人类管家基因和非管家基因microRNA绑定密度的比较及与3′UTR进化保守性关系的分析

目的：该研究从整体水平比较microRNA（miRNA）对管家基因和非管家基因的调控差异并研究3′UTR的进化保守性与miRNA对两类基因调控差异之间的相关性。方法通过对3个基于序列的miRNA靶基因预测软件整合分析,并结合基于miRNA-靶基因的表达谱数据相关性分析,以获得miRNA对两类基因的调控情况,同时利用phastCons保守性分值对两类基因的3′UTR区域进行多物种进化分析。结果研究发现miRNA在管家基因的3′UTR上有显著地高密度绑定,管家基因的3′UTR区域具有相对较高的序列保守性。结论该研究结果突出了miRNA对管家基因表达调控的重要作用,对于重新理解miRNA对真核生物基因表达调控作用具有一定的参考价值。     

miRNA参与的动物发育调控研究进展

动物的发育是一个严格受控的复杂过程,需要在时空上精确控制相关基因的表达.miRNA通过抑制靶mRNA翻译或使之降解失稳从而在转录后降低基因的活性.近期的实验研究表明,miRNA在动物发育的诸多方面发挥着重要调控功能,并表现出特有的调控模式.本文对miRNA参与动物发育过程的调控研究进行了综述.     

hsa-miR-5688在肝细胞癌中靶途径预测体系的构建与验证

目的 构建并预测在原发性肝细胞癌(肝癌)中hsa-miR-5688的靶途径及调控机制,并通过TCAG数据库和串联质量标签(TMT)标记LC-MS/MS蛋白质测序方法验证其结果,以期构建准确高效的微小RNA(miRNA,miR)靶途径预测方案.方法 通过五大线上数据库筛选hsa-miR-5688靶基因,对细胞定位、分子功...     

hsa-miR-221调控非小细胞肺癌分子网络的生物信息学分析

目的应用生物信息学的方法研究hsa-miR-221在非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma,NSCLC）中的分子调控网络。方法运用UCSC基因组浏览器、人类miRNA疾病数据库、TF-miRNA结合数据库、miRNA靶基因预测数据库、GeneCards数据库、肺癌相关因子整合数据库和转录因子结合谱数据库等,研究hsa-miR-221上游转录因子、下游靶基因及与其有相互作用的lncRNA的多个调控途径,绘制hsa-miR-221在NSCLC中分子调控网络。利用GEO数据库验证关键基因。结果UCSC数据库显示hsa-miR-221位于X染色体,在多个物种中保守。hsa-miR-221与多种癌症包括NSCLC相关。分析表明hsa-miR-221受6个与NSCLC相关的转录因子如MYC、MYCN等的调控,同时又调控下游基因PTEN、RB1和BCL2等26个基因。另外,lncRNA基因GAS5、HOTAIR和TUG1及其转录因子Snail、n-MYC、ARNT和SOX5等也可能参与调控hsa-miR-221,从而构成一个以hsa-miR-221为核心的调控网络,在NSCLC的发生和发展中起重要作用。通过对GEO数据库hsa-miR-221高表达NSCLC细胞系差异基因分析,最终验证了5个基因。结论用生物信息学的方法预测hsa-miR-221的分子调控网络,为阐明其调控NSCLC的发病机制提供指导。     

ErbB4基因miRNA干扰质粒的构建和有效性鉴定

目的构建ErbB4基因特异性miRNA表达载体并检测其有效性。方法设计合成大鼠ErbB4基因特异性miRNA前体寡核苷酸,构建ErbB4基因特异性的重组miRNA干扰质粒。从大鼠脑分离提取总RNA,经RT-PCR构建靶序列质粒,并将其与miRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞,经实时定量RT-PCR技术鉴定其干扰有效性。结果与结论针对ErbB4基因的miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制其靶基因的表达。该质粒为后续ErbB4基因特异性miRNA慢病毒表达载体的构建及ErbB4的相关功能研究奠定了基础。     

