转化生长因子-β1shRNA真核表达载体的构建

目的 构建转化生长因子β1（TGF-β1）的短发夹状RNA（shRNA）表达系统，为人涎腺粘液表皮样癌的治疗提供新的方法。方法 根据Genebank提供的TGF-β1 mRNA序列，设计短链寡核苷酸，化学合成后经退火形成双链DNA片段，克隆到pWH1载体中，用酶切方法对重组体进行鉴定；最后将构建的TGF-β1特异性shRNA表达载体转染涎腺粘液表皮样癌细胞，通过RT-PCR、免疫组化观察其对细胞TGF-β1 mRNA和蛋白水平表达的影响。结果 经酶切、连接后构建的质粒称之为pWH1-TGF-β1。酶切证实成功构建了TGF-β1 shRNA表达载体，RT-PCR和免疫组化结果显示其能够在mRNA和蛋白水平抑制细胞内TGF-β1的表达。结论 成功构建的TGF-β1特异性shRNA表达载体具有阻断TGF-β1表达的功能，可能为涎腺粘液表皮样癌治疗提供有效的方法和手段。     

涎腺疾病

水通道蛋白-1，5在干燥综合征小鼠下颌下腺中的表达;：17β-雌二醇对涎腺黏液表皮样癌高转移细胞Mc3黏附、侵袭和移动力的影响;治疗角结膜干燥症自体颌下腺移植的血管处理;雌二醇对人涎腺腺样囊性癌细胞增殖和转移作用的研究;异丙肾上腺素对SD大鼠原代颌下腺细胞增殖的影响     

涎腺肿瘤组织TN－CmRNA和CDgmRNA的表达及其意义

目的：探讨Tenascin-C（TN－C）mRNA和CD9mRNA在涎腺肿瘤的表达及其对涎腺肿瘤鉴别诊断的价值。方法：采用原位杂交技术检测10例正常涎腺组织、25例多形性腺瘤（PA）、25例腺样囊性癌（ACC）、20例黏液表皮样癌（MEC）、10例腺泡细胞癌（ACCa）中TN-CmRNA和CD9mRNA的表达。结果：TN-CmRNA在正常涎腺组织中呈阴性表达;CD9mRNA在正常涎腺组织中的阳性率为100％;TN-CmRNA、CD9mRNA在4种涎腺肿瘤中均有表达,TN-CmRNA在多形性腺瘤中的阳性表达率显著高于腺样囊性癌和黏液表皮样癌,差异具有统计学意义,而在多形性腺瘤与腺泡细胞癌中的表达差异无统计学意义。CD9mRNA在多形性腺瘤中的阳性表达率高于腺样囊性癌,差异有统计学意义,而在多形性腺瘤和黏液表皮样癌、腺泡细胞癌中的表达差异无统计学意义;在多形性腺瘤中TN-CmRNA和CD9mRNA的表达呈正相关,在腺样囊性癌、黏液表皮样癌和腺泡细胞癌中TN—CmRNA和CD9mRNA的表达无相关性。结论：TN-CmRNA和CD9mRNA与涎腺肿瘤的发生有一定相关性,对涎腺肿瘤之间的鉴别诊断有一定意义。     

裸鼠体内原位移植法筛选粘液表皮样癌高转移细胞

目的：筛选高转移人涎腺粘液表皮样癌细胞。方法：用人涎腺粘液表皮样癌细胞Mc3经裸鼠涎腺移植、鼠间原位移植、细胞培养技术获取所需细胞,用相差显微镜、电子显微镜、细胞计数法、染色体显示法、流式细胞术、软琼脂克隆形成法以及癌细胞裸鼠尾静脉注射法研究其生物学特性。结果：经4次鼠间原位移植,肺转移率为3／10。取转移灶行细胞培养,获得形态均一、生长旺盛的上皮样细胞,命名为M3SP4。M3SP4细胞所致肺肿瘤显示粘液表皮样癌组织学特征,细胞染色体为亚二倍体,仍保持人类染色体形态。M3SP4与Mc3形态相似,群体倍增时间（h）分别为23.9和25.9,S期细胞（％）分别占细胞周期26.8和15.3,克隆形成率（％）分别为54.6和30.2,经尾静脉注射后M3SP4细胞引起的肺转移结节比Mc3多35％。结论：M3SP4是转移力强于Mc3的人涎腺粘液表皮样癌细胞系,Mc3细胞经裸鼠涎腺移植、鼠间原位移植后转移力有所提高。     

