结核分枝杆菌聚合酶链反应检测技术进展

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Myco-bacterium tuberculosis,MTB)感染引起的一种传染性疾病。根据最新的《世卫组织全球结核控制报告》,2009年约有940万结核新发病例,170万人因结核病而死亡[1]。早期诊断并及时治疗是预防TB发病率和死亡率的关键。目前,TB实验室诊断方法以痰涂片检查为主,价廉且快速,但缺乏特异性和敏感性。传统的微生物培养法虽然仍被视为诊断TB的金标准,但费时(6周～8周),自动化或半自动化的液体培养体系也需要14 d左右,然     

Taqman聚合酶链反应检测支气管灌洗液中结核分枝杆菌DNA的临床应用

肺结核病是一种危害性十分严重的传染性疾病,全球约有1／3人口感染结核分枝杆菌,每年约有800万～1000万新发病例及300万人死于该病。因此,尽早发现新发病例,明确诊断非常重要。由于结核分枝杆菌体外生长缓慢、培养要求高,临床上一般难以用细菌培养的方法来确诊结核分枝杆菌感染。痰液涂片抗酸检查特异检出率均不高,存在较高的漏检率。基于Taqman技术的荧光探针聚合酶链反应（FQ—PCR）检测结核分枝杆菌DNA具有高灵敏性、高特异性等优点。同时克服了常规PCR容易受污染产生假阳性的缺点,是一种理想的检测方法。而采用支气管肺泡灌洗液（BALF）作为检测标本比痰液标本具有更高的阳性检出率,克服了痰液标本留取不规范带来的阳性检出率不高的问题。我们应用该技术检测112例BALF标本中结核分技杆菌DNA,现报告如     

聚合酶链反应鉴定伤寒沙门氏菌

聚合酶链反应鉴定伤寒沙门氏菌北京市卫生防疫站（１０００１３）王劲，张凤琴，任保国我们引入先进的分子生物学技术，以自行设计的寡核苷酸序列作引物，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对伤寒菌进行鉴定，其结果特异、快速、简便。现报告如下。材料和方法：（１）菌株来...     

宁波地区非结核分枝杆菌病原谱的分析

目的了解宁波市非结核分枝杆菌病源谱,掌握宁波市优势非结核分枝杆菌菌群。方法采用胶体金法对713株分枝杆菌临床分离株进行非结核分枝杆菌初步鉴定,然后对其采用hsp65基因测序法作进一步菌种鉴定。结果 713株分枝杆菌经胶体金法初步鉴定有100株为非结核分枝杆菌。进一步菌种鉴定,有5株为结核分枝杆菌复合群,2株鼻疽诺卡菌,其余93株为非结核分枝杆菌,其中胞内分枝杆菌49株(52.7%),堪萨斯分枝杆菌15株(16.1%),戈登分枝杆菌8株(8.6%),鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和马赛分枝杆菌各4株,中间分枝杆菌2株,偶然分枝杆菌、土分枝杆菌、外来分枝杆菌、耻垢分枝杆菌株,M.seoulense、M.thermoresistibile和M.monacense各1株。结论宁波地区优势非结核分枝杆菌群以胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌为主。     

矽肺结核聚合酶链反应-单链构象多态性分析菌种鉴定的研究

矽肺结核诊断困难 ,治疗也较棘手 ,甚至可能合并非结核分支杆菌感染 ,使诊断和治疗更加复杂化。为了进一步了解矽肺结核的病原学情况 ,我们采用Ｂａｃｔｅｃ- 96 0快速培养结合聚合酶链反应—单链构象多态性分析 (ＰＣＲ -ＳＳＣＰ)对 98例痰抗酸染色阳性矽肺结核患者的痰标本进行菌种鉴定。现将结果报告如下。1　材料和方法1·1　标本来源　 98例临床痰标本来自于北京市矿务局医院的住院矽肺结核病患者 ,全部病人痰涂片抗酸染色阳性。1·2　试剂　⑴ 16ＳｒＤＮＡＰＣＲ诊断试剂盒由解放军第30 9医院结核病研究室提供。⑵ 7Ｈ9培养基由美国…     

多聚酶链反应检测骨组织中结核分枝杆菌的临床研究

关于骨关节结核的ＰＣＲ诊断报道甚少。本文介绍用ＰＣＲ技术检测手术取检骨组织４５例，并与病理学诊断和临床诊断进行比较。结核分枝杆菌阳性２１例，阳性率为４６．６％，病理学诊断１０天例骨关节结核，阳性率为２２．２％，临床诊断２０例，ＰＣＲ阳性１６例与临床诊断的符合率为８０．０％。结果提示，ＰＣＲ技术用于骨组织结核分枝杆菌的诊断与临床诊断有较好的符合率，对于骨关节结核早期诊断、鉴别诊断具有特异性敏感性高的     

结核分枝杆菌利福平耐药基因突变的研究

目的评价检测rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐利福平（I肝）耐药性测定中的应用价值。方法采用DNA序列分析法和聚合酶链反应-单链构象多态性（PER—SSCP）法对91株结核分枝杆菌临床分离株（其中药物敏感株35株，耐RFP或含耐RFP耐多药株56株）rpoB基因核心区域的突变情况进行检测。结果以结核分枝杆菌H37RV为对照，所有35株药物敏感株的rpoB基因均无突变，用DNA序列分析方法检测56株耐药株中53株发生突变，敏感性为94．6％（53／56），其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸。PER—SSCP检测56株耐RFP分离株中，52株rpoB基因SSCP图谱异常，其敏感性为92．9％（52／56）。结论DNA序列分析对判断结核分枝杆菌耐利福平非常有价值。PER—SSCP可初步筛选结核分枝杆菌RFP耐药性。     

