ERK通路对PHA诱导人外周血单个核细胞中USP22基因表达的影响

目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK)对植物血凝素(PHA)诱导人外周血单个核细胞USP22基因表达的调控作用.方法 不同浓度PHA刺激人外周血淋巴细胞,Western blot检测ERK1/2的磷酸化水平及USP22蛋白表达;ERK1/2磷酸化抑制剂PD98059预处理细胞,Western blot和RT-PCR分别检测PHA诱导的USP22蛋白及mRNA的表达.结果 Western blot显示受PHA刺激后,人外周血单个核细胞USP22和p-ERK1/2蛋白的表达水平均高于对照组;而p-ERK1/2抑制剂阻断ERK磷酸化水平,进而下调USP22蛋白及mRNA表达水平.结论ERK1/2信号通路参与PHA对人外周血单个核细胞USP22基因的转录激活.     

戊四氮致痫大鼠中ERK信号通路的研究

目的:研究细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)信号通路在癫痫大鼠脑内的表达规律及其意义。方法:建立戊四氮致痫大鼠模型,在痫性发作30 min、1.5 h5、h和8 h应用免疫组织化学和Western印迹法对海马ERK1、ERK2和p-ERK1/2蛋白水平的表达进行研究,并加用ERK通路阻断剂PD98059干预。结果:正常大鼠脑内有少量的ERK1和ERK2阳性神经元,未见有p-ERK1/2阳性神经元。戊四氮致痫后30min p-ERK1/2开始表达,ERK1和ERK2表达较对照组开始增强(P<0.05),1.5 h后p-ERK1/2强烈表达(P<0.05),5 h后3者的表达开始减弱。PD98059干预组ERK1/2的活化较癫痫组显著受抑(P<0.05)。Western Blot结果显示,癫痫组大鼠ERK1、ERK2和p-ERK1/2蛋白表达较对照组明显增强(P<0.05),PD98059干预组3种蛋白水平显著低于癫痫组(P<0.05)。1.5 h时点的蛋白表达水平高于其他各时点相应组(P<0.05)。同时PD98059完全抑制了大鼠的痫性发作。结论:ERK信号途径在戊四氮致痫模型中被激活,参与癫痫发作的病理生理过程,并可能具有上游始动发生的作用。     

苦参碱对肺成纤维细胞TGF-β1信号转导途径的干预作用

目的 研究苦参碱对肺成纤维细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)信号转导途径的影响.方法 以人肺成纤维细胞系(HLF-02)为研究对象,用Western blot法检测TGF-β1、丝/苏氨酸激酶抑制剂星形孢菌素(Staurosporine,SP)和细胞外信号调节激酶(ERK1/2)抑制剂PD98059、苦参碱(Matrine,Mat)作用对结缔组织生长因子(CTGF)、p-Smad2、p-ERK1/2蛋白表达的影响,免疫组织化学方法检测CTGF蛋白,RT-PCR技术检测CTGF mRNA的表达.结果 体外培养的HLF-02表达基础水平的CTGF蛋白,1 ng/mL TGF-β1可使CTGF、CTGF mRNA、p-Smad2、p-ERK1/2表达水平增强(P<0.01);使用SP及PD98059预处理细胞可以抑制TGF-β1刺激的CTGF的表达增加(P<0.01).使用苦参碱预处理细胞可以抑制TGF-β1刺激的CTGF、CTGF mRNA、p-Smad2、p-ERK1/2蛋白的表达(P<0.05或P<0.01),且与苦参碱浓度呈负相关(r分别为0.845,0.900,0.789,0.942;P<0.01).结论 TGF-β1可使CTGF蛋白及CTGF mRNA的表达明显增强,可能是通过Smad2和ERK途径促进CTGF表达.苦参碱可能是通过Smad2和ERK通路在基因及蛋白水平抑制TGF-β1诱导的CTGF表达.     