E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法：体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6（Age I/EcoR I）质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Tca8113细胞后,运用Real-Time PCR和Western检测三组E2F-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果：经酶切和测序证明,pLKO.1-PURO-U6-E2F-1shRNA序列正确;转染后,各组慢病毒载体中,第一组质粒感染后的Tca8113细胞中E2F-1基因的核酸电泳条带明显减弱,Western检测出E2F-1蛋白的表达降低。结论：靶向E2F-1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,并可特异性沉默E2F-1基因的表达,为研究E2F-1在口腔鳞癌的发生发展中的作用提供了初步的实验基础。     

外源性PTEN基因诱导黏液表皮样癌细胞系凋亡的研究

目的：探讨转染外源性PTEN抑癌基因对黏液表皮样癌细胞系M3SP2的诱导凋亡作用。方法：用含野生型PTEN抑癌基因逆转录病毒载体转染高转移性涎腺黏液表皮样癌细胞系M3SP2,转染空载体亲本细胞为对照细胞。体外细胞凋亡采用苏木精-伊红染色、电镜、TUNEL染色和流式细胞仪检测,裸鼠移植瘤细胞凋亡应用苏木精-伊红染色形态学判定。Bc l-2、P53和H-ras蛋白表达用免疫组化染色检测。结果：试验细胞M3SP2-PTEN与对照细胞M3SP2-pBp比较,出现较多的典型的凋亡细胞特征。试验细胞和对照细胞凋亡率分别为7.5%-13.6%和1.2%-2.3%;裸鼠移植瘤M3SP2-PTEN组和M3SP2-pBp组的凋亡指数分别为17.4%和3.5%。免疫组化染色显示M3SP2-PTEN细胞与对照细胞比较,P53蛋白表达增强,Bc l-2和H-ras蛋白表达减弱。结论：外源性PTEN抑癌基因能显著诱导高转移性涎腺黏液表皮样癌细胞凋亡,并且与P53、Bc l-2和H-ras蛋白表达有一定关系。     

涎腺正常与肿瘤组织中p63、CK5、CK19、CEA及SmA的表达

目的:探索涎腺正常导管、腺泡及其上皮性肿瘤的组织起源.方法:采用免疫组化(二步法)检测正常涎腺组织14 例、多形性腺瘤14 例、基底细胞腺瘤8 例、腺样囊性癌18 例、黏液表皮样癌9 例、低分化腺癌2 例及腺泡细胞癌、乳头状腺癌、恶性多形性腺瘤、肌上皮癌各1 例中p63、CK5、CK19、CEA及SmA的表达.结果:正常涎腺基底细胞与肌上皮细胞层表达CK5,其中部分细胞表达p63,导管部分基底细胞也呈CK19阳性.多形性腺瘤、基底细胞腺瘤、腺样囊性癌与黏液表皮样癌具p63、CK5及CK19高阳性率, SmA阳性率分别为85.71%、1.25%、61.11%、0.00%.CEA阳性细胞见于11.11%腺样囊性癌与55.56%黏液表皮样癌.结论:正常涎腺导管和腺泡的腺上皮及涎腺上皮性肿瘤可能来源于导管、腺泡基底层内呈p63和CK5阳性细胞中的干细胞.     

靶向抑制人木糖基转移酶-I基因的shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向抑制人木糖基转移酶- Ⅰ（XT- Ⅰ）基因的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体，为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖（PG）的研究奠定基础。方法根据GenBank提供的XT- Ⅰ基因序列，设计短链寡核苷酸，化学合成后经退火形成双链DNA片段，克隆到Pgenesil- 1载体中，构建shRNA真核表达载体WJ1-WJ6，行酶切及核酸测序鉴定；将构建的XT- Ⅰ特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-M，在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，流式细胞术检测转染效率，并采用半定量RT- PCR和Western blot分别检测转染后细胞XT- Ⅰ基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJ1、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6。酶切及核酸测序鉴定证实，构建的shRNA表达载体WJ1-WJ6序列正确；转染WJ1-WJ6后ACC-M细胞均可表达绿色荧光；流式细胞术测定转染效率平均为50.26%；RT- PCR结果显示，WJ3显著抑制XT- Ⅰ mRNA的表达，抑制率为72.39%；Western blot结果显示，WJ3有效抑制XT- Ⅰ的蛋白表达，抑制率为70.18%。结论成功构建靶向抑制XT- Ⅰ的shRNA真核表达载体WJ1-WJ6，其中WJ3可高效抑制XT- Ⅰ基因mRNA及蛋白水平的表达，为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础。     

