压力对体外培养牛眼小梁细胞的影响

目的 观察压力对小梁细胞的影响。方法 对体外培养牛眼小梁细胞施以不同程度的压力,用倒置相差显微镜、光镜、电镜观察细胞形态结构及吞噬功能的变化。结果 细胞承受２．００ｋｐａ（１ｋｐａ＝７．５ｍｍＨｇ）、２．６７ｋｐａ压力４８小时,各项指标与对照组比较,差异无显著性。４．００ｋｐａ２４小时,细胞形态结构有轻度的损伤,吞噬功能有轻度下降。当压力进一步增加,时间更加延长后,细胞的损伤也更重。结论小梁细胞只     

肿瘤坏死因子-α对体外培养牛眼小梁细胞纤维连接蛋白的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)对体外培养牛眼小梁细胞纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的影响及意义.方法 体外培养牛眼小梁细胞,免疫荧光法行神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)及Ⅷ因子相关抗原染色鉴定.取第3代小梁细胞分别加入浓度20μg·L-1、40μg·L-1、80μg·L-1 TNF-α孵育35 h,免疫荧光法行FN染色后用激光共聚焦显微镜观测并行定量分析.结果 20μg·L-1、40μg·L-1、80μg·L-1浓度组染色积分光密度值分别为19 486.45±1 318.15、31 312.61±1 822.52、39 958.98±2 186.85,高于对照组积分光密度值(13 062.62±1 923.36).各实验组FN荧光强度表达高于对照组,差异具有统计学意义,且随TNF-α浓度增高FN的表达亦逐渐增多.结论 在体外培养条件下TNF-α可引起牛眼小梁细胞FN合成增加,推测FN可能通过与整合素结合来促进胶原收缩,小梁网间空隙扩大,房水外流阻力减小,从而降低眼压.     

米非司酮对培养的人眼小梁细胞外纤维连接蛋白表达的影响

目的　探讨糖皮质激素受体拮抗剂米非司酮对培养的人眼小梁细胞外纤维连接蛋白(fibronectin ,FN)表达的影响。方法　按组织块培养法进行人眼 (8只眼 )小梁细胞体外培养 ,在传 3代的小梁细胞培养液中分别先后加入不同浓度的地塞米松和米非司酮 ,应用免疫组织化学联合计算机图像分析的方法 ,检测细胞外染色区域的吸光度 (A值 )。结果　根据培养细胞的生长特性和形态特征及细胞外基质染色特点等 ,确定培养的细胞为人眼小梁细胞。含有不同浓度地塞米松和米非司酮的小梁细胞培养组与对照组比较 ,FN变化所对应的A值排列顺序为 :1 0 - 6 mol/L地塞米松 (1 2d) >1 0 - 7mol/L地塞米松 (1 2d) >1 0 - 7mol/L地塞米松 (5d) >对照组≈ 1 0 - 7mol/L地塞米松 (5d) +1 0 - 8mol/L米非司酮 (7d)。结论　地塞米松能促进体外培养的人眼小梁细胞分泌与合成FN(A值升高 ) ,米非司酮可在受体水平拮抗并逐步逆转地塞米松引起的小梁细胞外FN的过度表达 (A值下降 )。糖皮质激素受体 (glucocorticoidrecepter,GR)拮抗剂米非司酮的降眼压作用尚有待在体内环境得到证实     

tTG AS-ODN抑制培养的牛眼小梁细胞表达纤维连接蛋白的研究

目的观察组织型谷氨酰胺转移酶(tTG)AS-ODN(AS-ODN)对体外培养牛眼小梁细胞(BTMCs)纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法设空白对照组、tTGAS-ODN1组和tTGAS-ODN2组。在脂质体介导下,将0.3μmol/L的tTGAS-ODN转染BTMCs,利用免疫组织化学SP染色法检测BTMCs表达FN情况,采用半定量RT-PCR和Westernblot方法检测表达的变化。结果免疫组织化学结果显示,AS-ODN1和AS-ODN2组灰度均值与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),AS-ODN1和AS-ODN2组差异无统计学意义(P=0.91)。RT-PCR结果显示,AS-ODN1和AS-ODN2组FN/β-actin条带中心密度比与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),AS-ODN1和AS-ODN2组差异无统计学意义(P=0.73)。Westernblot结果显示,AS-ODN1和AS-ODN2组FN/β-actin灰度比值与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),AS-ODN1和AS-ODN2组差异无统计学意义(P=0.92)。结论tTG可以促进BTMCs表达ECM。通过tTGAS-ODN抑制BTMCs表达FN等细胞外基质(ECM),有望从基因水平上防治原发性开角型青光眼(POAG)。     

