胰岛分离、纯化制备的改进

目的 探讨大型哺乳动物胰岛机械化大量分离、纯化的方法,为人类胰岛移植物的大量制备摸索创造条件.方法 应用改进的机械化胰岛分离、纯化系统,用HCA和UW液顺序原位灌洗犬胰腺,主副胰管插管,4℃胶原酶-V(1.5 g/L)+胰酶抑制剂pefabloc(0.4 mmol/L)灌注后,Ricordi-Chamber消化罐消化,4℃COBE2991连续密度梯度离心纯化,测定胰岛当量(IEQ)、胰岛纯度及存活率、胰岛素及C-肽的释放量、培养24 h后光镜及电镜观察.结果 胰腺消化时间为(25.0±6.0)min,胰岛外分泌腺包裹率为(9.4±2.4)%,消化后胰岛收获量为(17.2±3.6)×104IEQ/每个胰腺,纯化后胰岛收获量为(8.3±2.0)×104IEQ/每个胰腺,胰岛纯度为(89.7±3.5)%.纯化胰岛体外低糖与高糖刺激下胰岛索分泌量及C-肽的释放量良好,培养24 h后形态结构及功能正常.结论 本实验室改进的胰岛机械分离方法及各设备运行可靠,获得的胰岛形态功能良好,可望用于临床人类胰岛的大量制备.     

乌司他丁在大鼠胰岛分离过程中的保护作用

目的探讨乌司他丁在大鼠胰岛分离中的保护作用。方法用含胶原酶的Hanks溶液灌注大鼠胰腺。根据胶原酶中乌司他丁的含量分为3组。低浓度组:胶原酶中含乌司他丁2500U/ml;高浓度组:胶原酶中含乌司他丁5000U/ml;对照组:胶原酶中不含乌司他丁。将各组分离出的胰岛进行比较。结果加用乌司他丁的两组分离出的胰岛在形态、数量方面均优于对照组(P<0.01)。在无糖、低糖、高糖和茶碱 高糖刺激下,加用乌司他丁的两组胰岛素的释放量优于对照组(P<0.01)。结论用乌司他丁灌注胰腺对大鼠胰岛分离具有保护作用。     

大鼠胰岛细胞的分离培养与鉴定

目的 探讨胰岛细胞的分离、培养与鉴定。方法 从实验室中挑选出30只成年雄性大鼠,将胶原酶注入大鼠的胰腺导管,聚蔗糖梯度离心法分离胰岛细胞,并培养与鉴定胰岛细胞。培养1周后用双硫腙（DTZ）行胰岛细胞鉴定。用丫啶橙（AO）、碘丙啶（PI）检测胰岛细胞活性。结果 经过分离与纯化,大鼠胰岛细胞的获得率较高且较稳定;分离后的胰岛细胞在适宜环境中生长,生长状态较佳,在培养后的12~24 h可贴壁,在培养后4~5 d细胞生长状态达到顶峰,细胞完好,且折光性能优异。利用免疫组化法鉴定胰岛细胞,分离的细胞SMA及PDGFR表达呈阳性,少数细胞vWF表达呈阳性。结论 我科此次分离纯化大鼠胰岛细胞的方法为逆行灌注胶原酶+原位消化+Ficoll液梯度分离法,实验结果显著,能在一定程度上获取纯度较高的大鼠胰岛细胞。分离后的胰岛细胞在培养4~5 d后达到最佳状态,适用于作为实验室胰岛细胞功能深入研究的实验材料。     

不同纯化方法对大鼠胰岛收获效果的研究

目的 探讨不同纯化方法对提高大鼠胰岛收获效果的作用。方法 随机选取SD雄性大鼠20只,按胰腺消化和胰岛纯化的方法的不同分为4组,消化过程中胆总管灌注胶原酶V,每组5只：①A组：Ficoll-400法纯化胰岛。②B组：光镜下移液吸移管手工挑拣纯化（手工法）胰岛。③C组：胰腺消化过程加入乌司他丁5000U／L．Ficoll-400法纯化胰岛。④D组：胰腺消化过程加入乌司他丁5000U／L,手工法纯化胰岛。结果 纯化后胰岛的收获量分别为A组（122±25．30）个,B组（179±21．02）个,C组（187±24．89）个和D组（276±24．85）个。乌司他丁灌注组（C组和D组）胰岛细胞的收获量与相应纯化方法的无乌司他丁灌注组（A组和B组）差异有统计学意义（P〈0．01）。手工法纯化组（B组和D组）胰岛的收获量与Ficoll-400纯化组（A组和C组）差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 手工法可明显提高胰岛的收获量,乌司他丁灌注胰腺对大鼠胰岛分离具有保护作用。     

