miR-145-5p通过靶向RAD18 调控结直肠癌细胞的增殖与NK细胞的细胞毒作用

目的：探索RAD18 影响结直肠癌细胞增殖及调节NK细胞对结直肠细胞的杀伤作用及其可能的机制。方法：采用生物信息学技术分析结直肠癌组织中RAD18 和miR-145-5p的表达及两者之间的调控关系、分析RAD18 富集通路。采用qPCR法验证RAD18和miR-145-5p在结直肠癌细胞中的表达，双荧光素酶报告基因实验验证miR-145-5p与RAD18的调控关系。按转染物的不同将SW480、HCT-15 细胞分为将si-RAD18 组、si-NC 组，另向SW480 细胞分别转染inhibitor-NC+si-NC、miR-145-5pinhibitor+si-NC 或miR-145-5p inhibitor+si-RAD18，采用CCK-8 法、克隆形成实验分别检测敲降miR-145-5p 和/或RAD18 对细胞增殖、克隆形成的影响；将各组细胞分别与经IL-2激活的NK92细胞共培养，采用乳酸脱氢酶释放法、ELISA和免疫荧光染色法分别检测NK细胞的细胞毒性、细胞因子分泌及细胞表面穿孔素和颗粒酶B表达的影响。结果：RAD18 在结直肠癌组织和细胞中呈高表达（均P<0.01）。敲降RAD18 可以抑制结直肠癌细胞增殖能力（P<0.05）和促进NK 细胞活力、细胞毒性、IFN-γ、TNF-α、 GM-CSF 分泌及穿孔素和颗粒酶B的表达（均P<0.05）。双荧光素酶报告实验验证了RAD18-3’UTR与miR-145-5p的结合关系，miR-145-5p 在结直肠癌组织和细胞中低表达（P<0.05 或P<0.01）。miR-145-5p 可以靶向下调RAD18 的表达（P<0.05），过表达RAD18 可以逆转miR-145-5p 过表达对NK 细胞杀伤效应的促进作用（均P<0.05）。结论：miR-145-5p 可靶向下调RAD18 的表达，miR-145-5p/RAD18轴能够影响结直肠癌细胞的增殖和NK细胞对其的细胞毒作用。     

颗粒外排与Fas/Fas配体途径在人γδT细胞的肿瘤细胞毒活性中的作用

目的：探讨结核杆菌抗原（Mtb-Ag)特异性活化的γδT细胞杀伤肿瘤细胞的细胞毒活性机制。方法：用Mtb-Ag刺激正常人PBMC以诱导γδT细胞扩增并用磁珠阳性分选法获得高纯度γδT细胞;用RT－PCR法检测γδT细胞穿孔素,颗粒酶B和FasL mRNA的表达;用流式细胞仪检测γδT细胞表面Fas配体（FasL）分子以及几种肿瘤细胞表面Fas分子的表达;用MTT法测定γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性,观察穿孔素／颗粒酶途径的阻断剂concanamycin A(CMA)和Fas/FasL途径的抑制剂berfeldinA(BFA)对γδT细胞细胞毒活性的影响,结果：经Mtb-Ag激活和扩增的γδT细胞高表达穿孔素,颗粒酶B和K562和PG）的杀伤,BFA能强烈抑制γδT细胞杀伤Fas高表面的Raji和A375,结论：Mtb-Ag活化的γδT细胞杀伤Fas低表达的靶细胞时主要通过颗粒外排途径,杀伤Fas高表达的靶细胞时,颗粒外排和FasL均起作用。     

血小板对外周血纯化、扩增的NK细胞杀伤K562细胞的影响

目的探讨血小板对外周血纯化、扩增的NK细胞杀伤作用的影响.方法使血小板与K562细胞在体外共孵育,以显微镜和流氏细胞仪检测血小板与K562细胞的粘附.从外周血单个核细胞中分离纯化、扩增NK细胞,以MTT法研究血小板对纯化、扩增的NK细胞杀伤活性的影响.结果K562细胞体外能结合血小板,粘附率达到25%±4.3%.纯化NK细胞总计数为2.53×107个,比例为46.8%;经扩增后NK细胞总计1.34×108个,比例增加到62.2%,扩增倍数达5.32倍.血小板比肿瘤细胞为250:1时,能减少NK细胞43.15%的杀伤作用.血小板比肿瘤细胞为1000:1时,能减少NK细胞84.05%的杀伤作用.结论血小板能粘附肿瘤细胞、抑制外周血纯化、扩增的NK细胞对K562细胞的杀伤作用.     

