稳定表达人骨形成蛋白2成纤维细胞的建立与鉴定

目的 探讨ＢＭＰ对细胞分化的调节作用,为ＢＭＰ基因疗法的建立提供依据。方法 构建了含有人ＢＭＰ２开放阅读框（１．２ｋｂ）的真核表达载体ｐＢＫ－Ｂ２利用脂质本转染方法将其导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过Ｇ－４１８筛选获得了性细胞克隆,细胞原位杂交和免疫组化检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达情况。结果 转染细胞内有ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的转录及其蛋白的表达,结论：人ＢＭＰ２基因ＮＩＨ３Ｔ３细胞中得到稳定有效的方法。     

癌基因、抑癌基因产物在卵巢和乳腺肿瘤中的表达

用免疫组化ＬＳＡＢ法对４５例卵巢上皮性肿瘤进行了癌基因ＥＧＦＲ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ｃ－ｅｒｂＢ－３及抑癌基因Ｐ（５３）的检测，对６０例乳腺肿瘤进行了Ｐ（５３）的检测，以研究癌基因及抑癌基因产物在卵巢及乳腺肿瘤中的表达情况及其相关关系。结果表明，恶性肿瘤存在多种癌基因产物的过量表达，ＥＧＦＲ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ｃ－ｅｒｂＢ－３三者在卵巢上皮性肿瘤中的表达有相关关系；卵巢癌及乳腺癌均有Ｐ￣（５３）表达，说明Ｐ￣（５３）基因可能与多种肿瘤的发生有关。     

穿孔素介导的细胞毒效应在病毒性心肌炎小鼠发病中的作用

目的探讨穿孔素（ＰＦＰ）介导的细胞毒效应在病毒性心肌炎（ＶＭＣ）发病中的作用。方法４０只小鼠等分为ＣＶＢ３感染组及非感染组;所有小鼠于感染后第１０天处死并取其心脏;采用免疫组化技术检测心肌浸润细胞中ＰＦＰ的表达,原位杂交方法检测心肌中ＣＶＢ３ＲＮＡ;半定量分析ＰＦＰ抗原及ＣＶＢ３ＲＮＡ水平,并分析ＰＦＰ抗原水平与ＣＶＢ３复制及心肌病变程度的关系。结果ＰＦＰ抗原阳性信号指数与ＣＶＢ３ＲＮＡ杂交阳性信号指数呈显著负相关（ｒ＝－０．８２,Ｐ＜０．０５）,与心肌病变积分呈显著正相关（ｒ＝０．９１,Ｐ＜０．０５）。结论ＰＦＰ介导的细胞毒效应在ＶＭＣ发病中可能具有抗病毒及致心肌损害双重作用。     

非霍奇金淋巴瘤中EB病毒BNLF_1片段及其表达产物的检测及意义

为研究ＥＢ病毒与非霍奇金淋巴瘤（ＮＨＬ）的关系，采用ＰＣＲ、原位杂交、ＬＳＡＢ（ｌａｂｅｌｉｎｇｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｖｉｎｂｉｏｔｉｎ）免疫组化技术，检测３２例ＮＨＬ和３３例反应性增生淋巴结中的ＥＢＶＢＮＬＦ１基因片段及其表达产物潜伏膜蛋白（ＬＭＰ１）。ＮＨＬ中ＥＢＶＢＮＬＦ１ＰＣＲ扩增阳性率为５３％，明显高于反应性增生淋巴结组２７％（Ｐ＜０．０５），其中５例Ｔ细胞淋巴瘤全部阳性。１７例ＰＣＲ阳性的ＮＨＬ中５例原位杂交阳性。ＬＭＰ１检测仅２例阳性。结果表明本组病例半数以上ＮＨＬ中有ＥＢＶ感染，可能与肿瘤的发生发展有一定关系。     

骨肉瘤和骨巨细胞瘤的P53蛋白,PCNA表达与肿瘤组织微血管密 …

目的：探讨骨肉瘤和骨巨细胞瘤的Ｐ５３蛋白,增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）表达与癌组织内微血管密度（ＭＶＤ）的关系。方法：应用免疫组化和形态计量方法检测４０例骨肉瘤和４０例不同级别骨巨细胞瘤的Ｐ５３蛋白、ＰＣＮＡ表达与肿瘤组织内ＭＶＤ之间的关系。结果：骨巨细胞瘤Ⅱ～Ⅲ级组ＰＣＮＡ表达明显于高于巨细胞瘤的Ｐ５３骨巨细胞瘤１级组（Ｐ〈０．０５）,且骨巨细胞癌ＭＶＤ≥５的肿瘤组织Ｐ５３蛋白表达明显高于ＭＶＤ〈     