大豆胰蛋白酶抑制剂对大鼠胰岛分离纯化的影响

目的探讨大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）在大鼠胰岛分离纯化中对胰岛产量及功能的影响。方法按胶原酶中是否加入STI将大鼠分为实验组和对照组，实验组在胶原酶消化液中按2．0mg／ml加入STI，对照组不添加STI。2组均运用胶原酶原位灌注大鼠胰腺的方法来分离胰岛，使用Ficoll-400用非连续梯度离心法纯化胰岛，将纯化前、后获得的胰岛进行计数，并对纯化后的胰岛进行形态、功能检查。同时进行大鼠同种异体胰岛移植观察其体内功能。结果实验组和对照组在消化后纯化前所得胰岛数量无明显差别[（624&#177;38．2）IEQVS（586&#177;37．7）IEQ，P〉0．053；在纯化后实验组与对照组所得胰岛数量[（408&#177;28．3）IEQVS（189&#177;27．1）IEQ，P〈0．05]和纯度[（93&#177;2．4）％VS（75&#177;2．1）％，P〈0．05；差异有统计学意义。实验组与对照组最终所得胰岛的体外功能差异无统计学意义（P〉0．05），体内功能实验结果差异亦无统计学意义（P〉0．05）。结论使用在胶原酶中加入STI的消化液原位灌注大鼠胰腺，可以明显提高大鼠胰岛的最终产量和纯度，但对胰岛的功能无明显影响。     

猪胰岛细胞分离纯化研究进展

目的综述猪胰岛细胞分离纯化的常用方法及最新研究进展。方法查阅近年来国内外关于猪胰岛细胞分离纯化的相关文献,进行总结分析。结果分离纯化的效果主要取决于供体的前期筛选、高质量胰腺的获取与有效保存,以及分离纯化方法的选择与改进。结论猪胰岛分离纯化操作的优化与标准化的建立,极大促进了异种胰岛移植研究的发展,有望解决目前移植供体短缺的问题。     

改良的大鼠近端肾小管上皮细胞分离纯化方法

目的　建立纯度高、操作简便的大鼠近端肾小管上皮细胞分离纯化方法。 方法 Wistar大鼠无菌取肾前先心脏抽血替代原位肾脏灌注,分离肾皮质,经Ⅰ型胶原酶消化后用45% Percoll分离液制备细胞悬液直接连续密度梯度离心。所得细胞用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基原代培养并传代,根据细胞形态、细胞角蛋白18（CK18）和水通道蛋白1（AQP1）免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶化学染色进行鉴定。 结果 此简化方法获得的肾小管细胞中肾小球掺杂明显减少,培养4～5 d后细胞融合长满,呈典型上皮样细胞的鹅卵石状,其CK18、AQP1免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶化学染色几乎均呈阳性,证实所培养细胞为近端肾小管上皮细胞。 结论 改良后的分离纯化方法可获得大量高纯度近端肾小管上皮细胞,操作简便。     

小鼠胰岛的分离与纯化

目的 探讨稳定、高效的小鼠胰岛细胞的分离纯化方法.方法 采用胆总管内灌注不同浓度胶原酶(分别为0.5、1.0、1.5 g/L)消化胰腺的方法分离BALB/C小鼠胰岛,Ficoll-400不连续密度梯度离心法纯化胰岛.双硫腙(DTZ)对胰岛进行特异性染色计算胰岛产量及纯度,葡萄糖刺激释放试验体外测胰岛功能.结果 不同浓度的胶原酶在不同时间内消化胰腺后收获的胰岛数量有较大的差异,其中采用0.5 g/L胶原酶V、38 ℃水浴消化20 min组收获量最大为(230±20)个胰岛细胞团,纯度约为90%.DTZ染色后胰岛呈腥红色,形态完整.葡萄糖刺激释放实验示高糖刺激后胰岛素释放量为低糖刺激后的2.3倍.结论 胶原酶浓度、消化时间和温度是影响小鼠胰岛分离结果的重要因素,当胶原酶浓度为0.5 g/L,消化时间20 min时可获得数量较多,纯度较好的胰岛细胞.