涎腺透明细胞变异型黏液表皮样癌的临床病理研究

目的：报告10例涎腺透明细胞变异型黏液表皮样癌的临床病理及角蛋白表达特点。方法：回顾复习武汉大学口腔医学院1985～2006年收治、并经病理诊断为黏液表皮样癌的病例，确诊10例透明细胞变异型。全部病例行HE、PAS、AB—PAS、阿辛蓝和角蛋白免疫组织化学染色并随访。结果：本组病例约占同期所有涎腺MEC的4．7％（10／211），其中男女各5例，平均年龄42岁，腭部8例，舌根和腮腺各一例。镜下肿瘤主要由透明细胞组成的团块状或片状癌巢，其内混合少量非透明细胞（表皮样细胞或中间细胞），通常位于透明细胞的周边，呈逐渐的过渡。角蛋白免疫组化结果显示，CK7、CK8／18和CK19在所有病例中都呈强阳性表达，CK5／6、CK14、CK17和CK10／13大部分病例中呈局灶性或散在细胞表达。结论：透明细胞变异型黏液表皮样癌是黏液表皮样癌一种少见的变异，腭部多见。组织化学染色和CK10／13在透明细胞变异型黏液表皮样癌与非特异性透明细胞癌的鉴别诊断中有帮助。     

人黏液表皮样癌裸鼠耐药移植瘤模型的建立及其生物学特性

目的:建立一种耐药性稳定的人涎腺黏液表皮样癌裸鼠移植瘤模型.方法:将人涎腺黏液表皮样癌多药耐药细胞接种于裸鼠皮下,成瘤后经腹腔注射小剂量5-FU进行体内诱导,建立稳定的黏液表皮样癌裸鼠移植瘤模型.结果:裸鼠移植瘤原代培养的MEC/5-FU/NU细胞与体外培养细胞结构类似,MEC/5-FU/NU细胞对5-FU的耐药指数为27.82.RT-PCR显示耐药相关基因ABCB1、ABCB11、GSTA1在MEC/5-FU/NU细胞中明显高表达(P<0.05).免疫荧光显示多药耐药蛋白MDR-1在MEC/5-FU/NU细胞中高表达.结论:以MEC/5-FU建立的黏液表皮样癌裸鼠皮下移植瘤模型仍保持MEC/5-FU细胞的形态学特征和多药耐药性,可为耐药性人涎腺黏液表皮样癌耐药机制和逆转的研究提供较理想的动物模型.     

17β-雌二醇对涎腺黏液表皮样癌高转移细胞Mc3黏附、侵袭和移动力的影响

目的研究17β-雌二醇对涎腺黏液表皮样癌高转移细胞Mc3黏附、侵袭和移动力的作用。方法采用细胞体外黏附实验、体外移动实验、化学趋化性实验以及明胶底物SDS—PAGE凝胶电泳对基质金属蛋白酶（MMP）活性测定的方法研究17β-雌二醇对Mc3细胞黏附、侵袭和移动力可能存在的作用，用免疫组化的办法检测Mc3细胞的雌激素受体的表达。结果不同浓度（10^-9、10^-8、10^-7、10^-6mol／L）的17β-雌二醇处殚Mc3细胞72h后，其黏附率分别为38．3％、50．4％、69．2％、91．1％；而对照组为25．0％；作用48h后，10^-9、10^-8、10^-7、10^-6mol／L的17β-雌二醇对Mc3细胞在纤维连接蛋白（FN）上的移动促进率分别为16．9％、40．9％、36．4％、38．8％。在10^-6mol／L的17β-雌二醇的作用下，其对FN的化学趋化性增加60．3％。10^-9、10^-8、10^-7、10^-6mol／L的17β-雌二醇均可不同程度的促进Mc3细胞基质金属蛋白酶（MMP-2）的活性，在10^-6mol／L时尤为显著。在Mc3细胞中有雌激素核受体的表达。结论生理浓度的雌激素可促进Mc3细胞的黏附、侵袭和移动力。     