胃癌中PCNA、P53、C-erbB-2的表达与预后关系

目的　探讨胃癌ＰＣＮＡ、Ｐ５３、ＣｅｒｂＢ２ 表达及其与病理类型、浸润转移的关系。方法　应用ＳＰ免疫组化方法,观察７２ 例胃癌中ＰＣＮＡ、Ｐ５３、ＣｅｒｂＢ２ 的表达情况。结果　ＰＣＮＡ指数在高分化组为２０．００±３ ．３３与低分化组３４．１８±３ ．４６ 两者比较差异有显著性意义（Ｐ＜０．００１）,Ｐ５３和ＣｅｒｂＢ２ 在胃癌中表达率分别为４４．４０％和６０．０％ ,其表达与病理类型无关。在浸润深度与淋巴结转移方面,ＰＣＮＡ、Ｐ５３、ＣｅｒｂＢ２ 均显示了正相关。结论　ＰＣＮＡ 表达指数和Ｐ５３、ＣｅｒｂＢ２ 表达率越增加越容易致胃癌浸润和淋巴结扩散,可作为判断胃癌预后的预测指标。     

鼻咽癌细胞中MDM2基因的表达及其与p53蛋白表达的联系

目的：明确ＭＤＭ２基因在鼻咽癌（ＮＰＣ）组织中的表达情况及其与Ｐ５３蛋白表达的联系。方法：运用非同位素原位杂交和免疫组化技术对４６例ＮＰＣ,１２例慢性鼻咽炎症粘膜（ＣＩＮＥ）进行了ＭＤＭ２ ｍＲＮＡ,ＭＤＭ２蛋白表达的检测结果：１４例ＮＰＣ为Ｐ５３蛋白的高表达相联系（Ｐ〈０．０５）。结论：ＭＤＭ２蛋白可能通过与Ｐ５３蛋白结合及相互作用而在ＮＰＣ的发生过程中起着重要作用。     

MDM2,P53蛋白在星形细胞瘤中的表达

探讨ＭＤＭ２、Ｐ５３蛋白在星形细胞瘤发病中的作用及其与肿瘤病理分级，患者预后间的关系。方法用免疫组化技术链霉亲和素－生物素－过氧化物酶复（ＳＡＢＣ）法对确诊并有随访的４５例星形细胞瘤标本进行ＭＤＭ２、ｐ５３蛋白定位观察。结果发现ＭＤＭ２ｐ５３蛋白表达阳性率分别为４８．９％（２２／４５）和４６．７％（２１／４５），其阳性率与肿瘤病理分级呈显著正相关。本组中ＭＤＭ２和Ｐ５３共同性表达１２例，占２６．７     

穿孔素介导的细胞毒效应在病毒性心肌炎小鼠发病中的作用

探讨穿孔素介导的细胞毒效应在病毒性心肌炎发病中的作用。方法４０只小鼠等分为ＣＶＢ３感染组及非染组，所有小鼠于感染后第１０天处死并取其心脏；采用免疫组化技术检测心肌浸润细胞中ＰＦＰ的表达，原位杂交方法检测心肌中ＣＶＢ３ＲＮＡ；半定分析ＰＦＰ抗原及ＣＶＢ３ＲＮＡ水平，并分析ＰＦＰ抗原水平与ＣＶＢ３复制及心肌病变程度的关系。     

Ca15-3在乳腺外Paget病鉴别诊断中的价值

目的：探讨Ｃａ１５３ 在Ｐａｇｅｔ 病鉴别诊断中的价值。方法：对１１ 例阴囊Ｐａｇｅｔ 病回顾性地做Ｃａ１５３、ＥＭＡ、ＣＥＡ和ＨＭＢ４５ 免疫组化染色,并以４ 例Ｂｏｗｅｎ 病和１ 例恶性黑色素瘤做对照。结果：Ｃａ１５３ 、ＥＭＡ 在Ｐａｇｅｔ 病和大、小汗腺及皮脂腺均有较强的表达,４ 例Ｂｏｗｅｎ 病均无Ｃａ１５３ 表达,但其中２ 例有ＥＭＡ 表达。ＣＥＡ 在６ 例（５４．５ ％）Ｐａｇｅｔ 病中有表达。ＨＭＢ４５ 只在恶性黑色素瘤中表达。结论：Ｃａ１５３ 在Ｐａｇｅｔ 细胞的相对特异性表达提示它可作为Ｐａｇｅｔ 病与Ｂｏｗｅｎ 病鉴别诊断的标志物,其对诊断的敏感性与ＥＭＡ 相同,但特异性高于ＥＭＡ。同时还说明Ｐａｇｅｔ 病的发生可能与汗腺有关。     