ErbB4基因miRNA干扰质粒的构建和有效性鉴定

目的构建ErbB4基因特异性miRNA表达载体并检测其有效性。方法设计合成大鼠ErbB4基因特异性miRNA前体寡核苷酸,构建ErbB4基因特异性的重组miRNA干扰质粒。从大鼠脑分离提取总RNA,经RT-PCR构建靶序列质粒,并将其与miRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞,经实时定量RT-PCR技术鉴定其干扰有效性。结果与结论针对ErbB4基因的miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制其靶基因的表达。该质粒为后续ErbB4基因特异性miRNA慢病毒表达载体的构建及ErbB4的相关功能研究奠定了基础。     

miRNA参与p53基因调控网络研究进展

在细胞增殖和细胞死亡等过程中均发现一些miRNA可以作为肿瘤抑制基因或癌基因参与调节。研究发现miR-34作为p53转录激活的靶分子,参与了包括细胞周期阻滞和细胞凋亡等过程的调节,miR-34的缺失可使p53介导的细胞效应受阻。miR-29可激活p53的表达并诱导p53介导的细胞凋亡。此外,还有许多miRNA分子受到p53的转录抑制。一种miRNA可调节多种不同的靶蛋白分子,因此大大拓展了p53调控网络的层面。越来越多的证据表明miRNA参与了癌基因和抑癌基因网络的调控,同时为肿瘤治疗提供了新的治疗策略。     

空间飞行MG63细胞重力敏感新miRNA HN22的鉴定与功能分析

目的筛选空间飞行引起的MG63成骨细胞差异表达新miRNA并进行功能分析。方法对空间飞行后的MG63成骨细胞small RNA(sRNA)进行测序及生物信息学分析,得到空间飞行导致显著变化的新miRNA。利用地面回转模拟微重力效应实验验证其表达变化情况;采用miRNA转染分析其对成骨细胞分化的影响;采用多种miRNA靶基因预测软件综合预测其靶基因并检测其潜在靶基因的表达情况;通过GO注释和Panther pathway进行靶基因功能分析。结果新miRNA HN22在空间飞行和地面回转模拟微重力条件下均发生显著表达变化;HN22转染显著提高成骨分化相关基因表达。靶基因预测结果分析显示HN22可影响成骨细胞Wnt信号通路与钙黏蛋白信号通路。Wnt信号通路中的Wnt5a与HN22的表达趋势相反,是其潜在的靶基因。结论HN22可响应微重力变化,并靶向Wnt信号通路中的Wnt5a与钙黏蛋白信号通路影响成骨细胞分化。     

microRNA与细胞周期调控

microRNA(miRNA)是一类长度为22～25个核苷酸的小RNA,这类非编码的小RNA分子在转录后水平上特异性地调节基因的表达.研究表明,miRNA可调控在细胞周期进程中直接或间接发挥作用的蛋白质分子;其表达水平的改变会使得细胞周期进程失去控制从而导致肿瘤的发生.此外,miRNA可分别作为癌基因和抑癌基因发挥作用从而参与细胞周期进程的调控,尤其是对细胞周期检查点的调控;它们通过协同调控多个靶基因参与细胞周期进程.     

miRNA功能研究进展

miRNA是一类长度为20~25nt的小分子非编码RNA。在线虫、小鼠、人、植物等多种生物中已发现了数百种miRNA。无论在低等的线虫还是在高等的哺乳动物中，miRNA都起着调控基因表达的重要作用。生物信息学分析表明人类全部基因的三分之一都受到miRNA的调控。这表明，miRNA分子实际上是基因调控网络中的核心成分。近来研究发现miRNA与人类的某些疾病密切相关。本文对miRNA分子功能及其研究方法的进展做一概述。     

shRNA干扰肝癌细胞Kir6.2基因表达载体的构建及鉴定

目的构建shRNA体内表达载体pGenesil-3-siRNA,筛选出抑制Kir6.2基因表达的有效靶序列.方法以Kir6.2基因为目的基因,以产生shRNA质粒载体pGenesil-3为表达模板,细胞内转录合成2条siRNA,脂质体转染法将shRNA质粒载体pGenesil-3共转染SK-Hep1细胞,将细胞分为SK组(未转染)、HK组(转染阴性对照质粒)、K1组(转染重组质粒K1)和K2(转染重组质粒K2)组.经G418筛选出单克隆进行培养,用RT-PCR和Western Blotting分别检测Kir6.2 mRNA和蛋白的表达,筛选出抑制Kir6.2表达的有效siRNA靶序列.结果SK、HK、K1和K2组Kir6.2 mRNA表达的相对量分别为0.936±0.042、0.848±0.058、0.225±0.0360、0.171±0.029,K1、K2组Kir6.2 mRNA的表达与HK、SK组比较均明显降低(P＜0.05).SK、HK、K1和K2组的Kir6.2蛋白表达的量分别为0.925±0.045、0.901±0.067、0.269±0.024、0.318±0.031,K1、K2组Kir6.2蛋白的量与HK、SK组比较均明显降低(P＜0.05).结论shRNA抑制了肝癌细胞Kir6.2基因的表达.     