上皮状牛眼小梁细胞选择性体外培养

目的建立上皮状牛眼小梁细胞体外培养的方法。方法用DME培养液加10％胎半血清选择性培养上皮状牛眼小梁细胞．结果（1）原代和传1、传2代牛眼小粱细胞生长不稳定，传3～7代牛眼小梁细胞生长旺盛；（2）原代细胞和传代细胞汇合前其形态可是多种多样，汇合后均为单层上皮状小梁细胞。结论（1）牛眼小梁组织丰富，解剖清楚，体外培养易生长；（2）选择性培养可得到单纯上皮状牛眼小梁细胞，更易与邻近组织细胞相区别。     

内皮素-1对体外培养人小梁网细胞纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察内皮素-1（ET-1）对人小梁网细胞（TMCs）细胞外基质纤维连接蛋白（FN）、Ⅰ型胶原（COL Ⅰ）的影响。方法取死亡24h内尸眼小梁网组织,行TMCs原代和传代培养,并用FN、层黏连蛋白（LN）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和Ⅷ因子相关抗原（FⅧRAg）鉴定为人TMCs后,取传3代的人TMCs,给予不同浓度ET-1（10^-9、10^-8、10^-7mol／L）孵育72h后,免疫荧光和Western blot观察ET-1对TMCs中FN、COLⅠ表达的影响;然后取传3代的人TMCs,分别给予10^-7mol／L ET-1、10^-7mol／L ET-1＋10^-7mol／L ETA受体拈抗剂、10^-mol／L ET-1＋10^7mol／L ETB受体拈抗剂后孵育72h,Western blot观察ET受体拮抗剂对FN、COL Ⅰ表达的影响。结果研究受到伦理委员会的批准,取材前征得供体家属的知情同意。培养的细胞形态多样,含少许色素颗粒,FN、LN、NSE染色均呈阳性反应,FⅧRAg呈阴性反应。人TMCs与10^-9～10^-7mol／L ET-1共孵育后FN表达上调（F=18．41,P〈0．05）;与10^-8mol／L、10^-7mol／L ET-1共孵育后COLⅠ表达上调（F=39．81,P〈0．05）,并呈浓度依赖性,10^-7mol／L时作用最明显;给予ETA受体拮抗剂后,与ET-1组相比,FN、COLⅠ的表达均降低（qFN=7．213,P〈0．05;qCOLⅠ=6．187,P〈0．05）,但给予ETB受体拮抗剂后,FN、COLⅠ的表达均无明显变化。结论ET-1能够促进体外培养的人TMCs中FN、COLⅠ的表达,其机制可能是通过激动ETA受体而非ETB受体发挥作用的。     

5—氟尿嘧啶对体外培养牛眼小梁的细胞的毒性研究

目的探讨５－氟尿嘧啶在临床应用中对小梁细胞的毒性损伤。方法在体外增减牛眼小梁细胞，从细胞的形态、结构、自下而上了及吞噬功能等方面观察５－Ｆｕ对牛眼小梁细胞的影响。结果５－Ｆｕ对牛眼小梁细胞的安全浓度为１×１０＾－６ｇ．ｍｌ＾－１。结论结合５－Ｆｕ在兔眼前房的药代动力学研究资料，推论目前在人眼应用的剂量，不致对小鼠细胞造成损伤。     

地塞米松诱导牛眼小梁细胞凋亡的研究

目的：探讨地塞米松诱导牛眼小梁细胞凋亡的机制。方法：采取体外组织块培养法,培养新生牛眼小梁细胞。将1－500mg/L地塞米松加入融合的第3－5代小梁细胞培养液中,作用1－14d,用相差显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜、DNA电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：125－500mg/L地塞米松作用1－14d,小梁细胞凋亡呈浓度时间依赖性。 凋亡的小梁细胞经Hoechst3258染色,于荧光显微镜下观察,细胞核呈致密度浓染的颗粒块状荧光;透射电镜下可见小梁细胞染色质固缩,并有凋亡小体,细胞器基本完好;DNA电泳呈梯状条带,流式细胞仪测到亚二倍体峰。结论：地塞米松可诱导体外培养的小梁细胞凋亡,可能是激素性青光眼的发病机制之一。     

人眼小梁细胞体外培养与细胞鉴定

建立人眼小梁细胞体外培养方法和确定该细胞的鉴定要点。方法：小梁网和我巩膜组织来源于除眼部疾患以外各种原因死亡的６岁以下儿童，在２４小时内取材的３４人６８只正常眼球。组织块原代培养和细胞传代培养。用光镜和电镜观察培养细胞，用免疫组织细胞化学Ｓ－Ｐ法染色培养细胞的细胞外基质包括纤粘连蛋白，层粘连蛋白和Ⅳ型胶原。     