FBXW7基因点突变对结直肠癌HCT-116细胞的增殖、迁移、侵袭和抗 凋亡能力的影响

目的： 探讨FBXW7基因点突变对结直肠癌细胞株HCT-116增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。 方法： 通过构建FBXW7 基因野生型及突变型过表达的重组载体,并将其转染HCT-116细胞,应用Western blotting检测转染后FBXW7蛋白表达情况。 CCK-8检测细胞增殖能力,平板细胞克隆形成实验(HTCA)检测肿瘤细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,划痕及 Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移和侵袭能力。 结果： 转染野生型FBXW7基因的HCT-116细胞中FBXW7蛋白表达水平高 于对照组（转染突变型FBXW7基因的HCT-116细胞）、阴性对照组（转染空质粒载体pEZ-M90的HCT-116细胞）及空白对照组（未 进行任何特殊处理的HCT-116细胞） （均P<0.05）。转染野生型FBXW7的HCT-116细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力相较 于其余各组均显著下降（均P<0.05）,且细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。 结论： FBXW7基因点突变可使其蛋白表达水平降低,从 而促进结直肠癌HCT-116细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制其凋亡。     

MICA基因多态性与乳腺癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性

目的：探讨MHC-Ⅰ类链相关分子A（MHC class I chain-related molecule A,MICA）多态性与乳腺癌细胞对NK细胞杀伤敏感性的关系。方法：测序分析乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S和SK-BR-3 的MICA等位基因,用Western blotting 和流式细胞术检测MICA 重组表达载体转染293T 细胞（分别命名为pMCFA5.1、pMCFA4、p231A5R、p231A9 和p435A5P）MICA蛋白的表达水平,用LDH法检测NK细胞对转染MICA的293T细胞的杀伤活性,酶联免疫斑点法检测NK细胞穿孔素、颗粒酶B分泌水平。结果：MCF-7 细胞表达MICA*008/A5.1 和MICA*001/A4,MDA-MB-231 和SK-BR-3 细胞均表达MICA*019/A5 和MICA*002/A9,MDA-MB-435S 细胞表达MICA*010/A5。转染MICA 后,pMCFA5.1 组293T 细胞MICA蛋白的表达水平最低（P<0.05）,p435A5P组次之（P<0.05）,pMCFA4 组、p231A5R组和p231A9 组表达水平较高（均P<0.05）。NK细胞对转染MICA的293T细胞杀伤活性及穿孔素、颗粒酶B分泌：p435A5P组对NK细胞杀伤的敏感性最低（P<0.05）,穿孔素、颗粒酶B分泌水平最低（均P<0.05）;pMCFA5.1、pMCFA4、p231A5R和p231A9 各组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：MICA基因多态性与乳腺癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性密切相关。     

体外扩增肾癌患者自体NK细胞及其对人肾细胞癌786-O细胞的杀伤

目的:探究IL-15、4-1BBL基因修饰的人白血病K562细胞(modi-K562细胞)联合IL-2体外高效扩增肾细胞癌患者自体自然杀伤(natural killer,NK)细胞的方法,研究扩增前后NK细胞对肾癌细胞株786-O的杀伤作用。方法:10例肾癌患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)与modi-K562细胞在含不同浓度IL-2培养液中共育14 d,采用流式细胞术、Calcein-AM释放实验检测NK细胞的扩增情况、免疫表型及对肾癌786-O细胞的杀伤作用。结果:modi-K562细胞联合IL-2可有效扩增NK细胞,300 U/ml IL-2培养14 d时,NK细胞扩增(202.4±12.8)倍。在效靶比为20∶1时,扩增后NK细胞对786-O细胞的杀伤率为(72.0±4.3)%,显著高于扩增前NK细胞的杀伤率(34.2±3.6)%(P<0.01)。结论:IL-15、4-1BBL基因修饰的K562细胞联合IL-2在体外能有效扩增肾细胞癌患者NK细胞,扩增后NK细胞对肾癌786-O细胞的杀伤作用显著增强。     