靶向survivin基因的shRNA真核质粒表达稳定株的筛选和建立

目的:针对survivin基因,构建短发卡状RNA干扰(short hairpin RNA interference,shRNA interference)真核质粒表达载体,并转染到高表达survivin基因的舌鳞癌细胞株Tca8113中,筛选出稳定低表达survivin基因的细胞株.方法:针对survivin基因的mRNA序列设计,并合成2对寡核苷酸序列,插入质粒pSilencerTM-2.1U6-neo中,形成重组质粒(PS1和PS2).用大肠杆菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,用脂质体介导转染Tca8113细胞,G418筛选得到稳定表达株,荧光实时定量PCR和Western印迹检测survivin基因在mRNA和蛋白水平的变化.采用SAS8.0软件包对数据进行t检验.结果:2个真核质粒表达载体均构建成功,并筛选出转染成功的细胞.与对照组相比,PS1和PS2转染的Tca8113细胞中的survivin基因在mRNA水平均显著下降,P<0.05;在蛋白水平,PS2转染后显著下降,P<0.01.结论:本研究成功建立针对survivin基因的shRNA质粒载体,并筛选出稳定低表达survivin基因的Tca8113细胞,为口腔鳞癌的基因治疗提供了理论基础.     

生存素基因诱导人黏液表皮样癌细胞凋亡的实验研究

目的 研究生存素(survivin)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3细胞的生长抑制效应及可能的作用机制,探讨生存素基因作为黏液表皮样癌基因治疗靶点的可行性.方法 设计合成靶向生存素特异性ASODN,转染Mc3细胞.将转染的Mc3细胞分为4组:空白对照组、脂质体转染组、生存素正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotide,SODN)转染组、生存素ASODN转染组.转染后24、48及72 h倒置显微镜观察Mc3细胞形态学变化,甲基噻唑基四唑(MTT)法观察转染前后对细胞增殖的影响,流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记法分析细胞凋亡指数,半定量反转录聚合酶链反应分别检测生存素mRNA的表达.结果 生存素ASODN转染组的Mc3细胞数量明显少于其他组,脱壁悬浮细胞明显增多,可见典型凋亡改变,并呈时间依赖性.生存素ASODN转染组Mc3细胞G1～G0期前出现明显的亚二倍体凋亡峰,Mc3细胞的凋亡率在转染后24、48及72 h分别为12.96%、14.43%及22.69%,明显高于其他组(P＜0.01),并呈时间依赖性(P＜0.05).生存素ASODN对Mc3细胞增殖抑制率分别为22.35%、39.04%、43.46%,明显高于其他组(P＜0.01),并呈时间依赖性(P＜0.05).生存素ASODN转染组在细胞转染后24、48及72 h Mc3的凋亡指数分别为11.038%、12.172%及18.900%,明显高于其他组(P＜0.01),并呈时间依赖性(P＜0.05).生存素ASODN转染组Mc3细胞生存素mRNA在24、48及72 h的相对表达量分别为0.739±0.008、0.668±0.007、0.500±0.006,相对抑制率分别为18.21%、26.06%、44.82%,明显低于其他组(P＜0.01),并呈时间依赖性(P＜0.01).结论 生存素ASODN可抑制人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3的生长增殖,诱导其凋亡,同时亦可抑制Mc3细胞生存素mRNA的表达,并呈时间依赖性.生存素可作为黏液表皮样癌基因治疗研究的一个靶点.     

短发夹状RNA沉默H-ras基因对人涎腺腺样囊性癌细胞增殖的影响

目的 探讨H-ras基因对涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)生物学特性的影响以及作为SACC基因治疗靶点的可行性.方法 构建H-ras靶向H-ras-shRNA质粒及阴性对照HK-shRNA质粒,经脂质体介导转染SACC-M细胞,G418筛选建立稳定转染细胞株,将细胞分为H-ras-shRNA转染组、HK-shRNA转染组及未转染细胞组.绘制细胞生长曲线检测细胞体外增殖能力;反转录聚合酶链法分析各组细胞中H-ras基因mRNA表达变化;荧光蛋白定量分析H-ras蛋白表达水平;流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡情况;裸鼠成瘤实验检测细胞在体内的成瘤能力,分析H-ras沉默对细胞增殖及凋亡的影响.结果 成功构建重组质粒并导入SACC-M细胞,建立稳定表达质粒的细胞株.H-ras-shRNA质粒能有效降低SACC-M细胞中H-ras表达,H-ras基因抑制率为61.80%,H-ras蛋白表达抑制率为62.76%.细胞增殖活性明显受抑,G0G1期比例增加;流式细胞术结果显示实验组细胞凋亡率为30.82%,显著高于阴性对照组及空白对照组的4.29%和4.16%.H-ras沉默细胞的裸鼠体内成瘤能力降低.结论 H-ras靶向shRNA干扰质粒能持续有效的抑制SACC-M细胞中H-ras基因及蛋白水平的表达,降低细胞体内外的增殖活性,并能有效诱导细胞凋亡.     