ras癌基因产物p21在造釉细胞瘤中的表达

利用ｒａｓ癌基因产物ｐ２１单克隆抗体，探索造釉细胞瘤的发生及生物学行为与ｐ２１的关系。结果：１９例造釉细胞瘤中１４例阳性（７３．６％），阳性细胞大部分为鳞状上皮样细胞，提示这群细胞可能为已具备肿瘤性增殖能力的癌前细胞群，但部分原始胚胎样细胞阳性强度高于鳞状上皮样细胞，证实此型细胞对该肿瘤的生物学行为起着重要作用。因此，造釉细胞瘤的发生可能与ｒａｓ基因的过量表达有关。     

真核表达BMP4成熟肽及其对iPS细胞的分化抑制作用(英文)

目的研究BMP4因子在诱导型干细胞(iPS细胞)培养过程中的作用和起作用的相关通路。方法通过RT-PCR的方法从小鼠的胎盘组织中扩增BMP4成熟肽,并且在其N末端连接IgK分泌肽,此融合的片段克隆至pPYCAG载体上。重组质粒pPYCAG-IgK-BMP4转染至293T17细胞中并进行嘌呤霉素的筛选。通过细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定出表达BMP4的阳性克隆。为进一步检测上清中BMP4的生物活性,iPS细胞培养于含BMP4因子的细胞培养上清和LIF因子中,连续培养3代,并进一步观察细胞表型、三胚层细胞的分化潜能和多潜能相关基因的表达水平。结果 Smad1被分泌至上清中的BMP4磷酸化。当培养基中含BMP4同时加入LIF因子后,可以有效抑制iPS细胞分化。在此种方法培养3代后,不仅iPS细胞的表型可以有效维持,iPS细胞中多潜能相关的基因表达水平也未受到影响,同时这些iPS细胞仍具有向三个胚层分化的能力。结论 BMP4可高效表达在真核细胞中,有效地使培养iPS细胞保持其多向分化潜能。     

BMP2诱导C3H10T1／2细胞成软骨分化的分子机制研究

目的：探讨骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1／2向成软骨分化的可能分子机制。方法：20μg／mLBMP2诱导C3H10TI／2细胞0,4h,1,3,6,10,13,15d后,RT—PCR检测BMP信号通路中关键分子BMPRI,BMPRII,Smadl／5／8的表达,Westernblot检测smad蛋白及MAPK信号通路中p38磷酸化水平变化,QRT—PCR检测成软骨标志基因aggrecan,Col2a1以及成软骨相关转录因子FGFR3,Sox9表达水平,同时用Alcine Blue染色,观测C3H10T1／2细胞成软骨分化情况。结果：经BMP2诱导后,C3H10T1／2细胞表现出成软骨分化,smad蛋白及p38磷酸化水平有所上升,同时成软骨标志基因col2a1以及成软骨相关转录因子FGFR3,Sox9表达水平都有增加。与未诱导组相比,Col2a1,FGFR3,Sox9在3d的表达与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）,FGFR3,Sox9在6d的表达与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：在一定培养条件下,BMP2具有诱导C3H10T1／2细胞成软骨分化能力。     

骨形态发生蛋白激活自身肌肉间质细胞拯救骨髓衰竭

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)激活自身肌肉间质细胞以拯救骨髓造血衰竭的作用。方法采用5-氟脲嘧啶与白消安合用诱导大鼠致死性再生障碍性贫血模型,于诱导再障前3d肌肉内植入重组人-BMP-2(rh-BMP-2),并以肌肉内植入琼脂为对照。观察血象、病理形态等变化以及两组再障大鼠的死亡率。同时,给正常小鼠大腿肌肉内植入rh-BMP-2,动态观察植入后局部的形态变化、形成骨及骨髓的形态特点,脾集落形成单位以及基质细胞干细胞生长因子(SCF)的表达。结果小鼠在BMP肌肉内植入1周内,在BMP周围有大量间质细胞增殖,随后形成骨及骨髓,其骨髓基质细胞的SCF表达明显高于自体骨髓;BMP植入组的再障大鼠,不仅血象与对照相比有明显改善,而且死亡率也明显下降,有56.3%大鼠存活超过3个月,其血象完全恢复正常,骨髓和脾脏的组织形态学改变也恢复正常。对照大鼠除1只存活超过3个月外(占4.3%),其余均死于急性再生障碍性贫血。结论BMP肌肉内植入可拯救骨髓造血衰竭,其机制可能与BMP诱导成年自体肌肉内存在的干细胞向造血分化有关;本研究结果为应用成体自身干细胞进行细胞治疗提供了新的途径。     