颗粒外排与Fas/Fas配体途径在人yδT细胞的肿瘤细胞毒活性中的作用

目的探讨结核杆菌抗原(Mtb-Ag)特异性活化的γδT细胞杀伤肿瘤细胞的细胞毒活性机制.方法用Mtb-Ag刺激正常人PBMC以诱导γδT细胞扩增并用磁珠阳性分选法获得高纯度γδT细胞;用RT-PCR法检测γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和FasL mRNA的表达;用流式细胞仪检测γδT细胞表面Fas配体(FasL)分子以及几种肿瘤细胞表面Fas分子的表达;用MTT法测定γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性,观察穿孔素/颗粒酶途径的阻断剂concanamycin A(CMA)和Fas/FasL途径的抑制剂brefeldin A(BFA)对γδT细胞细胞毒活性的影响.结果经Mtb-Ag激活和扩增的γδT细胞高表达穿孔素、颗粒酶B和FasL mRNA;Mtb-Ag活化的γδT细胞中22.4%表达FasL分子;CMA能明显抑制YδT细胞对肿瘤细胞(尤其对Fas低表达的K562和PG)的杀伤,BFA能强烈抑制γδT细胞杀伤Fas高表达的Raji和A375.结论Mtb-Ag活化的γδT细胞杀伤Fas低表达的靶细胞时主要通过颗粒外排途径,杀伤Fas高表达的靶细胞时,颗粒外排和FasL均起作用.     

IL-27通过促进活化性受体表达和STATs磷酸化增强NK92细胞的抗肿瘤作用

[摘要] 目的：探讨IL-27 影响NK92 细胞抗肿瘤作用的分子和信号通路的机制。方法：将NK92 细胞分别置于不同质量浓度的IL-27（10、20、30 及60 ng/ml）下培养24 h,LDH法检测NK92 细胞对多种血液肿瘤和实体瘤细胞的杀伤作用,流式细胞术检测NK92 细胞表面受体NKG2D、NKp30 和NKp46 的表达水平以及穿孔素和颗粒酶B的分泌水平,WB检测STATs 蛋白的表达和磷酸化水平。建立重度免疫缺陷型小鼠的前列腺癌（DU145 细胞）模型,使用IL-27 和NK92 细胞联合局部治疗,评估其抗肿瘤活性。结果：10、20 及30 ng/ml浓度的IL-27 均可显著促进NK92 细胞对靶细胞的杀伤能力,且30 ng/ml的IL-27 对其细胞毒的促进作用最强（P<0.05 或P<0.01）。30 ng/ml IL-27 能显著促进NK92 细胞表面受体NKG2D、NKp30 和NKp46 的表达（均P<0.05）、明显促进NK92 分泌穿孔素（P<0.05）,但不影响颗粒酶B的分泌（P>0.05）;上调STAT1、STAT3 及STAT5 蛋白的磷酸化水平（均P<0.01）。IL-27 和NK92 细胞局部联合治疗可明显延长前列腺癌荷瘤小鼠生存期（P<0.05）。结论：IL-27 可增强NK92 细胞对实体肿瘤细胞和血液肿瘤细胞的杀伤作用,两者联合治疗可明显延长荷瘤小鼠生长期,该作用与IL-27 上调NK92 细胞中JAK-STAT 通路STAT1、STAT3、STAT5 磷酸化水平和促进细胞中多种活化性受体相关。     

