基于分子模拟技术筛选宽体金线蛭抗凝活性肽

目的：采用分子模拟技术从宽体金线蛭来源多肽库中筛选抗凝活性多肽,结合分子对接初筛及分子动力学模拟复筛,最终通过抗凝实验验证得到宽体金线蛭抗凝活性多肽。方法：利用虚拟酶切技术对宽体金线蛭蛋白库进行酶切,得到宽体金线蛭多肽候选库;选择凝血酶为凝血活性靶点,采用HPEPDOCK及Discovery Studio CDOCKER两种方法进行分子对接,并利用分子动力学模拟技术对分子对接初筛结果中对接结合能高的复合物进行动力学模拟复筛,通过MM-PBSA模块分析计算凝血酶-多肽复合物结合自由能;最后采用固相合成法化学合成复筛中稳定结合的宽体金线蛭多肽并进行体外抗凝活性测定。结果：经过虚拟酶切共得到3317条无毒多肽,通过分子对接进行初筛,结合分子动力学模拟复筛,得到1条结合凝血酶效果最好的目标抗凝肽,该多肽序列为QNTVGLDDFFSSYER,结合自由能为–427.506 kJ·mol^–1。凝血酶Arg233残基是该凝血酶-多肽复合物中介导结合相互作用的关键氨基酸。该宽体金线蛭抗凝肽在体外活性测定中确能延长凝血酶时间。结论：利用分子模拟技术有效筛选出1条宽体金线蛭抗凝活性肽,...     

生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性测定的研究

 目的 将生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性的测定,探讨反映水蛭生物活性的质量控制方法。方法 采用肝素钠作为对照品,选择活化部分凝血酶时间值作为抗凝活性评价依据,对宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭、棒纹牛蛭的抗凝活性进行测定,测定结果分别用标准曲线法和生物检定统计法计算。结果 4种水蛭活性部分凝血酶时间法的量效关系曲线与肝素的量效关系曲线类似,突跃范围呈平行关系,上述特点符合生物检定的要求,以肝素钠作为标准品,采用生物检定技术活性部分凝血酶时间法测定水蛭等的抗凝活性是可行的。结论 活化部分凝血酶时间值可以全面反映水蛭的抗凝血作用,测定结果对临床使用更具指导意义。生物检定技术应用于中药质量评价,是对现有中药质量标准控制方法良好的补充。     

水蛭抗凝活性检测两种滴定方法比较

目的:比较药典标准凝血酶滴定法和白瓷板法对中药水蛭抗凝活性检测结果的影响。方法:分别采用《中国药典》中凝血酶滴定法和云南省《菲牛蛭冻干粉中药饮片炮制规范征求意见稿》中白瓷板法对水蛭抗凝活性进行多次平行滴定实验。结果:抗凝活性成分含量较高的菲牛蛭其药典法滴定结果重复性更稳定,白瓷板滴定法结果的重复性会随着单次进样量减少而趋于稳定;宽体金线蛭的抗凝活性结果在两种方法的对比检测下均较为稳定。结论:对于吸血水蛭品种抗凝活性的测量,建议保留原凝血酶滴定法;对于抗凝活性较低,实验中凝血酶溶液浓度较小的水蛭品种,两种滴定法均适用,也可同时应用互相验证。另在滴定操作中,将反应试管改换成玻璃液相进样瓶,且在滴定动作后将反应容器呈一定角度倾斜放置,有助于对反应终点进行判断,提高实验结果的准确性和稳定性。     

识别真伪水蛭

水蛭又名蛭蝚、马鳖,为水蛭科动物日本医蛭、宽体金线蛭、茶色蛭等的全体。其中,日本医蛭的干燥品称“水蛭”;宽体金线蛭的干燥品称为“宽水蛭”;茶色蛭的干燥品称为“长条水蛭”。水蛭性平,味咸苦,有毒,入肝、膀胱经,具有破血、逐瘀、通经的功效,为破逐瘀血之要药,用于治疗癥瘕、积聚、蓄血、妇女经闭、干血成痨、跌扑损伤、目赤肿痛、眼生云翳等症。     

日本医蛭抗凝活性研究

目的:研究分析人工养殖条件下日本医蛭活体、干品的抗凝活性,为日本医蛭合理入药提供参考。方法:根据中国药典规定,采用凝血酶滴定法对不同处理的日本医蛭样品进行测试。结果:发现日本医蛭抗凝活性依次为超低温冻干品、鲜品、晒干品。结论:保证日本医蛭最佳抗凝活性的方法为超低温冻干。     

