川芎嗪对低氧时肺癌A549细胞缺氧诱导因子-1α表达的影响

目的:观察川芎嗪对低氧时肺癌A549细胞缺氧诱导因子-1α(HIF - 1α)表达的影响.方法:选用肺癌A549细胞低氧环境下进行培养,并使用川芎嗪进行干预,应用MTT法检测川芎嗪对肺癌A549细胞的增殖抑制作用;采用免疫细胞化学法和RT - PCR法检测川芎嗪对低氧时肺癌A549细胞HIF -1α表达的影响.结果:川...     

反义端粒酶RNA对肺癌细胞A549抑制作用研究

目的 探讨反义人端粒酶RNA(human telomeric,RNA,hTR)对肺癌细胞A549端粒酶活性和细胞增殖的抑制作用，研究以端粒酶为靶的肺癌基因治疗的可能性。方法 将端粒酶hTR的cDNA反向插入到逆转录病毒载体pLXRN中，转染包装细胞PT67后获得反义hTR重组病毒，感染肺癌细胞A549。处理前后采用TRAP法检测端粒酶活性，光镜观察细胞形态，DNA电泳观察凋亡情况。结果 作用后端粒酶活性和细胞增殖受到明显抑制，并出现明显的细胞凋亡。结论 反义hTR 对肺癌细胞A549端粒酶活性具有明显的抑制作用，使肺癌细胞A549生长抑制，促进细胞凋亡。     

ndr2基因在肺腺癌细胞GLC-82中的诱导表达

目的 构建蜕皮素诱导的抑癌基因ndr2哺乳动物真核表达载体（pIND-ndr2)，转染肺腺癌细胞GLC－82，观察ndr2基因表达，为进一步研究ndr2的生物学功能打下基础。方法 以RT－PCR方法确定正常人肺组织和肺腺癌GLC－82细胞ndr2的表达高低。PCR方法扩增ndr2，以BamHI EcoRI双酶切连接入pUC19载体中，测序正确后，插入到蜕皮素诱导的真核表达载体pIND中。连有ndr2基因的载体（pIND-ndr2)用指质体方法转染到培养的肺腺癌细胞GLC－82中。经G418和zeocin双抗生素筛选后，挑取单克隆进行培养，用蜕皮素诱导ndr2表达，用RT－PCR，western印迹和免疫组织化学方法验证获得表达的细胞株。结果 PCR的方法扩增获得大小约1200bp的片段，连接入预先插入HA－tag的pUC19载体的ndr2基因经HindⅢ EcoRI酶切后，构建到真核表达载体pIND中，酶切鉴定后证明连接片段正确。通过双载体转染和双抗生素筛选后，培养的细胞经诱导后检测到实验组ndr2的高表达，而对照组和未诱导的实验组ndr2表达均较低。结论 ndr2基因成功转染培养的肺腺癌GLC－82细胞，建立了ndr2的可诱导表达的细胞系。     

缺氧和缺氧诱导因子1α:肿瘤转移的中心调控子

缺氧在大多数实体瘤中普遍存在,通常与预后不良具有相关性。作为缺氧诱导因子的功能亚基,缺氧诱导因子1α(HIF-1α)受氧浓度调控,它的高表达通常与肿瘤转移和较差的临床结局相关。最近的研究显示,肿瘤转移的每一个步骤,从最初的上皮细胞向间充质细胞的转变到最终的远处器官转移,都在缺氧的潜在调控之下,表明了缺氧和缺氧诱导因子在肿瘤转移中的主导地位。以缺氧和缺氧诱导因子为靶标的多种治疗措施,包括缺氧诱导因子抑制剂,缺氧激活的生物还原前体药物和基因疗法有望成为预防或减少肿瘤转移的有效手段。     