茶碱对培养的牛眼小梁细胞骨架及细胞间黏附的影响

目的 观察茶碱对培养的牛眼小梁细胞的增殖、细胞骨架、细胞间黏附的影响，探讨其降眼压机制。方法 组织块法培养牛眼小梁细胞。不同浓度的茶碱(1、10、50mmol／L)分别作用4h、8h，免疫细胞化学法观察小梁细胞微丝及微管的改变，MTT法观察小梁细胞的增殖。ELISA法检测不同浓度的茶碱作用4h后连接素(β-catenin)的相对表达量。结果 茶碱作用8h抑制细胞增殖。茶碱明显改变细胞形态、微管及微丝染色浓集，变化程度与药物浓度及作用时间有关。茶碱降低连接素的表达量。结论 茶碱抑制小梁细胞增殖，改变细胞骨架，降低细胞间黏附，提示茶碱可能通过影响细胞骨架及细胞间黏附减少房水流出阻力从而降低眼压。     

Inhibition of latrunculin-A on dexamethasone-induced fibronectin production in cultured human trabecular meshwork cells

AIM: To determine the effects of a low dose latrunculin (LAT)-A on dexamethasone (Dex)-induced upregulation of extracellular matrix proteins fibronectin (FN) in cultured human trabecular meshwork (HTM) cells. METHODS: HTM cells were cultured to confluent and incubated with 0.4μmol/L Dex and/or 0.05μmol/L LAT-A. FN expression in HTM cells was evaluated by Western blot and immunofluorescence microscopy. RESULTS: Dex up-regulated FN production in HTM cells, failed to do so when co-incubated with LAT-A. LAT-A decreased production of FN in cultured HTM cells. CONCLUSION: This study indicated that LAT-A may modulate the expression of fibronectin in trabecular meshwork to achieve treatment for steroids and other types of glaucoma. It has an important prospect as an intraocular pressure- lowering drug.     

高糖对牛眼小梁细胞形态、增殖及凋亡的影响

目的:建立牛眼小梁细胞体外培养体系,观察高浓度葡萄糖对小梁细胞的影响,研究高糖与开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)以及糖尿病与POAG之间的关系,探讨糖尿病开角型青光眼的发病机制,从而为指导开角型青光眼的临床用药提供重要依据。方法:以新鲜牛眼为材料,分离并培养小梁细胞,用光学镜、电镜观察正常小梁细胞的形态。将传至第3代的小梁细胞制作成细胞悬液、计数并接种于培养板(或培养瓶)中,待细胞贴壁后,将细胞分为两组:对照组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)和高糖组(葡萄糖浓度为35mmol/L),分别培养7d后收集细胞,用透射电子显微镜、MTT法、流式细胞仪(FCM)检测法,研究高糖对小梁细胞形态、增殖和凋亡的影响。结果:高糖组与对照组相比较,小梁细胞胞浆内细胞器减少,内质网、高尔基复合体、线粒体等细胞器肿胀,溶酶体及脂肪滴增多,核浆比减小,可见凋亡小体;高浓度葡萄糖对小梁细胞的增殖有明显的抑制作用,能够促进小梁细胞的凋亡,均有统计学意义(P<0.05)。结论:高糖可能通过使小梁细胞的增殖能力下降,凋亡率增加,使近管小梁网的网状结构改变,网孔变小,改变房水流出途径的阻力导致眼内压升高,可能是糖尿病患者PO-AG发病率增高的原因之一。     

选择性牛眼上皮样小梁细胞的体外培养

目的选择性行牛眼上皮样小梁细胞的体外培养，为进一步研究原发性开角型青光眼提供实验材料。方法利用组织块法进行小梁细胞的原代培养，之后利用机械划除法、酶消化法、反复贴壁法，对牛眼上皮样小梁细胞进行选择性培养和传代。结果成功选择性培养出形态、性状良好的牛眼上皮样小梁细胞。结论选择性牛眼上皮样小梁细胞的体外培养所获细胞形态单一，可以用此种方法进行牛小梁细胞的体外培养并为实验应用做好准备。     

Tranilast对人眼小梁细胞胶原合成的抑制

目的 观察tranilast对体外培养人眼小梁细胞胶原合成的影响。方法 体外培养第3～5代牛眼小梁细胞经0μg/ml(对照组)、12.5、25和50μg/ml tranilast处理后,采用~3H-脯氨酸掺入及液体闪烁测量技术观察tranilast对体外培养人眼小梁细胞胶原合成的影响。结果 12.5、25和50μg/ml tranilast处理组~3H-脯氨酸掺入率分别为(187±21)％,(127±18)％,(66±12)％,与对照组的(317±48)％比较有极显著差异;同时,~3H-脯氨酸掺入率随tranilast质量浓度增加而减少,呈剂量依赖性。结论 tranilast明显抑制小梁细胞胶原的合成。利用tranilast防治原发性开角型青光眼的可能性值得进一步研究。     