水蛭抗凝抗血栓活性及其与品种、提取方法的关系

水蛭为环节动物门蛭纲动物,《中国药典》收载了水蛭科动物蚂蟥（宽体金线蛭,Whitmania pigra Whitman）、水蛭（日本医蛭,Hirudo nipponica Whitman）、柳叶蚂蟥（尖细金线蛭,Whitmania acranulata Whitman）三个品种。水蛭有破血、逐血、通经的功效,用于瘕瘕痞块,血瘀闭经,跌扑损伤。水蛭具有抗纤溶、抑制血小板活化、抗血栓、改善血液流变性、降晤和抗动脉粥样硬化等药理作用。本文着重综述水蛭的抗凝抗血栓活性,分析水蛭抗凝血活性与品种、提取方法的相关性。     

两种水蛭抗凝血作用的初步研究

本文比较了国内最常见的两种水蛭品种的不同提取工艺处理后的抗凝血酶活性,发现非高温处理的日本医蛭抗凝血酶活性明显强于宽体金线蛭。     

宽体金线蛭有效成分分子量分布和纯化工艺考察

目的:采用不同方法对宽体金线蛭活性溶液进行不同分子量的含量测定和物质分离,获得最优条件。方法:采用不同分子通透性的透析膜对宽体金线蛭活性溶液进行分子量的含量测定。再分别采用大孔树脂、Q Sepharose FF、SP Sepharose FF对宽体金线蛭活性溶液进行纯化。通过考察不同纯化条件以达到分离有效物质的目的,并结合体外抗凝实验对最佳组分进行活性检测。结果:分别采用500 Da、1000 Da、3000 Da的透析膜对活性溶液进行分子量含量测定,得出500 Da的物质占37.6%;500 Da~1000 Da的物质占到18.5%;1000 Da~3000 Da的物质占28.1%;3000 Da物质占到15.7%。采用大孔树脂DA201-C处理得出50%乙醇洗脱液具有很好的活性。再采用Q Sepharose FF、SP Sepharose FF分别对宽体金线蛭活性溶液进行处理,采用不同洗脱剂进行洗脱然后进行活性验证得出1.0%Na Cl的p H值=8.5的Tris缓冲溶液洗脱组分活性比较强。结论:采用不同方法对宽体金线蛭活性溶液进行研究,获得较纯的活性组分,为后期的继续研究做好基础。     

宽体金线蛭的特异性PCR分子鉴定

[目的] 实验旨在通过寻找宽体金线蛭单核苷酸多态性（SNP）位点,设计宽体金线蛭的特异性鉴别引物,建立宽体金线蛭特异性聚合酶链式反应（PCR）检测方法,实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别。[方法] 通过比对宽体金线蛭与其常见混伪品的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）序列,寻找宽体金线蛭COI基因序列内SNP位点,设计特异性鉴别引物。[结果] 进行PCR后仅宽体金线蛭能够扩增得到149 bp的条带,混伪品不能扩增出明显目的条带。向扩增产物中加入SYBR Green I核酸染料染色,宽体金线蛭样品在紫外灯下显黄绿色荧光,混伪品不显荧光。[结论] 该方法能够准确快速鉴别宽体金线蛭与其常见混伪品,为中药材市场上宽体金线蛭的快速鉴别提供技术支持。     

日本医蛭不同萃取部位体外抗凝活性的实验研究

目的研究日本医蛭不同萃取部位的抗凝活性,为日本医蛭的新药开发提供依据。方法SD大鼠腹主脉取血,应用血凝仪体外测定凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）和活化的部分凝血活酶时间（APTT）。结果日本医蛭的总提物能使大鼠PT,TT,APTT时间显著延长;石油醚部位能使大鼠PT,APTT延长。结论中药日本医蛭的低极性小分子具有抗凝活性。     

中国水蛭人工养殖的现行模式调研

为明确我国水蛭现有的人工养殖模式,历时近3个月的时间,对搜集的业内信息和网络宣传的重庆、湖北等9个省市的34个水蛭人工养殖基地实地考察。结果表明,水蛭的人工养殖基地主要分布在我国东南部江南水乡一带的江苏和安徽;以散户小面积养殖为主;养殖的品种以宽体金线蛭为主;养殖方式以“池塘+网箱”为主;“生产+收购+技术培训”是水蛭人工养殖基地的主要经营方式;预测未来一段时间内在全国各地会涌现更多以个体户小面积养殖为主的宽体金线蛭养殖基地。市场上流通的宽体金线蛭成品以水货主,并主要销往国内相关药企。江苏、安徽和湖北部分水蛭养殖基地的设施设备体系最完善,生产和研究实力相对最强。     