基因治疗在周围神经损伤修复中的应用

随着分子生物学研究的飞速发展，基因治疗在基础和临床得到了广泛的应用，在周围神经损伤修复领域表现出尤为广阔的前景。目前，基因治疗修复周围神经损伤的基本策略是利用载体工具将编码神经营养因子的基因转入靶细胞，使之在体内持续表达，进而达到治疗效果。本文着重就神经营养因子、靶细胞、载体工具3个方面介绍当前国际上基因治疗修复周围神经损伤的研究情况。     

RNA干涉抑制NIH3T3细胞中外源PC-1基因表达

目的：获得能有效抑制PC—1基因表达的RNAi靶标，用RNAi技术研究PC-1基因表达在前列腺癌中的作用。方法：用DNA重组技术构建了可表达短发夹RNA的重组质粒，将重组质粒与表达PC-1-EGFP融合蛋白的质粒共转染NIH3T3细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达差异，从5个候选靶标中初筛出最合适的RNAi靶标，再通过RT—PCR和Western印迹从mRNA水平和蛋白质水平检测该RNAi靶标抑制PC-1基因表达的效果。结果：利用RNA干涉有效靶点抑制了NIH3T3细胞中外源PC-I基因表达。结论：这一策略适合大量筛选：RNAi有效靶标序列，其结果为研究RNAi技术降低PC-1基因的表达对前列腺癌细胞的影响奠定了基础。     

Gene expression and gene therapy imaging

The fast growing field of molecular imaging has achieved major advances in imaging gene expression, an important element of gene therapy. Gene expression imaging is based on specific probes or contrast agents that allow either direct or indirect spatio-temporal evaluation of gene expression. Direct evaluation is possible with, for example, contrast agents that bind directly to a specific target (e.g., receptor). Indirect evaluation may be achieved by using specific substrate probes for a target enzyme. The use of marker genes, also called reporter genes, is an essential element of MI approaches for gene expression in gene therapy. The marker gene may not have a therapeutic role itself, but by coupling the marker gene to a therapeutic gene, expression of the marker gene reports on the expression of the therapeutic gene. Nuclear medicine and optical approaches are highly sensitive (detection of probes in the picomolar range), whereas MRI and ultrasound imaging are less sensitive and require amplification techniques and/or accumulation of contrast agents in enlarged contrast particles. Recently developed MI techniques are particularly relevant for gene therapy. Amongst these are the possibility to track gene therapy vectors such as stem cells, and the techniques that allow spatiotemporal control of gene expression by non-invasive heating (with MRI guided focused ultrasound) and the use of temperature sensitive promoters.     

红色糖多孢菌ΔSACE_0065,ΔSACE_2559和ΔSACE_2565突变体构建及对孢子分化的影响

目的构建红色糖多孢菌ΔSACE_0065、ΔSACE_2559和ΔSACE_2565三个突变体并研究其功能。方法将待失活目的基因的上下游同源片段依次连接到pUCTSR质粒Thio抗性基因（tsr）两侧,利用PEG介导的原生质体转化法将线性DNA同源片段转入红色糖多孢菌A226内,通过同源重组使目的基因失活,最后将构建出的三个突变株与出发菌株A226及ΔbldD突变株进行比较,观察孢子生长有无差异。结果与结论成功构建ΔSACE_0065、ΔSACE_2559和ΔSACE_2565三个突变株;与A226相比,ΔSACE_0065和ΔSACE_2559气生菌丝和孢子形成推迟,而ΔSACE_2565突变株的生长情况则无明显变化,提示红色糖多孢菌SACE_0065、SACE_2559基因参与其形态分化的调控。     