ERK1/2介导的bFGF在乳腺癌细胞系MCF-7增殖中的作用

目的 观察Ras-Raf-ERK1/2途径介导的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对乳腺癌细胞系MCF-7细胞增殖的影响,探讨bFGF及其信号传导途径与乳腺癌发生及发展的关系.方法 应用细胞免疫组织化学技术检测不同浓度bFGF处理细胞后ERK1/2蛋白的表达;应用蛋白印迹技术检测不同浓度、不同时间bFGF和bFGF+PD98059处理MCF-7细胞后,细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)蛋白表达水平的变化.结果 经bFGF不同浓度(0、12.5、25及50 ng/mL)处理MCF-7乳腺癌细胞系后,ERK蛋白表达随着浓度的增加而增强,且与bFGF水平呈剂量依赖关系;以最佳工作浓度25 ng/mLbFGF处理MCF-7乳腺癌细胞系不同时间后,其表达活性明显高于对照组和bFGF+PD98059组.加入bFGF抑制剂PD98059后,bFGF诱导MCF-7细胞系p-ERK1/2活性的作用受到抑制,ERK蛋白表达明显下调.结论 bFGF通过Ras-Raf-ERK1/2途径的介导,促进了MCF-7细胞的增殖,进而抵抗无血清诱导的凋亡.抑制剂PD98059可阻断此诱导作用,使ERK表达明显下调.ERK信号传导通路可能是乳腺癌侵袭和转移的重要途径,ERK1/2和bFGF的表达可为乳腺癌治疗的靶点提供理论依据.     

ERK1/2参与IL-33诱导的心脏成纤维细胞增殖和纤维化过程

目的探讨ERK1/2通路在IL-33激活心脏成纤维细胞中的表达及其作用。方法培养心脏成纤维细胞,10 ng/m L IL-33刺激细胞,不同时间点MTT法检测IL-33对心脏成纤维细胞增殖的影响;RT-PCR检测细胞标志性基因α-SMA及通路关键分子TRAF-6的m RNA表达水平;Western blot检测α-SMA、TRAF-6及p-ERK1/2和ERK1/2的蛋白表达。结果 IL-33能促进心脏成纤维细胞的增殖（P〈0.05）;IL-33刺激细胞24h,TRAF-6表达显著上调（P〈0.05）,p-ERK1/2蛋白水平表达明显高于对照组（P〈0.05）;IL-33干预24h后α-SMA表达明显上调（P〈0.05）,ERK1/2特异性阻断剂PD98059可有效抑制该效应。结论ERK1/2通路参与了IL-33诱导的心脏成纤维细胞增殖和纤维化过程。     

PD98059联合顺铂对卵巢癌细胞增殖的影响

目的   观察MEK1/2特异性抑制剂PD98059联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响。 方法   按不同处理因素对卵巢癌SKOV3细胞分组：空白对照组、单纯PD98059组、单纯顺铂组、联合用药组。CCK-8法检测各组细胞的增殖抑制率。实时定量PCR检测各组细胞含有WW结构域的氧化还原酶(WWOX)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)在基因水平的表达。Western-blot检测各组细胞磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白的表达。光镜下观察各组细胞的生长状态及形态学改变。流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。结果   联合用药组细胞增殖抑制率明显高于其他各组（P＜0.05）;单纯顺铂组及联合用药组WWOX mRNA表达量较空白对照组明显增加（P＜0.05）,单纯PD98059组WWOX表达量无明显改变（P＞0.05）;ERK mRNA在各组间的表达无明显变化（P＞0.05）;与空白对照组相比,p-ERK1/2表达量在单纯PD98059组及联合用药组中明显降低(P＜0.05),在单纯顺铂组的表达无明显变化。光镜下可观察到空白对照组及单纯PD98059组细胞生长状态好,细胞密集,无明显形态学改变;单纯顺铂组及联合用药组贴壁细胞少,细胞稀疏,联合用药组部分细胞出现胞浆溶解样改变。结论   PD98059联合顺铂可能通过调控WWOX基因表达及ERK通路,对卵巢癌细胞增殖产生较强的抑制作用。     