宽体金线蛭室内产茧、孵化及仔蛭饥饿研究

目的：建立宽体金线蛭室内网箱湿土养殖新模式,为中药材生产质量管理规范及规模化繁养殖提供参考依据。方法：以野外采捕的具有生殖环带的宽体金线蛭为试验材料,在室内采用网箱湿土法养殖,进行宽体金线蛭产茧、卵茧孵化及仔蛭饥饿试验研究。结果：亲蛭采用网箱湿土法养殖17d,其平均成活率为90％;产茧前具有生殖环带（土黄色）,产茧后生殖环带消失;亲蛭产卵茧后平均体重下降率达（29．94±0．01）％;产卵茧期间共收获卵茧79枚,平均产茧量为1．8枚／条,卯茧平均重量为（0．50±0．21）g／枚,平均长径和短径分别为（1．75±0．31）cm／枚和（1．10±0．18）cm／枚;卵茧在室温下（14—33℃）孵育34d,共孵出仔蛭865条,每枚卵茧孵出（11．4±2．0）条仔蛭,卵茧孵化率达92．57％。初孵仔蛭平均个体体重为（0．0205±0．0084）g。饥饿试验表明,在140d时,对照组存活11条水蛭,成活率仅22％,其平均个体体重为（0．1084±0．0877）g,仔蛭个体体重有随日龄的增加而增加趋势;饥饿组仔蛭在140d时全部死亡。结论：在适宜的条件下,采用网箱湿土养殖法,宽体金线蛭可在室内产茧,卵茧集中孵育及亲蛭和仔蛭分开饲养。     

水蛭抗凝血活性成分的研究

目的：研究水蛭的抗凝血成分。方法：以血浆复钙时间为指标，应用Sephadex DEAE A-50阴离子交换树脂色谱、Sephadex G-25和Sephadex LH-20凝胶过滤色谱及反相高压液相色谱技术分离纯化。结果：得到3个抗凝血活性多肽，其中化合物1，2在自然条件下互相转化，它们的相对分子质量分别为7 100和5 531；采用HPLC及SDS-PAGE鉴定了化合物3的纯度，采用MALDI-TOF-MS法测定出其相对分子质量为8 608，并测定了其氨基酸组成。结论：推测化合物3为首次分离得到的抗凝血多肽，命名为蚂蟥多肽(whitmanin)。     

5种水蛭中尿嘧啶,黄嘌呤,次黄嘌呤的含量比较

采用反相HPLC法测定了宽体金线蛭、光润金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭及不同产地的宽体金线蛭中尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤的含量。色谱柱为Shim-pack CLC-ODS C_(18)柱,流动相:0.05mol/l的磷酸氢二铵溶液(pH=8.4),流速:0.8ml/min,检测波长:254nm,回收率:>98.0％。本法准确、快速、重现性好。     

蛭类转录组中EST-SSR分析及抗凝血相关分子标记的挖掘

目的对蛭类转录组进行SSR分析,是开发功能分子标记、开展对药用蛭类资源的开发利用及进行遗传背景监测的必要手段。方法利用与医学密切相关的医蛭科棒纹牛蛭Poecilobdella javanica和日本医蛭Hirudo nipponia、黄蛭科宽体金线蛭Whitmania pigra和山蛭科洞穴山蛭Heamadipsa cavatuses sp.nov.共14个样本,通过RNA测序及转录组分析,筛选吸血差异unigene,并比较4个种的SSR标记特征和分布,用于挖掘抗凝血相关功能EST-SSR。结果通过SSR密度分析发现,SSR在棒纹牛蛭、日本医蛭、宽体金线蛭和洞穴山蛭转录组中的间隔长度为4 723、6 026、8 059、8 144 bp;SSR组成分析发现三碱基重复的基序占蛭类SSR类型组成中绝大多数;另外,洞穴山蛭的SSR组成与其他3种存在明显区别。比较4种吸血蛭吸血前后转录组中表达丰度显著差异的unigene群,发现4种蛭中包含SSR且抗凝血相关的重叠unigene类群在转录组中呈较高的片段多态性。结论 unigene片段长度、SSR的密度、组成和分布特点能反映物种之间的分类关系;4种蛭重叠的抗凝血相关分子功能对应的EST-SSR,可作为抗凝血相关的功能分子标记侯选EST-SSR。     