缺氧诱导因子-1α增加肿瘤细胞A549化疗药物耐受性的研究

目的构建缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α）基因的表达质粒,转染肺癌细胞系A549后,观察其对化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fu）敏感性的变化。方法采用RT-PCR方法扩增A549细胞内HIF-1α基因功能区片段,克隆至真核表达载体pcDNA3上,经脂质体Lipofectamine^TM 2000转染A549细胞后,G418筛选。Western blot检测转染前后多药耐药蛋白（MDR1）的表达变化。加入化疗药物5-Fu（0.1mg/ml）,用生长曲线观察A549细胞的生长情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡指数,用Western blot检测Caspase3的活性变化。结果转染HIF-1α后,MDR1表达上调。转染HIF-1α组的细胞增殖抑制、凋亡指数、Caspase3的活性均低于单独加5-Fu组。结论HIF-1α能够增加肺癌细胞A549凋亡的阈值,从而增加细胞对化疗药物的耐受性。     

肿瘤坏死因子联合足叶乙甙对肺癌细胞株A549的毒性作用及临床意义

目的：研究肿瘤坏死因子（TNFα）和足叶乙甙（VP16）联合抗肿瘤的作用及其机制。方法：用MTT法检测不同浓度的TNFα、VP16及TNFα/VP16对人肺癌细胞系A549的细胞毒作用及流式细胞仪观察TNFα、VP16及TNFα联合VP16分别对A549的细胞周期的影响。结果：TNFα、VP16对A549细胞的生长抑制作用有时相及剂量依赖关系，而TNFα联合VP16对A549抑制作用较TNFα、VP16单个作用显著（P＜0．01），对细胞周期用药后G2期明显下降（13．2％下降至3．0％，S期上升（27．3％上升至42．5％）（P＜0．05）。结论：VP16联合TNFα可增加对肺癌细胞A549的抑制率，对A549细胞的作用是通过抑制DNA合成及有丝分裂使G0＋G1＋S期不能及时转至G2、M期。     

CD133~+A549肺癌细胞的分选及其肿瘤干细胞和间质化相关基因的表达

目的 分离CD133+A549细胞并对其肿瘤干细胞和上皮间质转变(EMT)特性进行初步研究.方法 采用免疫磁珠法分离并鉴定A549细胞,Real-Time PCR法和Western blotting法鉴定分离的细胞.Real-Time PCR法测定CD133+ A549和CD133-A549细胞中肿瘤干细胞标志物(CXCR4、Oct4、CD44、Bmi1、EpCam)和EMT标志物(E-Cadherin和Zeb1)mRNA的表达.分选后的CD133+A549和CD133-A549细胞经不同浓度(0、0.25、0.5、1.0μg/mL)阿霉素处理72 h,采用细胞增殖实验检测细胞的相对存活率.结果 经CD133微小磁珠分离后、成功获得CD133+ A549和CD133-A549细胞,CD133+ A549细胞的CD133表达明显高于CD133-A549细胞.Real-Time PCR检测结果显示,CD133+ A549细胞中Oct4、CD44、Bmi1、EpCam mRNA的相对表达量均显著高于CD133 - A549细胞[(1±0.16)vs(0.66±0.12)、(1±0.07)vs(0.48±0.04)、(1±0.03)vs(0.49±0.06)以及(1±0.14)vs(0.38 ±0.12)(P＜0.05)],但CXCR4 mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义[(1±0.13)vs(0.73±0.14),P＞0.05]; CD133+A549细胞中Zeb1 mRNA的相对表达量显著高于CD133- A549细胞[(1 ±0.09)vs(0.39±0.05),P＜0.05],但E-Cadherin mRNA的相对表达量显著低于CD133-A549细胞[(1±0.02)vs(4.98±0.04),P＜0.05].细胞增殖实验结果显示,采用0.5和1.0μg/mL阿霉素处理后,CD133+ A549细胞的相对存活率均显著高于CD133-A549细胞,差异有统计学意义[(85±9.4)％vs(67±13.1)％,P＜0.05;(80±14.9)％vs(56±6.3)％,P＜0.01].结论 采用免疫磁珠分离法可成功分离CD133+A549和CD133-A549细胞;CD133+ A549细胞中有其他肿瘤干细胞标志物的表达,并表现出EMT特性.CD133可能是肺癌肿瘤于细胞和EMT特征的标志物.     