PD98059抑制哮喘中TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞上皮间质转化进程

目的 探究PD98059对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B上皮间质转化(EMT)进程的影响及可能的分子机制。方法 本研究采用人支气管上皮细胞(BEAS-2B),使用TGF-β1诱导BEAS-2B上皮间质转化模型,使用ERK1/2抑制剂PD98059探究抑制ERK/MAPK信号转导是否影响EMT进程。通过免疫荧光检测BEAS-2B气道重塑模型α-SMA蛋白的表达及定位;CCK-8法检测各组细胞存活率;Edu实验检测各组细胞增殖能力水平;transwell实验检测各组细胞迁移能力水平;Western blot检测各组EMT标志蛋白表达及ERK/MAPK通路的激活情况。结果 与正常组相比,模型组α-SMA表达增加,α-SMA在BEAS-2B细胞胞质上表达。PD98059在40μmol/L浓度与5 ng/mL TGF-β1共处理抑制BEAS-2B细胞生长(P<0.05)。与三组Edu阳性率无显著差异(P>0.05)。与正常组相比,模型组迁移细胞数增加(P<0.05),上皮间质化标志蛋白表达增加(P<0.05),p-ERK蛋白表达增加(P...     

促性腺激素释放激素激动剂通过ERK MAPK途径调控大鼠睾丸间质细胞3β-HSD mRNA表达

目的:促性腺激素释放激素(GnRH)是下丘脑分泌的10肽激素,通过刺激促性腺激素释放激素的合成和分泌,调节性激素的合成.GnRH对睾丸间质细胞也具有直接的刺激作用.文中研究GnRH激动剂(GnRHa)对大鼠睾丸间质细胞ERK MAPK信号通路和3β-HSD mRNA表达的影响. 方法:原代培养大鼠睾丸间质细胞48 h后,血清饥饿2 h.GnRHa(10-7 mol/L)和ERK抑制剂PD98059(50 μmol/L)刺激细胞后Western blot检测磷酸化ERK(p-ERK)、总ERK(t-ERK)的蛋白表达,荧光实时定量PCR检测3β-HSD mRNA表达. 结果:结果显示GnRHa刺激间质细胞0、5、10、30、60和90min后,p-ERK水平在5min时达到最高,与对照组比较升高了约3.5倍(P<0.05);10min时开始下降,但与对照组相比较仍显著升高2.2倍(P<0.05);90min时恢复到正常水平.加入ERK选择性抑制剂PD98059后,p-ERK水平显著下降50%(P<0.05);再用GnRHa刺激细胞5min,p-ERK水平仍无法恢复正常水平.用PD98059处理细胞后,再加入GnRHa培养24h,3β-HSD mRNA水平也显著下降(与GnRHa组相比,P<0.05). 结论:GnRH激动剂可能通过ERK MAPK信号通路来调控大鼠睾丸间质细胞3β-HSD mRNA的表达,进而调控睾酮的分泌.     

