/2 in a dose-dependent manner. Conclusion: The increased cytotoxic effect of the combination on cell survival and on the induction of apoptosis in COX-2 expressing pancreatic cancer cells is probably associated with downregulation of COX-2 and p-ERK1/2 levels. This finding may contribute to the development of an effective treatment of pancreatic adenocarcinoma.