消化法牛眼小梁细胞的体外培养

目的 探讨用消化培养法体外培养牛眼小梁细胞，为进一步研究原发性开角型青光眼(POAG)提供实验材料。方法 0．25％胰蛋白酶、0．3％胶原酶等量混合行牛眼小梁细胞的原代培养和传代实验。结果 成功培养出性状良好的牛眼小梁细胞。结论 消化法培养牛眼小梁细胞可获得生长形态及特征稳定的小梁细胞，是值得提倡的培养方法。     

Functional properties of fibronectin in the trabecular meshwork

Fibronectin plays a number of important roles in the extracellular matrix (ECM) including providing structural support and signaling cues for cell survival, migration, differentiation, gene expression, growth factor signaling, and cell contractility. In this review, we examine recent findings about the biological and structural properties of fibronectin and discuss how these properties could contribute to the regulation of aqueous humor (AH) outflow in the trabecular meshwork (TM).     

维拉帕米对牛眼小梁细胞合成细胞外基质的影响

目的 探讨维拉帕米(Verapamil)对牛眼小梁细胞(BTMC)合成Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、透明质酸的影响。方法 采用免疫组化结合计算机图像分析和放免技术检测等于和低于0.01 mg/ml维拉帕米对BTMC合成胶原、纤维连接蛋白、透明质酸的影响。结果 0.001、0.005、0.01mg/ml维拉帕米可质量浓度依赖性抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白的合成(P<0.05),而促进透明质酸的合成(P<0.05)。0.005、0.01mg/ml维拉帕米可质量浓度依赖性抑制Ⅳ型胶原(P<0.05),而0.001mg/ml维拉帕米无此作用(P>0.05)。结论 维拉帕米可通过抑制细胞外基质在小梁网异常沉积,减少房水外流阻力,有望在发病学环节上治疗原发性开角型青光眼。     

维拉帕米对牛眼小梁细胞增殖和吞噬功能的影响

目的　研究维拉帕米对牛眼小梁细胞 (BTMC)增殖和吞噬功能的影响。方法　采用MTT和3 H TDR实验检测 0 0 0 0 1、0 0 0 0 5、0 0 0 1、0 0 0 5、0 0 1、0 0 5、0 1mg/ml 7种质量浓度的维拉帕米对BTMC增殖功能的影响。以乳胶微粒为标记 ,定量检测等于和低于 0 0 1mg/ml维拉帕米对BTMC吞噬功能的影响。结果　低于 0 0 1mg/ml维拉帕米对BTMC增殖功能无抑制作用 (P >0 0 5 ) ,等于或高于 0 0 1mg/ml的维拉帕米可浓度依赖性地抑制BTMC增殖功能 (P <0 0 5 ) ,其IC50 分别为 0 0 3 2 3mg/ml(MTT)和 0 0 2 5 9mg/ml( 3 H TDR)。 0 0 0 1、0 0 0 5、0 0 1mg/ml维拉帕米可浓度依赖性地促进BTMC的吞噬功能 (P <0 0 5 )。结论　临床应用的 0 12 5 %维拉帕米滴眼剂在房水中的质量浓度为 ( 160 7± 2 72 )ng/ml ,该质量浓度范围不抑制BTMC增殖。选用等于和低于 0 0 1mg/ml作为后续实验的质量浓度。维拉帕米还可通过促进小梁细胞的吞噬功能 ,减少房水外流阻力 ,有望在发病学环节上治疗原发性开角型青光眼     

tTG硫代反义寡核苷酸抑制牛眼小梁细胞tTG的表达

目的观察组织型谷氨酰胺转移酶(tissue transglutaminase,tTG)硫代磷酸化修饰反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对体外培养牛眼小梁细胞(bovine trabecular meshwork cell,BTMC)tTG在mRNA水平和蛋白水平表达的影响,初步探讨tTG-ASODN在治疗原发性开角型青光眼中的可能性。方法根据牛tTG mRNA的二级结构设计并合成ASODN1、ASODN2,用阳离子脂质体Lipofectamin包埋后转染BTMC,以半定量逆转录-聚合酶链反应法检测转染后tTG mRNA表达的变化,以免疫组织化学SP法检测转染后tTG蛋白表达的变化。结果ASODN1组和ASOND2组的tTG/GAPDH灰度比值分别为1.0695±0.0009、1.0662±0.0007,空白对照组和错义寡核苷酸组分别为1.0185±0.0024、1.0167±0.0012;tTG-ASODN1、tTG-ASODN2对BTMC的tTG mRNA和蛋白表达均有明显的抑制作用,与空白对照组和错义寡核苷酸组相比有显著性差异(P<0.05);tTG-ASODN1与tTG-ASODN22组间无显著性差异(P>0.05)。结论tTG-ASODN可明显下调BTMC的tTG在mRNA和蛋白水平的表达,提示tTG-ASODN有望在原发性开角型青光眼的治疗中发挥重要作用。