成釉细胞瘤组织中釉原蛋白基因的表达

目的 :研究釉原蛋白基因在良恶性成釉细胞瘤中的表达 ,为判断成釉细胞瘤细胞分化程度寻找有效指标。方法 :收集存档的良恶性成釉细胞瘤标本 72例 ,其中良性 5 5例 (包括滤泡型 1 8例 ,丛状型 2 0例 ,棘皮瘤型 1 1例和颗粒细胞型 6例 ) ,恶性 1 7例 ,用原位杂交方法检测釉原蛋白基因在肿瘤组织中的表达 ,以 1 2例牙胚标本作阳性对照。结果 :釉原蛋白mRNA阳性表达位于肿瘤性上皮细胞胞浆内 ,5 5例良性肿瘤中 ,4 2例呈阳性表达(76 .4 % ) ,各组织学类型间阳性表达率差异无统计学意义 (P >0 .0 5 ) ,恶性 1 7例有 2例呈阳性表达 (1 1 .8% ) ,其阳性表达率显著低于良性成釉细胞瘤 (P <0 .0 1 )。结论 :釉原蛋白基因可以作为判断成釉细胞瘤细胞分化程度的一个特异性指标。     

Genome-wide study reveals an important role of spontaneous autoimmunity, cardiomyocyte differentiation defect and anti-angiogenic activities in gender-specific gene expression in Keshan disease

Background Keshan disease （KD） is an endemic cardiomyopathy in China.The etiology of KD is still under debate and there is no effective approach to preventing and curing this disease.Young women of child-bearing age are the most frequent victims in rural areas.The aim of this study was to determine the differences between molecular pathogenic mechanisms in male and female KD sufferers.Methods We extracted RNA from the peripheral blood mononuclear cells of KD patients （12 women and 4 men） and controls （12 women and 4 men）.Then the isolated RNA was amplified,labeled and hybridized to Agilent human 4×44k whole genome microarrays.Gene expression was examined using oligonucleotide microarray analysis.A quantitative polymerase chain reaction assay was also performed to validate our microarray results.Results Among the genes differentially expressed in female KD patients we identified：HLA-DOA,HLA-DRA,and HLA-DQA1 associated with spontaneous autoimmunity; BMP5 and BMP7,involved in cardiomyocyte differentiation defect; and ADAMTS 8,CCL23,and TNFSF15,implicated in anti-angiogenic activities.These genes are involved in the canonical pathways and networks recognized for the female KD sufferers and might be related to the pathogenic mechanism of KD.Conclusion Our results might help to explain the higher susceptibility of women to this disease.     

骨形态形成蛋白和纤维蛋白粘合剂复合物修复骨缺损的放射性核素骨显像研究

在家兔桡骨中段造成１５ｍｍ骨缺损，分别植入骨形态形成蛋白和纤维蛋白粘合剂及二者复合物，并设空白对照。术后第二、四、八周分别行Ｘ线及核素骨显像检查，发现复合物和骨形态形成蛋白组缺损均骨性愈合，纤维蛋白粘合剂和空白组则形成骨不连，两周时含Ｆ５组缺损区血流量大于其它组。定量分析表明，复合物组缺损区新骨量大于骨形态形成蛋白组（Ｐ＜０．０５），说明ＦＳ与ＢＭＰ复合后可增强ＢＭＰ修复骨缺损的能力，骨显像检查可定量观察修复过程中缺损区血流量及成骨活动。     