转化生长因子β1在人涎腺黏液表皮样癌高低转移细胞系中的表达

目的探讨转化生长因子(TGF)βl在人涎腺黏液表皮样癌高、低转移细胞株的差异表达。方法应用基因芯片技术、反转录(RT)-PCR、免疫组化、免疫印迹杂交等方法从基因水平和蛋白水平检测TGF-βl的表达。结果基因芯片技术、RT-PCR、免疫组化、Western blot结果都证实TGF-β1在人涎腺黏液表皮样癌脊髓转移株高表达,在低转移株不表达。结论TGF-β1的表达上调可能与人涎腺黏液表皮样癌转移有关。     

蛋白多糖与涎腺腺样囊性癌增殖的关系

目的 探讨蛋白多糖(proteoglycans)合成的阻抑对人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞增殖的影响.方法 构建靶向人木糖基转移酶-Ⅰ(xylosyltransferase-Ⅰ,XT-Ⅰ)基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体shRNA-WJ3,转染人涎腺腺样囊性癌高转移株ACC-M细胞,通过G418筛选稳定转染的细胞,采用实时定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法测定shRNA-WJ3的基因沉默效果;检测各组细胞蛋白多糖合成分泌水平的变化.采用甲基噻唑基四唑法(MTT)检测细胞增殖情况;流式细胞术测定细胞周期改变.结果 shRNA-WJ3转染ACC-M细胞后,细胞中XT-I基因的mRNA和蛋白表达抑制率分别为83.70%和79.60%;稳定转染shRNA-WJ3的ACC-M-WJ3细胞蛋白多糖分泌显著降低(P<0.01),抑制率为49.71%～54.59%.MTT法检测结果表明:蛋白多糖合成阻抑后,ACC-M细胞增殖活性明显降低;ACC-M-WJ3细胞与对照组细胞相比:S期细胞数目减少;G_1～G_0期细胞数目增加,差异有统计学意义(P<0.01).结论 蛋白多糖合成分泌的阻抑能有效抑制ACC-M细胞的增殖.     

Skp2靶向RNA干扰质粒的构建及其对人舌鳞癌Tca8113细胞的影响

目的运用RNA干扰技术阻断人舌鳞状细胞癌Tea8113细胞中Skp2基因的表达，观察Skp2基因沉默后对Tea8113细胞的影响。方法采用真核转录质粒pRNAT-U6．1／Neo构建针对Skp2基因的重组转染质粒。经聚乙烯亚胺法将其转染Tea8113细胞，通过反转录聚合酶链反应（reverse transcrip-tase polymerase chain reaction，RT-PCR）、Western blot检测Skp2、p27表达的变化；流式细胞仪、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl terrazolium，MTT）法检测转染后Tea8113细胞的细胞周期、生长速度的变化。结果转染重组质粒Skp2shRNA-2、Skp2shRNA-3后，Tea8113细胞内Skp2基因在mRNA和蛋白水平上均下调表达（P〈0．01），p27基因蛋白水平上调表达（P〈0．01）；而各重组质粒转染后p27基因的mRNA水平无明显变化。重组质粒Skp2shRNA-2、Skp2shRNA-3转染Tea8113细胞后，与对照组相比，G1～G0期细胞增加了约22％（P〈0．01），G2～M期和S期细胞减少了约10％和12％（P〈0．01），细胞的生长速度明显变慢（P〈0．01）。结论初步证明了Skp2、p27基因在口腔鳞状细胞癌细胞分化增殖中所扮演的重要角色；筛选出了高效RNA干扰重组质粒Skp2shRNA-2、Skp2shRNA-3，为进一步研究以Skp2基因为靶点的人舌鳞状细胞癌基因治疗奠定了基础。