Abstract：

Objective To investigate the stable and efficient method of isolation and purification from mice pancreas. Methods BALB/C mouse islets were isolated by different concentrations of collagenase digestion (0. 5, 1. 0, 1. 5 g/L respectively) and purificated by Ficoll density gradient centrifugation.The number, purity and vitality of the islets were analyzed. The production and purity of the islets were checked by Dithizone immunofluorescence staining. The glucose-induced insulin secretion was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for islet function in vitro. Results Different number of islets was obtained by mice pancreas digestion with different concentrations of collagenase and for different digestion durations.After the mouse pancreata were digested in 38 C and with 0. 5 g/L collagenase V for 20rmin, maximum number of islets was obtained, and the purity of the final preparation was ＞ 95%. After culture in vitro, insulin release of islets under high glucose stimulation was 2. 3 times of that under low glucose stimulation. Conclusion Concentration of collagenase, temperature, and digestion duration were important factors of islet isolation and purification from mice pancreas. More production and higher purity of islets were obtained under the concentration of 0. 5 g/L collagenase Ⅴ for 20 min.     

三种消化酶在大鼠胰岛分离纯化中的效果比较

目的　分别用 3种酶消化大鼠胰腺 ,比较分离纯化后胰岛细胞的收获量、纯度、活性和功能。方法　将 2 1只SD大鼠按应用释放酶、胶原酶P、胶原酶V消化胰腺随机均分为A、B、C组。结果　A组的胰岛细胞收获量比B组或C组多 ( 93 0± 78比 692± 68或 70 6± 70 ,P <0 .0 5 ) ;纯度比B组或C组高 ( 93 .8± 2 .3比 88.4± 2 .0或 89.2± 2 .1,P <0 .0 5 ) ;成活率比B组或C组高( 97.2± 1.4比 92 .2± 1.9或 92 .9± 2 .1,P <0 .0 5 ) ;A组培养后胰岛素分泌量和葡萄糖刺激时胰岛素分泌量比B组或C组多 (P <0 .0 5 ) ;A组逆转糖尿病大鼠的高血糖状态时间比B组或C组长( 7.5± 1.3比 5 .8± 1.6或 6.3± 1.2 ,P <0 .0 5 )。结论　与胶原酶P和胶原酶V比较 ,释放酶消化大鼠胰腺可提高胰岛细胞的收获量、纯度、活性和功能。     

小鼠胰岛的分离及胰岛移植

目的研究小鼠胰岛分离和移植的方法。方法在Gotoh等所介绍的小鼠胰岛分离方法的基础上作了一些改进,由原来经胆总管注入胶原酶消化液改为由胆囊注入,并在消化液和Ficoll分离液中加入了胰酶抑制剂和BSA。结果使分离纯化后的胰岛产量由原来方法的41.7±13.2个提高到了266.5±32.1个(P<0.01),活性在95%以上,除了少量导管外几乎不含腺泡组织。结论改进后的方法可以在肉眼条件下注入消化液,而不需要解剖显微镜,既方便了操作又提高了成功率;避免了整个消化和分离过程中胰酶对胰岛的消化作用,提高了得率,且具有很好的重复性。     

成人胰岛细胞的分离纯化及初步的临床应用

目的分离及纯化成人胰岛,以用于同种胰岛细胞移植。方法利用胶原酶灌注消化以及Ficoll分离液分层纯化的方法获得成人胰岛细胞,并应用于2例临床糖尿病患者。结果经双硫腙染色鉴定,分离纯化后的胰岛细胞活性达到80%~90%;且经胰岛素释放试验表明,实验中收获的胰岛具有良好的胰岛素分泌功能。经临床试验,1例糖尿病患者在输入此胰岛后,已脱离胰岛素治疗;另1例患者已停止服用降糖药。结论用胶原酶灌注消化及Ficoll分离液分层纯化的方法获得成人胰岛细胞是可行的。     

乌司他丁对犬胰岛的保护作用

目的判定在机械分离纯化犬胰岛过程中,胰腺原位灌洗时应用乌司他丁(UTI)的保护作用,观察胰岛的获取产量。方法将20只犬随机分为两组,每组10只。HC-A组:胰腺经腹主动脉原位灌洗时用冷HC-A液2500ml;HC-A UTI组:胰腺原位灌洗时,HC-A液中加用UTI10000U/kg。两组均经主胰管用4℃胶原酶V控压灌注,在RicordiChamber系统中消化,用Ficoll连续梯度离心纯化。记录消化时间、胰岛外分泌腺包裹率、胰岛纯度、纯化后胰岛在体外用低糖与高糖刺激下胰岛素分泌量、C-肽的释放量及收获的胰岛当量(IEQ),并对纯化后的胰岛进行光镜及电镜观察。结果HC-A UTI组与HC-A组在胰腺消化时间、胰岛外分泌腺包裹率、胰岛纯度、纯化后的胰岛在体外经低糖与高糖刺激下胰岛素分泌量、C-肽的释放量以及胰岛的形态和结构上比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。HC-A组收获胰岛[(3.42±1.47)×104]IEQ,HC-A UTI组收获胰岛[(6.17±2.86)×104]IEQ,两组差异有统计学意义(P<0.05)。结论在犬胰岛分离和纯化过程中,胰腺获取原位灌洗液中加用UTI能保护胰腺组织,增加胰岛产量。     