四种NK细胞体外扩增方案的比较

目的： 通过对4种NK细胞体外培养方案扩增后产物的细胞免疫表型、扩增倍数以及杀伤活性进行比较,确定一种高效的NK细胞体外扩增方案。 方法: 建立4种NK细胞体外培养方案：方案1为经典的NK细胞体外扩增方案(IL-2+IL-15);方案2为IL-2+IL-15+IL-18;方案3为IL-2+IL-15+IL-7;方案4为新型NK培养基（IL-2+OKT3）。收集天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科2012年2月至2012年4月间10例晚期实体瘤患者的PBMC,按照4种方案进行体外扩增。在体外扩增的0、5、10、15 d,采用流式细胞仪检测各淋巴细胞亚群（尤其是NK细胞）的比例;比较各方案体外扩增15 d后的NK细胞的扩增倍数、淋巴细胞亚群比例变化,并采用LDH法检测各方案扩增产物对人白血病K562细胞的杀伤活性。结果： 上述4种NK细胞培养方案体外扩增15 d后,细胞总数分别扩增（40.1±20.00）、（44.08±22.09）、（44.82±23.67）、（46.82±2502）倍,其中NK细胞的扩增倍数分别为（75.86±28.57）、（93.32±32.16）、（88.66±24.94）,（58.88±41.53）倍。NK细胞比例由0 d的（20.44±2.23）%分别扩增至15 d的（48.30±13.90）%、（54.72±12.25）%、（55.94±12.70）%和(54.5±14.93)%;各培养方案组在总细胞扩增倍数、NK细胞扩增倍数上的差异均无统计学意义（P>0.05）。前3种培养方案体外扩增产物的杀伤活性明显高于方案4\[（63.40±500）%、（77.30±9.40）%、（62.17±5.60）% vs （37.39±10.42）%,均P<005\],而方案1、2、3之间体外扩增产物杀伤活性的差异则无统计学意义（P>0.05）。 结论： 细胞因子组合对于体外大规模培养NK细胞有着一定的优势,但不同的细胞因子组合（方案1中是否加入IL-18或IL-7）对NK细胞体外大规模扩增的影响差异并不显著;但前3个方案扩增产物对K562细胞的杀伤活性明显强于方案4。     

K562工程细胞联合IL-2扩增方案对人NK细胞扩增和活化的效果

目的：评价新建立的K562工程细胞联合IL-2扩增方案对人NK细胞扩增和活化的效果。 方法：采集健康志愿者和肿瘤患者的外周血PBMC并分离NK细胞,采用前期构建的K562工程细胞(将IL-15、4-1BBL和IL-18在白血病K562细胞上进行跨膜表达获取）联合IL-2培养方案对NK细胞进行扩增和活化,以流式细胞术检测NK细胞的扩增效果和NK细胞表面受体表达水平,CCK-8法检测扩增后NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性和ADCC活性,CCK-8法检测在培养方案扩增末期加入TKD多肽对NK细胞的活化效果。结果：对于健康志愿者的NK细胞,新建立扩增培养方案可使NK细胞在PBMC中的比例提高至（93±3）%;使NK细胞中活化性受体NKG2D、CD94、NKp30、NKp44和NKp46的比例分别提高60%、40%、20%、40%和63%,而抑制性受体的表达变化不大;扩增后NK细胞对白血病细胞K562、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMU-7721和乳腺癌细胞MCF-7的杀伤活性分别提高了19%、29%、26%和28%,其ADCC活性从（33±5.6）%上升至（65±12）%;方案中增加TKD可使NK细胞的杀伤活性从（86±4）%提高至（96±2）%。对于肿瘤患者的NK细胞,新扩增方案使其在PBMC的比例提高至（90.0±8.0）%,其对K562细胞的杀伤活性提高了17%左右。 结论： K562工程细胞联合IL-2扩增方案可高效扩增NK细胞,明显激活其杀伤活性,扩增和活化的NK细胞可满足临床治疗的需要。     

肿瘤细胞之间的交流

一个肿瘤细胞的产生并不意味着肿瘤发生.多个肿瘤细胞之间的对话使肿瘤成为一个异常的组织或器官.细胞接触、挤出、纠缠、迁移和变异维持着肿瘤细胞间的有序组织和肿瘤的持续生长.阻断肿瘤细胞之间的对话可能成为新的肿瘤治疗策略.     