NALP3炎性复合体及ERK信号通路在氧化应激中的作用及阿魏酸钠的干预机制

目的 探讨氧化应激时人肺上皮细胞（A549）中NALP3炎性复合体、细胞外调节蛋白激酶（ERK）的表达变化,阿魏酸钠（SF）的干预作用及其可能的机制。方法 培养A549细胞,分为空白对照组,H₂O₂刺激组,阿魏酸钠组,caspase-1抑制剂（Z-VAD）组,ERK阻断剂（PD98059）组, 阿魏酸钠+H₂O₂组。其中H₂O₂刺激组用H₂O₂ 200 μmol/L培养细胞2 h,阿魏酸钠组用阿魏酸钠400 μg/mL处理细胞30 min,Z-VAD组、PD98059组、阿魏酸钠+H₂O₂组分别用Z-VAD 20 μmol/L、PD98059 50 μmol/L、阿魏酸钠 400 μg/mL预处理A549细胞30 min后加入H₂O₂ 200 μmol/L培养2 h,采用实时荧光定量PCR检测各组A549中caspase-1、NALP3 mRNA的表达,Western blot检测caspase-1、NALP3、磷酸化ERK（p-ERK）、ERK蛋白含量;ELISA法检测各组A549 上清液中白细胞介素-1β（IL-1β）含量。结果 与空白对照组比较,H₂O₂ 可使A549细胞caspase-1 、NALP3 mRNA及caspase-1、NALP3、p-ERK/ERK蛋白水平表达增强,IL-1β分泌增加（P 均< 0.05）,而阿魏酸钠组与空白对照组差异无统计学意义（P >0.05）。与H₂O₂刺激组比较, Z-VAD组、PD98059组和阿魏酸钠+H₂O₂组caspase-1、NALP3 mRNA及蛋白表达降低,p-ERK/ERK蛋白表达降低,IL-1β分泌下降（P 均<0.05）,Z-VAD组或PD98059组与阿魏酸钠+H₂O₂组间上述作用差异无统计学意义（P >0.05）。结论 阿魏酸钠可能通过抑制ERK活化,减少caspase-1、NALP3及IL-1β的表达,从而减轻氧化应激导致的炎症级联反应。     

ERK/MAPK信号通路激活与乳腺癌细胞浸润性生长的关系

目的：探讨乳腺癌细胞中ERK／MAPK信号转导通路异常激活与乳腺癌细胞浸润性生长的关系及可能机制。方法:采用Western蛋白印迹技术检测乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-435S中磷酸化ERK／MAPK(P-ERK)蛋白表达，以及表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和ERK／MAPK通路抑制剂PD98059对两种细胞ERK／MAPK信号转导通路磷酸化的调节。结果:雌激素受体ER(-)的浸润性乳腺癌细胞系MDA-MB-435S中，p-ERK表达明显高于ER( )的非浸润性乳腺癌细胞系MCF-7；EGF可刺激两种细胞p-ERK的表达增加，但这种刺激作用在MDA-MB-435S细胞中更加明显；IGF-1则仅能刺激MCF-7细胞中p-ERK的表达。PD98059能有效阻滞EGF、IGF-1对p-ERK的激活。结论：ERK／MAPK信号转导通路的异常激活与乳腺癌的浸润性生长有关，而EGF可能是异常激活ERK／MAPK信号转导通路，是刺激ER(-)的乳腺癌细胞浸润性生长的重要因素之一。     

周期性牵张力对人牙周膜细胞中成骨样细胞表型碱性磷酸酶和骨钙素mRNA表达的影响

目的：了解机械力介导的牙周膜细胞中成骨样细胞特性的改变,以利于深入研究正畸牙齿移动的机制。方法：应用地高辛标记寡核苷酸探针进行细胞原位杂交,检测在间歇性机械牵张力作用下人牙周膜细胞中的成骨样细胞表型蛋白碱性磷酸酶和骨钙素在mRNA转录水平的表达改变。结果：间歇性牵张力作用增强人牙周膜细胞碱性磷酸酶和骨钙素基因的表达。结论：间歇性牵张力作用诱导人牙周膜细胞向成骨样细胞的分化。     