低温培养对仓鼠胰岛分离后中央细胞损害的阻止作用

目的　探讨仓鼠胰岛分离后中央细胞的损害及阻止其损害的方法。方法　胰岛分离后分别在 37℃培养 7～ 14d ;2 6℃培养 7d ;2 6℃培养 2、4、7d后复温至 37℃继续培养 7d。用显微镜结合录像技术监测胰岛分离后的中央细胞损害情况 ;用计算机辅助分析系统定量算出胰岛的直径、面积以及中央细胞损害的面积 ,算出损害面积的百分比 ;用组织学及末端转移酶标记法 (TUNEL)技术观察胰岛细胞损害的形态学和功能特点。结果　胰岛在 37℃培养 7～ 14d期间 ,直径 >2 0 0 μm的胰岛呈现了中央细胞损害 (包括坏死和凋亡 )。胰岛在 2 6℃培养 7d ,没有出现中央细胞损害。 2 6℃培养7d后复温至 37℃继续培养 7d ,显著性降低了胰岛的中央细胞损害程度。结论　胰岛分离后的中央细胞损害与其直径大小成正比 ;2 6℃培养能够阻止胰岛分离后的中央细胞损害 ;2 6℃培养 7d后复温至 37℃ ,能够阻止大多数 (除直径 >30 0 μm)胰岛的中央细胞损害。     

成人胰岛细胞的分离

目的　探讨成人胰岛细胞的分离及胰腺冷缺血时间与胰岛细胞活率的关系。方法　采取胰、肾联合切取 ,经腹主动脉插管 ,用自制的灌注器以高渗枸橼酸盐嘌呤溶液 (HC A液 ) 15 0 0～2 0 0 0ml进行原位灌洗。将肾与胰腺、十二肠、脾分离 ,采用胶原酶P消化胰腺 ,分离并纯化胰岛细胞 ,以双硫腙及丫腚橙染色 ,测定所得到的胰岛细胞的纯度及活率。结果　胰腺的冷缺血时间为 2 .5～ 8h ,温缺血时间为 0～ 3min。胰岛收获量为 (2 .38± 0 .6 7)× 10 3 IEQ/g ,纯化后胰岛细胞的活率为 19%～ 83% ,冷保存指数 (或输注指数 )为 9.8～ 6 6 .4。胰岛细胞的活率与胰腺的冷缺血时间呈负相关 ,冷保存指数和胰岛细胞活率呈负相关。结论　以高渗枸橼酸盐嘌呤溶液灌洗、胶原酶P消化胰腺所得到的胰岛细胞活率高 ,但胰腺的冷缺血时间不宜超过 5h。     

成人胰岛大容量分离技术的改进及胰岛功能检测

目的 通过对人胰岛分离技术的改进以获得大量高活力胰岛并检测其功能,为利用同种异体胰岛移植治疗1型和部分2型糖尿病提供理论依据和技术基础。方法 采用改良的自动分离技术连续分离28例人胰岛,然后用连续性密度样度离心法纯化胰岛。胰岛收获量以国际标准的胰岛当量(islet equivalent,IEQ)表示。胰岛功能的测定分别为体外测定胰岛的胰岛素／DNA比率;静止葡萄糖刺激试验(SGS)及将胰岛移植至糖尿病裸小鼠的体内胰岛功能鉴定并随后进行腹腔糖耐量试验,连续测定移植鼠血糖水平及其体内C肽浓度。结果 28例成人胰腺分离的胰岛收获量为5000～1030000IEQ／胰腺,平均为291635IEQ／胰腺,前13例平均每个胰腺收获49123IEQ,平均每克组织收获846IEQ。平均纯度为87％,随着技术的改进后15例的分离结果则分别为：平均每个胰腺501813IEQ,平均每克组织7003IEQ,平均纯度89％。体外胰岛素刺激试验结果表明分离纯化后的人胰岛有正常功能,将12次分离得到的胰岛分别移植至34只糖尿病裸鼠肾包膜下,其中29只糖尿病裸鼠于12h内血糖恢复正常且糖耐量试验接近正常鼠,血中C肽水平亦接近正常鼠。结论 采用改进的人胰岛分离方法,可以获得大量高活力的具有正常功能的胰岛,为同种异体胰岛移植用于临床奠定了必要的实验基础。     