shRNA-PTTG对A549肺癌细胞株生物学功能的影响

目的探讨shRNA-PTTG对肺癌A549细胞生物学功能的影响。方法采用shRNA技术沉默PTTG蛋白的表达,使用western blot与RT-PCR检测沉默效率,使用western blot检测沉默PTTG后VEGF蛋白的表达影响,使用MTT检测细胞增殖,使用流式细胞仪检测周期。结果 western blot与PCR结果显示shRNA成功沉默PTTG蛋白的表达,且VEGF表达明显下降,MTT结果显示沉默PTTG后,细胞生长明显收到抑制,流式细胞仪结果显示,沉默PTTG后G2-M期明显延缓。结论 PTTG基因具有促进肺癌A549细胞株增殖的作用,且可能是通过VEGF而发挥作用。     

GPI-PLD过表达对肺癌细胞株A549生物学特征的影响

目的 研究糖基化磷脂酰肌醇特异性磷酯酶D(GPI-PLD)基因转染并过度表达对肺癌细胞株A549生物学特征的影响.方法 用脂质体转染法将GPI-PLD真核表达载体pcDNA3.1(+)/GPI-PLD转入A549细胞,以未转染的A549细胞及转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞为对照,筛选出阳性细胞克隆.以胎盘碱性磷酸酶(PLAP)为底物,定量检测GPI-PLD活性,RT-PCR法确定GPI-PLD mRNA表达水平,细胞计数绘制生长曲线,锥虫蓝排斥法观察补体介导的细胞毒(CDC)杀伤率,分光光度法测定PLAP活性,ELISA检测癌胚抗原(CEA)的表达情况.结果 阳性细胞克隆GPI-PLD酶活性水平比对照组升高约3倍,GPI-PLD mRNA表达水平显著增加,GPI-PLD基因过度表达可促进GPI锚定的蛋白质如CEA和PLAP等被大量水解释放入培养液,导致细胞增殖能力减弱,对补体杀伤的敏感性增强.结论 成功将GPI-PLD基因转染入A549细胞,并在细胞中稳定表达.GPI-PLD过表达能抑制肿瘤细胞增殖,增强肿瘤细胞对补体杀伤的敏感性.     

Interaction between gene p53 and oncogene mdm2 in human glandular lung cancer cell line GLC-82

Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｏｎｃｏｇｅｎｅｍｄｍ２ａｎｄｗｐ５３ｉｎｈｕｍａｎｇｌａｎｄｕｌａｒｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅＧＬＣ８２．ＭｅｔｈｏｄｓＢｙｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅｍｅｄｉａｔｅｄＤＮＡｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ,ｗｐ５３ａｎｄｍｄｍ２ｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｓｅｐａｒａｔｅｌｙｏｒｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＧＬＣ８２ｃｅｌｌｓｖｉａｒｅｔｒｏｖｉｖａｌｖｅｃｔｏｒｐＤＯＲｎｅｏ,ａｃａｒｒｉｅｒｏ…     

肺腺癌细胞系A549肿瘤始发细胞的测定

目的通过克隆形成及致瘤能力研究肺腺癌细胞系A549肿瘤始发细胞的比例。方法采用有限稀释法,检测细胞单克隆形成的数量及大小;收集来自于1个细胞形成的克隆细胞,种于BALB/C裸鼠皮下,观察其致瘤能力;采用CD133磁珠分选A549细胞,测定CD133+、CD133-细胞的克隆形成能力,测定Hoechst33342染色对非SP细胞的增殖能力和单克隆形成能力的影响。结果45%以上的A549细胞能够形成大于100个细胞的大克隆,其传代后又能形成新的克隆,来源于1个大克隆的细胞种植到BALB/C裸鼠身上,10?d左右能形成肉眼可见的肿瘤;CD133+、CD133-细胞克隆形成能力相同;Hoechst33342染色能够明显干预细胞的克隆形成及增殖能力。结论45%以上的A549细胞是肿瘤始发细胞。     