Inhibition of Glioma Cell Proliferation by Neural Stem Cell Factor

Summary Neural stem cells (NSC) have unique differentiation-, proliferation-, and motility properties. To investigate whether they secrete factors that interfere with the proliferation of glioma cells, we grew glioma cells in conditioned medium (CM) obtained from cultures of neurospheres including neural stem / progenitor cells (NSPC) isolated from embryonic (E14)- or adult mouse brain or fetal human brain. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and BrdU-labeling assays showed that CM from NSPC (NSPC/CM) contained factor(s) that inhibited the proliferation of glioma cells by 28–87%. Filter-fractionation of NSPC/CM revealed that the 50,000–100,000 nominal molecular weight limit (NMWL) fraction contained the inhibitory activity. On the basis of these observations we transplanted 203G glioma cells and/or NSPC into the intrathecal space of the cisterna magna of mice to investigate whether NSPC interfere with the proliferation of glioma cells in vivo. Mice transplanted with both 203G and NSPC survived significantly longer than did mice transplanted only with 203G. We concluded that NSPC secrete factor(s) that may control glioma cell proliferation.     

APE1表达变化对人非小细胞肺癌细胞A549增殖的影响

目的:探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)对人非小细胞肺癌细胞A549增殖能力的影响,为肺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法:使用脂质体转染法将重组表达质粒pSIREN-RetroQ-APE1-shRNA和pOZN-HA-APE1导入A549细胞,免疫印迹检测APE1表达情况。MTT、平板克隆实验、免疫印迹检测APE1对非小细胞肺癌细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果:重组载体pSIREN-RetroQ-APE1-shRNA转染细胞后,显著抑制A549细胞中APE1蛋白的表达,与对照组相比,增殖速率明显下降(P＜0.05),平板克隆形成显著减少(P＜0.05),并阻止细胞周期G0/G1期向S期转化,降低CDK2表达。而过表达APE1可增加A549细胞活力,促进细胞增殖,促进细胞周期G0/G1期向S期转化。结论:APE1表达下调对非小细胞肺癌细胞A549生长具有抑制作用,为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。     

个体化肿瘤特异TCR的筛选策略

基因修饰T细胞疗法在肿瘤治疗领域取得突破性进展，主要包括嵌合抗原受体基因修饰T（chimeric antigen receptor engineered T，CAR-T）细胞和T细胞受体基因修饰T（T-cell receptor modified T，TCR-T）细胞。虽然CAR-T细胞疗法在血液系统 肿瘤治疗领域呈现良好的临床治疗效果，但CAR-T细胞仅能识别肿瘤细胞膜抗原（占细胞全部抗原的比例约10%），而TCR-T细 胞可以识别人白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）提呈的细胞内抗原，因此TCR-T细胞可以识别更多种类的肿瘤抗原，进 而实现对CAR-T细胞的合理补充。由于TCR-T细胞需要同时识别细胞内抗原和对应的HLA，而不同患者的HLA分型和表达的 肿瘤抗原都可能存在巨大差异，因此有必要为每个/每类肿瘤患者定制个体化的TCR-T细胞，其中的关键为筛选特异识别肿瘤抗 原的TCR。当前主要有筛选靶向“已知”肿瘤抗原TCR和筛选靶向“未知”肿瘤抗原TCR的两种策略，但其各有适用性，应针对每 个患者制定适合的筛选方法，以制备多种肿瘤特异性TCR-T细胞，从而实现个体化TCR-T细胞的肿瘤治疗。     

造血细胞与内皮细胞的相互关系及其研究现状

 造血细胞和内皮细胞的相互关系已越来越为人们所重视,成为目前研究十分活跃的领域。造血细胞与内皮细胞表达某些共同的表面标记和基因,且两者能相互促进发育,内皮细胞在诱导造血细胞归巢方面也有一定作用,研究两者关系有较高的科研及临床应用价值,文章介绍了造血细胞和内皮细胞相互关系的研究现状。     