模拟微重力培养大鼠胰岛的形态学观察

目的应用电子显微镜观察模拟微重力培养对大鼠胰岛形态的影响。方法将新鲜分离和消化的大鼠胰岛分别进行普通培养和模拟微重力条件培养 ,应用扫描电镜和透射电镜观察各组大鼠胰岛的大体结构及超微结构的变化 ,并与新鲜分离的胰岛对照。结果培养 7d时透射电镜下观察微重力组的胰岛形态类似新鲜组的胰岛 ,胞浆内有发育良好的分泌颗粒和丰富的线粒体 ;扫描电镜显示只有微重力组胰岛与胰岛之间形成了许多小洞。结论模拟微重力培养时 ,胰岛的形态保持良好。     

转染人VEGF165基因对大鼠胰岛移植物再血管化及生物学功能的影响

目的探讨转染人血管内皮生长因子（VEGF）基因对大鼠胰岛移植物再血管化和生物学功能的影响。方法实验分二步进行，首先构建携带人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因的重组腺病毒载体AdhVEGF165，用其按病毒／细胞的感染倍数（MOI）分别为10、100、500的比例在体外转染新鲜分离、纯化的近交系Lewis大鼠胰岛，检测体外培养的胰岛表达hVEGF165基因的情况；然后按MOI为10的比例在体外用AdhVEGF165转染Lweis大鼠胰岛，再经门静脉注射至近交系Lewis大鼠的肝脏内（VEGF组），并设不含hVEGF165基因的空载体转染对照组（GFP组）和磷酸盐缓冲液处理对照组（PBS液组），术后测定受鼠的血糖变化，进行静脉糖耐量试验（IVGTT），并观察受鼠肝脏中移植胰岛的组织学变化。结果体外转染hVEGF165基因的大鼠胰岛分泌至细胞外的hVEGF165的浓度显著高于未转染者（P〈0．01）。糖尿病大鼠移植转染hVEGF165基因的胰岛后，静脉注射葡萄糖后40、60、120min时的血糖水平显著低于GFP组和PBS液组（P〈0．05）；40min时体循环中胰岛素的浓度，VEGF组显著高于GFP组和PBS液组（P〈0．05）；VEGF组移植胰岛内CD34和胰岛素免疫组化染色的强度均高于GFP组和PBS液组。结论转染hVEGF165基因对胰岛移植物的再血管化和生物学功能有促进作用。     

诱导供者胰岛细胞高表达血红素加氧酶-1延长大鼠胰岛移植物的存活时间

目的 探讨钴原卟啉(CoPP)诱导大鼠胰岛细胞高表达血红素加氧酚1(HO-1)后,对延长胰岛移植物存活时间的作用.方法 (1)将分离和纯化的供者(BN大鼠)胰岛细胞分为CoPP诱导组和未诱导组.CoPP诱导组供者在分离胰岛细胞前3天和前1天腹腔注射2.5 mg/kg的CoPP,未诱导组不注射CoPP.诱导后,采用免疫荧光法及Western免疫印迹法检测两组胰岛细胞中HO-1的表达情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和葡萄糖刺激试验检测胰岛细胞的胰岛素释放水平.(2)Lewis大鼠经四氧嘧啶静脉注射后建立糖尿病模型,取10只成功建立糖尿病模型的大鼠作为胰岛细胞移植的受者,随机平均将受者分为实验组和对照组,分别移植经CoPP诱导和未经诱导的供者胰岛细胞.移植后,观察和比较两组受者胰岛移植物的存活时间和发生排斥反应后胰岛移植物的组织病理学变化.结果 CoPP诱导组胰岛细胞高表达HO-1,而未诱导组不表达HO-1;CoPP诱导组和未诱导组供者胰岛细胞胰岛素分泌量,在低糖刺激下分别为(15.65±0.89)mU/L和(12.28±0.89)mU/L(P>0.05),在高糖刺激下分别为(46.60±1.13)mU/L和(19.01±1.49)mU/L(P<0.05),刺激指数分别为2.98±0.10和1.55±0.01(P<0.05).实验组和对照组胰岛移植物平均存活时间分别为(12.20±5.67)d和(5.60±1.14)d(P<0.05);当受者发牛排斥反应时,对照组胰岛移植物周边可见明显的淋巴细胞、成纤维细胞以及单个核细胞浸润,而实验组细胞浸润的程度明显较轻.结论 CoPP可诱导大鼠胰岛细胞高表达HO-1,其对胰岛细胞有明显保护作用.移植高表达HO-1的胰岛细胞能显著延长胰岛移植物的存活时间.