乏氧诱导的自噬与肺腺癌放射抵抗的相关性研究

目的 研究乏氧诱导的自噬与肺腺癌放射抵抗之间的相关性.方法 肺腺癌A549细胞行常氧和乏氧培养.构建靶向抑制乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)的shRNA表达质粒,转染乏氧A549细胞,筛选稳定表达的克隆细胞.克隆形成实验检测细胞放射敏感性.Western blot法检测各处理组细胞HIF-1α、beclin1蛋白的表达.结果 乏氧细胞存活分数(SF2)为0.62,常氧细胞为0.43,提示乏氧A549细胞放射敏感性降低.常氧下A549细胞HIF-1α和beclin1蛋白低表达,乏氧12、24、48 h时间点HIF-1α和beclin1蛋白表达明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).相应时间点HIF-1α与beclin1的表达呈正相关(r＝0.75,P＜0.05).A549/HIF-1α-shRNA的SF2为0.45,放射增益比(SER)为0.72,明显低于阴性对照组,说明抑制HIF-1α表达明显提高乏氧A549细胞放射敏感性.乏氧条件下HIF-1α的表达被抑制后 beclin1 蛋白的表达明显降低(24 h:t=5.69,P=0.01;48 h:t=5.13,P=0.01).结论 乏氧诱导的自噬参与肺腺癌的放射抵抗.     

诱导分化药物对肺癌细胞肿瘤相关基因的影响

目的 通过观察诱导分化浓度的全反式维甲酸、亚硒酸钠、三氧化二砷对肺腺癌细胞A549的肿瘤相关基因的影响,探讨诱导分化药物对肺癌细胞的作用机制.方法 体外培养肺癌A549细胞,设全反式维甲酸、亚硒酸钠和三氧化二砷处理组及对照组,药物处理24 h后以Westem Blot和Rt-PCR检测基因caspase3、p21、RARα、bcl-2、cyclinD3和nm23的表达.结果 caspase3、RARα和nm23在亚硒酸钠、三氧化二砷组中表达上调;p21在全反式维甲酸、三氧化二砷组中表达上调.bcl-2和cyclinD3在3个处理组中表达下调.结论 全反式维甲酸、亚硒酸钠和三氧化二砷能引起A549肿瘤相关基因表达的改变,诱导分化药物对肺癌的作用机制表现为增殖抑制、促进凋亡、周期阻滞、转移抑制、诱导分化敏感度增加等多方面的改变.     

Let-7a负性调控肺癌A549细胞中NIRF基因的表达

目的：探讨肺癌A549细胞中let-7a对其靶基因NIRF表达的调控作用.方法：运用生物信息学方法对let-7a进行靶基因预测并分析其靶基因NIRF;构建含有NIRF 3′UTR全长的荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR;将pRL-TK或pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control,及let-7a mimics或control mimics共转染A549细胞,双荧光素酶报告系统检测试剂盒测定转染后A549细胞中荧光素酶的表达;A549细胞分别转染let-7a mimics和control mimics,Western Blot检测NIRF蛋白的表达.结果：NIRF3′UTR含有一个let-7a结合位点,而且该结合位点在多个物种高度保守;经测序证实荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR构建成功;共转染let-7amimics,pRL-TK-NIRF3′UTR与pGL3-control的A549细胞组,荧光素酶活性明显降低（P〈0.01）,为对照组（共转染pRL-TK与pGL3-control的A549细胞组）的50%;Western Blot检测显示,与未转染的A549细胞相比,转染let-7a mimics的A549细胞中NIRF蛋白的表达显著降低（P〈0.01）,而转染control mimics的A549细胞中NIRF表达无明显变化（P〉0.05）.结论：肺癌A549细胞中,let-7a可以结合到NIRF 3′UTR,负性调控NIRF的表达.     