白血病细胞吞噬血细胞现象的观察

对８例白血病细胞吞噬血细胞现象作了较详细的观察描述。被吞噬的主要为红细胞。吞噬后形成假性玫瑰花环样。吞噬红细胞可能是白血病患者贫血原因之一。认为多个白血病细胞围吞一个中性粒细胞的现象值得进一步研究。对吞噬的机理和临床意义作了初步探讨。     

A child case of CD34, CD33, HLA-DR, CD7, CD56 stem cell leukemia with thymic involvement

It has been reported that the CD56⁺/CD7⁺/CD3⁻ phenotype of natural killer (NK) cells develop from the CD34⁺/HLA-DR⁻ bone marrow (BM) mononuclear cell population in long-term BM culture (LTBMC). An HLA-DR⁻/CD33⁺/CD56⁺/CD16⁻ myeloid/natural killer cell acute leukemia has been described. We report here a 7-year-old boy who developed stem cell acute leukemia with superior vena cava syndrome secondary to thymic involvement. Surface marker analyses revealed that the leukemia cells showed CD34⁺/HLA-DR⁻/CD33⁻/CD7⁺/CD56⁺ phenotype. When stimulated with phorbol ester in vitro the leukemic cells morphologically differentiated to myeloid cells developing CD13, CD15 and CD56 antigens. Our results suggest that CD34⁺/HLA-DR⁻/CD7⁺/CD56⁺ stem cell leukemia may arise from transformation of a pluripotent precursor cell, which could differentiate to both myeloid and NK cell lineages.     

红色胶状肾透明细胞癌的临床及病理特点——附2例报告

目的探讨大体标本为红色胶状肾透明细胞癌的临床特点。方法报告2例临床发现的特殊肾透明细胞癌的诊治情况,并回顾肾癌相关文献。结果临床2例肾透明细胞癌大体标本表现为均一红色,质软,胶状的特殊特点,其影像学及病理表现为典型肾透明细胞癌。结论在肾透明细胞癌大体标本可以表现为特殊的均一红色特点,其影像学为典型肾癌,大体标本与病理分期关系不明显。     

The important role of radiotherapy in patients with non-melanoma skin cancer and other cutaneous entities

Non-melanoma skin cancer is the commonest malignancy worldwide and a significant public health issue. Although most non-melanoma skin cancers are small and easily excised or ablated, a recommendation of definitive radiotherapy is often made in patients where the outcome (cosmetic and/or functional) will probably be better with radiotherapy compared to surgery. The aim of adjuvant radiotherapy is to reduce the risk of loco-regional recurrence and the role of palliative radiotherapy is important in improving the quality of life in patients with advanced and/or incurable disease. The aim of this review article is to broadly discuss the various clinical settings in which a recommendation of radiotherapy may be made and also includes a discussion on less frequently encountered cutaneous entities (e.g. in situ squamous cell carcinoma, keratocanthoma, lentigo maligna, cutaneous lymphomas and malignant fibrous tumours).     

Role of Fbxw7 in the maintenance of normal stem cells and cancer-initiating cells

In addition to the properties of self-renewal and multipotency, stem cells are characterised by their distinct cell cycle status. Somatic stem cells are maintained in a quiescent state but switch reversibly from quiescence to proliferation as needed. On the other hand, embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells proliferate rapidly until the induction of differentiation results in inhibition of cell cycle progression. Uncovering the mechanisms underlying cell cycle control in stem cells should thus provide insight into regulation of the balance between self-renewal and differentiation, a key goal of stem cell biology. Recent research has shown that cancer-initiating cells (CICs), a cell population with stem cell-like properties in cancer, are also quiescent, with this characteristic conferring resistance to anticancer therapies that target dividing cells. Elucidation of the mechanisms of CIC quiescence might therefore be expected to provide a basis for the eradication of cancer. This review summarises our current understanding of the role of F-box and WD40 repeat domain-containing 7 (Fbxw7), a key regulator of the cell cycle, in the maintenance of normal stem cells and CICs, as well as attempts to define future challenges in this field.