小鼠成牙关键调控基因的筛选与功能验证实验研究

  目的  筛选小鼠成牙关键基因,并验证关键基因对羊膜上皮细胞（WISH）成牙诱导分化的能力。  方法  通过免疫组化染色、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测骨形成蛋白4（BMP4）、成纤维细胞生长因子8（FGF8）、音猬因子（SHH）、淋巴增强因子（LEF1）4种分子蛋白和基因在小鼠早期牙胚发育过程〔小鼠胚胎发育第10.5天(E10.5)、E11.5、E14.5〕中的时空差异化表达,筛选可能的成牙关键基因;非牙源性上皮WISH成骨诱导培养3周,采用茜素红（ALZ）染色与RT-qPCR检测碱性磷酸酶（ALP）观察骨向分化能力;通过胚层重组实验进行组织重组,将BMP4蛋白加入重组组织块,并移植于小鼠肾被膜下,观察验证关键基因的蛋白能否诱导非牙源性上皮成牙分化。  结果  免疫组化染色和RT-qPCR结果证实E10.5胎鼠BMP4蛋白和基因在第一、第二腮弓上皮存在差异性表达,且从E10.5~E14.5其表达与成牙能力从上皮向间充质的转移一致;FGF8蛋白和基因虽在第一、第二腮弓上皮存在差异性表达,但其表达与成牙能力的转移不一致;LEF1、SHH蛋白和基因在第一、二腮弓上皮不存在差异表达,且与成牙能力的转移不一致,因此,筛选出BMP4基因为可能的成牙关键基因。WISH成骨诱导3周,ALZ染色阳性,并形成钙结节,RT-qPCR检测ALP mRNA表达升高;胚层重组实验结果显示,加入外源性的BMP4蛋白可使第二腮弓间充质分别与第二腮弓上皮及WISH均有牙齿样结构形成。  结论  BMP4、FGF8、SHH、LEF1的蛋白和基因在小鼠牙胚早期发育过程中呈时空特异性表达;BMP4的蛋白和基因在第一、二腮弓上皮差异表达,且其蛋白可使与第二腮弓间充质重组的非牙源性上皮获得成牙能力。BMP4为可能的成牙关键基因。     

骨形态发生蛋白诱导髓外造血的实验研究

目的:探讨骨形态发生蛋白(BMP)诱导髓外造血以拯救骨髓造血衰竭的作用。方法:采用60Co-γ+氯霉素(CH)+环磷酰胺(CY)的方法诱导小鼠致死性再生障碍性贫血模型,实验组于诱导再障前6d肌肉内植入重组人-BMP-4(rh-BMP-4),对照组小鼠肌肉内植入琼脂。观察血象、病理形态等变化以及两组再障小鼠的死亡率。同时,给正常小鼠大腿肌肉内植入rh-BMP-4,动态观察植入后局部的形态变化、形成骨及骨髓的形态特点,脾集落形成单位(CFU-S)以及基质细胞干细胞生长因子(SCF)的表达。结果:正常小鼠在BMP肌肉内植入1周内,在BMP周围有大量间质细胞增殖,2周后才出现软骨化骨和骨小结形成,其骨髓基质细胞的SCF表达明显高于自体骨髓;BMP植入组的再障小鼠,不仅血象与对照组相比有明显改善,而且死亡率也明显下降,有46.7%存活超过3个月,其血象完全恢复正常,骨髓和脾脏的组织形态学改变也恢复正常。对照小鼠除1只存活超过3个月外(占6.7%),其余均死于急性再生障碍性贫血。结论:肌肉内植入BMP-4可诱导髓外造血,其机制可能与BMP-4诱导成年自体肌肉内存在的干细胞向造血分化有关,这一结果将为干细胞治疗提供了一条新的思路。     

表达谱基因芯片筛选前体脂肪细胞分化相关基因的研究

目的:运用基因芯片技术研究前体脂肪细胞分化相关基因表达谱的变化。方法:体外培养前体脂肪细胞(3T3-L1),诱导分化为成熟脂肪细胞。提取脂肪细胞总RNA,纯化mRNA后逆转录制备目标序列,应用含有45038种小鼠基因cDNA的表达谱芯片Mouse430_2进行差异表达谱分析。结果:在前体脂肪细胞分化的基因表达谱中差异表达基因共有640条,其中表达水平显著变化的有38条(表达水平改变5倍以上),上调基因24条,下调基因14条。差异表达基因中有细胞凋亡相关基因、原癌基因和抑癌基因、细胞信号和传递蛋白基因等多种基因。这些基因可能与脂肪细胞分化相关疾病的发病机制有关。结论:采用基因芯片技术筛选脂肪细胞分化相关基因,可能为脂肪细胞分化相关疾病病因和发病机制的研究提供新思路。