羟基喜树碱对人肺癌A549 细胞自噬的影响

目的 探究羟基喜树碱（HCPT）对人肺癌A549 细胞自噬的作用。方法 体外进行肺癌A549细胞的培养,分别使用50、200 和400μmol 的HCPT 处理,利用MTT 法检测HCPT 对细胞存活率的影响;共聚焦显微镜成像技术观察HCPT 对细胞自噬活性的影响;Western blot 检测HCPT 对自噬相关蛋白LC3、p-mTOR 表达的影响。结果 HCPT 抑制A549 细胞的活性;HCPT 处理24 h 后细胞质和细胞核周围Cyto-ID 绿色荧光强度增强;与对照组比较,HCPT 治疗各组LC3II/I 值升高,p-mTOR 表达减少;且加入自噬抑制剂6- 氨基-3- 甲基嘌呤（3-MA）处理后的各组与相对应的HCPT 治疗各组比较,A549 细胞的增殖抑制增强。结论 HCPT 能抑制A549 细胞增殖并诱导其发生自噬;HCPT 发挥抑制A549 细胞增殖作用可能与自噬密切相关;抑制细胞自噬可能会增强HCPT 的抗A549 细胞增殖能力。     

Psalmotoxin⁃1抑制活化的肝星状细胞过程中microRNA差异表达谱的变化分析

目的：探讨酸敏感离子通道1a（acid?sensing ion channel 1a,ASIC1a）特异性阻断剂狼蛛毒素（psalmotoxin?1,PcTx?1）抑制血小板衍生生长因子BB（platelet derived growth factor?BB,PDGF?BB）活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）过程中微小RNA（microRNA,miRNA）差异表达谱及生物信息学分析。方法：取对数生长期的HSC细胞,分为对照组、模型组和PcTx组。对照组不做处理,模型组加入PDGF?BB（10 ng/mL）培养24 h,PcTx组给予PcTx?1刺激1 h后,再加入PDGF?BB（10 ng/mL）培养24 h。采用RT?PCR和Western blot检测α?平滑肌肌动蛋白（α?smooth muscle actin,α?SMA）、Ⅰ型胶原（collagen?Ⅰ）和ASIC1a的表达,MTT法检测细胞增殖情况,验证HSC细胞是否活化以及PcTx?1是否阻断ASIC1a的表达。提取的总RNA质检合格后进行高通量测序,筛选差异表达的miRNA。通过miRanda算法对差异miRNA进行靶基因预测,并对miRNA靶基因进行功能和代谢通路分析。结果：PcTx?1阻断ASIC1a后,ASIC1a的表达降低,HSC细胞活化的标志性基因α?SMA和collagen?Ⅰ的表达明显减少,提示PcTx?1可阻断PDGF诱导的HSC活化。与对照组比较,模型组miRNA表达谱中差异表达miRNA共有38个,其中上调6个,下调32个（P < 0.05）。与模型组比较,PcTx组miRNA表达谱中差异表达miRNA共有17个,其中上调1个,下调16个（P < 0.05）。结论：高通量筛选得到的PcTx?1抑制PDGF?BB活化HSC过程中miRNA差异表达谱,为肝纤维化的发病机制研究提供了新的靶点和思路。     

人肺癌细胞系A549中肿瘤干细胞样细胞的分离及鉴定

目的从人肺癌细胞系A549中分离并鉴定肺癌干细胞。方法将A549细胞置于无血清条件培养基中培养,形成细胞球,采用平皿克隆形成实验、MTT细胞增殖实验、RT-PCR、Western blot、免疫荧光技术,检测并比较A549细胞和A549细胞球的增殖能力及干细胞相关标记的表达水平,鉴定细胞球的肿瘤干细胞特性。结果利用无血清条件培养基从A549细胞中分离出肿瘤干细胞样细胞;相比A549细胞,细胞球呈悬浮生长,增殖能力和克隆形成数目(104±7)高于贴壁细胞[(37±3)(P<0.05)],且干细胞相关标记Sox2(2.68±0.39)和Oct4(1.23±0.12)表达水平明显提高[贴壁细胞Sox2(0.05±0.02)、Oct4(0.10±0.02),P<0.05]。结论运用无血清条件培养基可以从A549细胞系中有效富集肺癌干细胞样细胞。