熊果酸对活化型肝星状细胞NADPH氧化酶亚基p47Phox表达及ERK1/2信号通路活化的影响

目的 研究熊果酸（Ursolic acid ,UA）对瘦素诱导的大鼠肝星状细胞（HSC-T6）NADPH氧化酶（NOX）亚基p47Phox及ERK1/2信号通路活化的影响,并观察细胞增殖及I型胶原合成情况。方法 将培养激活的HSC-T6细胞株分为6组：正常对照组不加任何药物;瘦素组给予重组大鼠瘦素(100ng/ml)刺激细胞;各干预组分别给予UA、JAK抑制剂AG490、NOX抑制剂DPI、ERK抑制剂PD98059预处理30min,再加入瘦素刺激不同时间。采用Western blotting检测细胞膜移位的p47Phox蛋白、细胞总的p47Phox蛋白和磷酸化的ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白表达;采用MTT法检测细胞增殖;采用RT-PCR法检测I型胶原mRNA的表达。结果 瘦素刺激HSC-T6细胞30min后细胞膜p47phox蛋白表达显著增高于正常对照组（0.68±0.09比0.44±0.11,P<0.01）,细胞内p-ERK1/2蛋白表达也随之增高（P<0.01）;UA、AG490及DPI干预后抑制了p47phox蛋白向细胞膜移位和细胞内ERK1/2蛋白磷酸化,PD98059抑制p47phox蛋白膜移位的作用较弱。瘦素刺激HSC-T6细胞12h后I型胶原的mRNA表达较正常对照组升高（P<0.01）,UA干预后I型胶原的mRNA表达明显低于瘦素组（0.57±0.18比1.02±0.5,P<0.01）,AG490、DPI及PD98059干预后I型胶原mRNA的表达均低于瘦素组（P<0.01）。瘦素刺激HSC-T6细胞12h、24h、48h后细胞增殖率高于正常对照组（均P<0.01）;UA、AG490、DPI及PD98059干预不同时间点的细胞增殖率均低于瘦素组（均P<0.01）,UA的抑制作用稍弱于DPI。结论：UA能抑制瘦素诱导的HSC-T6细胞增殖及I型胶原表达,机制可能与抑制NOX亚基p47phox向细胞膜移位及下游信号通路ERK1/2的激活有关。     

ERK信号通路参与内质网应激时由A类清道夫受体介导的细胞凋亡

目的:探讨ERK信号通路在内质网应激时由A类清道夫受体(SR-A)介导的细胞凋亡中的作用?方法:ERK磷酸化和葡萄糖相关蛋白78(GRP78)的表达用Western blot方法检测,细胞活性用四甲基噻唑蓝(MTT)实验检测,同时应用Annexin V FITC/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡率?结果:Western blot结果显示,fucoidan可以持续激活ERK,并且在1~4 h达到最强,这种作用在SR-A基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞中明显减弱?用PD98059阻断ERK信号途径后,内质网应激时fucoidan诱导RAW264.7细胞凋亡率明显降低?结论:在发生内质网应激时,fucoidan与SR-A结合后激活ERK信号通路,可能是促进巨噬细胞凋亡的机制之一?     

低频脉冲电磁场增强骨形态发生蛋白9诱导牙周膜干细胞成骨分化作用

目的 探讨低频脉冲电磁场能否增强骨形态发生蛋白9（BMP9）诱导人牙周膜干细胞（PDLSC）成骨分化的作用。方法 培养健康人前磨牙牙周膜组织细胞，通过免疫磁珠分选后得到CD146⁺/STRO-1⁺细胞，即PDLSC。用携带过表达BMP9基因的重组腺病毒（Ad-GFP-BMP9）感染PDLSC，并暴露于频率为15Hz、磁场强度分别为0.6、1.2、1.8、2.4、3.0mT的脉冲电磁场进行干预（每12h辐照1h）。通过qRT-PCR和蛋白质印迹法检测Runt相关转录因子2（Runx2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）、骨钙蛋白（OCN）等成骨基因及蛋白表达量。结果 过表达BMP9基因可以促进PDLSC中成骨标志物Runx2、ALP、OCN、OPN的表达（P<0.05）。给予磁场强度分别为1.2、1.8、2.4、3.0mT的脉冲电磁场干预后，PDLSC内的成骨标志物表达水平均较单独BMP9时增高（P<0.05），并且在磁场强度为2.4mT时达到最高峰（P<0.05），表明低频脉冲电磁场可以增强BMP9诱导PDLSC成骨分化并且存在“窗口效应”。结论 磁场强度为1.8~3.0mT的15Hz脉冲电磁场可以体外增强BMP9诱导人PDLSC的成骨分化。