红色糖多孢菌染色体基因快速失活技术研究及应用

目的：研究红色糖多孢菌染色体快速同源重组基因失活技术。方法：以Thio抗性基因（tsr）作为筛选标记,在其上下游分别连接失活目的基因两侧同源片段,利用PEG介导原生质体转化将线性DNA同源片段转入红色糖多孢菌,通过tsr基因两侧同源片段与染色体同时重组,将目的基因敲除或失活。结果：tsr基因两侧同源片段长度与红色糖多孢菌染色体同源重组效率密切相关,同源片段长度在500 bp左右时,线性片段与染色体有效重组率很低,而同源片段长度超过1000 bp时,可获得有效的基因失活突变菌株。通过这种技术构建的红色糖多孢菌ΔbldD基因突变体,合成红霉素产量显著降低,说明bldD参与红霉素合成基因调控。结论：红色糖多孢菌染色体快速同源重组基因失活技术,对于分析红色糖多孢菌基因功能具有重要作用。     

HIP1基因沉默对人前列腺癌PC-3细胞增殖的影响

目的研究HIP1基因沉默对人前列腺癌PC-3细胞增殖的影响。方法构建靶向HIP1的shRNA表达载体pSilence-shHIP1,应用脂质体转染到PC-3细胞,RT-PCR检测HIP1基因沉默效果,Western blotting确认有效作用靶点。通过细胞划痕实验和细胞生长曲线研究HIP1基因对PC-3细胞增殖的影响。结果转染PC-3细胞后,沉默HIP1基因效率达83%(P<0.01);Western blotting证实该基因片段为抑制HIP1的有效作用靶点。细胞划痕实验和生长曲线显示HIP1基因沉默可抑制PC-3细胞的增殖。结论 pSilence-shHIP1表达载体可特异性地抑制HIP1基因的表达,沉默HIP1基因可抑制PC-3细胞增殖和迁移。     

CT抗原NY-ESO-1基因克隆、表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达人CT抗原NY-ESO-1,对表达产物进行Western印迹鉴定和纯化,为今后利用其进行肿瘤疫苗的研究奠定基础.方法:通过全基因拼接获得NY-ESO-1基因,构建重组表达载体NY-ESO-1-pET28a( ),在大肠杆菌BL21(DE3)中利用IPTG诱导获得表达,利用单克隆抗体进行Western印迹鉴定,通过Ni柱亲和纯化获得纯化蛋白.结果与结论:拼接的NY-ESO-1全基因经测序证明与GenBank中人的NY-ESO-l全基因完全相符;构建的原核表达载体NY-ESO-1-pET28a( )可稳定地可溶性表达NY-ESO-1蛋白;经Ni柱亲和纯化获得较好的纯化结果;利用鼠抗人单克隆抗体对表达的蛋白进行验证,结果显示阳性.本研究成功利用原核表达系统实现了对CT抗原NY-ESO-1的可溶性表达.     

microRNA-196a2单核苷酸多态性对靶基因IL-2表达的影响

目的观察基因单核苷酸多态性（SNP）对成熟microRNA（miRNA）-196a2在人角质形成细胞HaCaT细胞中表达水平的影响,及对预测的靶信使RNA（mRNA）IL-2 3＇非翻译区（UTR）结合能力的影响,探讨miRNA-196a2 SNP是否与皮肤病等自身免疫性疾病关联。方法在HaCaT细胞中转染构建miR-196a2-T（野生型）和miR-196a2-C（突变型）的表达质粒,RT-PCR检测表达效果;将两种基因型的表达质粒与预测的靶mRNA IL-2 3＇UTR的报告基因质粒共转染细胞,双荧光素酶报告基因实验分别检测结合能力,并使用SPSS17.0软件统计分析。结果成功构建miR-196a2-T/C表达质粒和IL-23＇UTR报告基因质粒;miRNA-196a2野生型和突变型的表达质粒在HaCaT细胞中的表达水平无显著差异（P〉0.05）;IL-2是miR-196a2的靶基因,SNP影响miR-196a2与IL-2 3＇UTR的结合（P〈0.05）。结论 MiR-196a2可与IL-2结合调节其转录后水平,从而参与免疫反应,可能影响多种皮肤病等自身免疫性疾病的进程。