四种不同品种水蛭生物活性的研究与比较

目的:应用3种酶活性抑制方法测定四种不同品种水蛭的生物活性,为评价水蛭药材质量提供科学依据。方法:分别采用抗凝血酶、抗胰蛋白酶和抗糜蛋白酶3种检测方法,测定了宽体金线蛭、日本医蛭、欧洲医蛭、菲牛蛭样品的生物活性。结果:4种水蛭中,吸血水蛭具有更好的抗凝血酶活性;4种水蛭均具有较好的抗胰蛋白酶和抗糜蛋白酶生物活性。结论:3种酶活性抑制方法可作为水蛭类药材质量控制的依据。     

中药水蛭品种考证及资源可持续利用发展探讨

该文通过系统地本草文献梳理与研究指出,传统中医使用的水蛭是生于水中,个头较小且能吸食人及牛马血的水蛭.具有这些特性的水蛭的品种有日本医蛭Hirudo nipponia Whitman、丽医蛭H.pulchra Song、南京牛蛭Poecilobdella nanjingensis sp.Nov.、菲牛蛭P.manillensis (Lesson)以及湖北牛蛭P.hubeiensis Yang 5个品种,与2010年版《中国药典》水蛭项下所规定的动物品种来源不完全一致.建议《中国药典》修改并补充水蛭的品种来源,保留原有日本医蛭H.nipponica Whitman,增补菲牛蛭P.manillensis (Lesson),暂时保留宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman、尖细金线蛭W.acranulata Whitman,并进一步加强丽医蛭H.pulchra Song、南京牛蛭P.nanjingensis sp.Nov.以及湖北牛蛭P.hubeiensis Yang的化学成分和药理作用以及资源分布的研究,以待作为药用品种补充.     

温度和体重对蚂蟥人工繁殖影响的研究

目的：确定蚂蟥的最佳产卵温度、体重以及孵化的最适温度。方法：在不同温度、体重条件下观察蚂蟥产卵和孵化。结果与结论：蚂蟥产卵和孵化的最适温度是25 ℃,产卵的最佳体重为20 g左右；温度能影响蚂蟥产卵前后的体重,而体重对其的影响不明显；当卵重在0.1～2.0 g时与孵出量成正比,当卵重大于2.0 g时孵出量反而有所下降。     

水蛭饮片规格质量的调查及实验研究

调查及实验证明,水蛭以蚂蟥为主流药用品种。切丝入药溶出效果最优。对水蛭3种炮制品的质量从浸出物限量、薄层层析、蛋白电泳、体外抗凝效价方面进行了定量、定性研究。     

蚂蟥蛋白激酶C基因的克隆和表达分析

蛋白激酶C(PKC)是一类广泛参与细胞增殖和发育的蛋白激酶,但在雌雄同体动物蚂蟥性腺中的发育机制尚不清楚。为探究蛋白激酶C在蚂蟥生殖细胞的发育过程中的作用,该研究克隆蚂蟥PKC基因,进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR技术进行雌雄性腺的表达分析。结果表明:(1)克隆得到的Wp-PKC全长2580 bp,相对分子质量76555.19,包含1个编码670个氨基酸的开放阅读框,Wp-PKC和斑马鱼PKC-α及大鼠的PKC-γ亲缘关系较近,氨基酸序列相似度为55%和58%;(2)Wp-PKC编码的蛋白无信号肽,属于亲水性性蛋白,二级结构主要由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、折叠和组成,以无规则卷曲、α-螺旋占比最多,Wp-PKC蛋白不含有跨膜结构域,多序列比对和结构域预测分析显示,Wp-PKC包含4个经典蛋白激酶C的保守结构域;(3)荧光定量的结果显示Wp-PKC在蚂蟥性腺中的表达与生殖细胞的发育呈正相关,其中雄性腺中的表达显著高于雌性腺。综上,Wp-PKC为经典PKC,Wp-PKC可能对蚂蟥性腺发育尤其雄性腺发育起了促进作用,为蚂蟥性腺发育机制的进一步研究提供参考。