结核分枝杆菌的优化PCR检测方法的研究

〔目的〕的建立了检测结核分枝杆菌的高灵敏度和高特异性PCR扩增体系。[方法]以国内结核病人常见病原菌-结核分枝杆菌、牛分枝杆菌特异性抗原Pab编码基因上的419bp段作为扩增靶序列,扩增引物序列为5’-ACC、ACC、GAG、CGG、TTC、CCC、TGA-3’、5’-GAT、CTG、CCG、GTC、GTC、CCA、GGT-3’。〔结果〕变性温度选择69℃-70℃。PCR扩增体系的成份经优化,选择引物浓度为0.30μmol/L,dNTP浓度为150μmol/L,MgC12浓度为3.5mmol/L。〔结果〕该体系对11株标准菌株和12株临床分离菌株提纯的染色体进行扩增,其中卡介苗、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌的扩增为阳性,其他分枝杆菌为阴性。〔结论〕以提纯的染色体DNA作模板,该体系可检出5fg结核杆菌染色体DNA,相当于一个结核分枝杆菌。     

台州市非结核分枝杆菌的菌种分布特征和流行状况分析

目的 分析台州市非结核分枝杆菌(NTM)的菌种分布和流行状况,为NTM病防治提供实验室依据。方法 对台州市2018年—2021年收集的1 437株分枝杆菌,先通过抗酸染色和MPB64抗原胶体金试验进行初步鉴定,然后分别用ITS、rpoB和hsp65基因测序方法进行菌种鉴定。结果 1 437株分枝杆菌中236株最终鉴定为NTM,总体分离率为16.4%;2018年—2021年分离率分别为7.0%、15.2%、17.2%、29.6%,呈上升趋势(χ²_趋势=54.90,P<0.05)。236株NTM被鉴定为22个菌种,以鸟分枝杆菌复合群(MAC)为主(72.9%),其中胞内分枝杆菌占57.2%;其次为脓肿分枝杆菌(9.7%)和堪萨斯分枝杆菌(4.2%)。感染者男女比例为1.56:1,主要集中在≥60岁人群。结论 台州地区NTM总体分离率处于较高水平,建议加强本地区NTM病监测并及时对菌种进行鉴定。     

Mg2+浓度在多基因PCR中关系的研究

目的：通过实验介绍游离性Mg^2 在不同浓度情况下对Tag酶活性及MgCl2作为一种盐对多基因PCR的影响过程。方法：利用不同Mg^2 浓度的缓冲液及不含KCl的不同Mg^2 浓度的缓冲液来研究其对多基因PCR的影响。结果：Mg^2 是Tag酶活性所必需的，Mg^2 浓度过低时，Tag酶活性显著下降，无特异条带扩增或特异条带扩增不明显。在Mg^2 浓度高时，Tag酶活性增强，非特异条带扩增。随着Mg^2 浓度的增加，在接近10mmol/L时，扩增条带亮度减弱，非特异扩增条带减少。结论：在无KCl存在，单一Mg^2 影响反应的情况下，随着Mg^2 浓度的过度增加，高浓度的Mg^2 抑制了Tag酶活性，从而减少了产物的数量，在50mmol/L Mg^2 浓度时完全抑制了扩增。     

多重实时定量PCR同时检测人全血中大肠杆菌与白念珠菌基因方法的建立

目的 建立多重实时定量PCR (MRQ-PCR)同时快速检测血中大肠杆菌与白念珠菌DNA的方法,以评估肠屏障损伤可能导致的移位微生物的种类和程度并提供针对性用药的建议.方法 选择大肠杆菌β-右旋半乳糖苷酶基因作为检测大肠杆菌的靶基因设计引物和探针,选择白念珠菌ITS2基因设计引物和探针.采用QIAamp(R) DNA Blood Mini Kit试剂盒提取大肠杆菌与白念珠菌基因组DNA;建立25 μl TaqMan探针MRQ-PCR反应体系;对18份模拟血标本及10份外科发热患者临床标本进行MRQ-PCR检测.结果 引物和探针特异性好,大肠杆菌与白念珠菌标准曲线相关系数分别在0.994～0.999和0.994～0.998,扩增效率分别为0.894～1.022和0.905 ～1.028.标准样品检测限分别为大肠杆菌13.9拷贝/μl和白念珠菌0.8 cfu/μl,两种菌的检测灵敏度分别为100％和99.69％,特异度分别为100％和94.73％,标准品中大肠杆菌与白念珠菌特异基因平均回收率分别为(101.89±5.69)％和(103.74±4.64)％,两种菌基因检测的批内变异系数分别为(13.14±10.27)％和(19.18±8.54)％,批间变异系数分别为(14.35 ±9.34)％和(18.31 ±10.25)％.全血标本中大肠杆菌与白念珠菌特异基因的检出限分别为12 455.2拷贝/ml和800.3 cfu/ml,平均回收率分别为(111.60±11.06)％和(99.96 ±6.16)％,两种菌基因检测的批内变异系数分别为(11.02±5.65)％和(8.14±7.29)％,平均批间变异系数分别为(12.88±7.59)％和(18.62±9.14)％.结论 多重实时定量PCR可以同时快速、灵敏、特异地定量检测人全血标本中大肠杆菌与白念珠菌基因,准确度高、重复性好、节省血标本用量及检测成本、总检测时间缩短,在临床全血标本的真菌与细菌快速鉴别检测、抗微生物药物的针对性应用及疗效评估、肠屏障损伤后果及疗效的评估中有较实用的推广前景.     

巢式聚合酶链反应对霍乱弧菌肠毒素快速检测方法的建立

[目的]　建立霍乱弧菌肠毒素快速检测的检验技术。[方法]　运用巢式聚合酶链反应(NESTED-PCR)检测霍乱弧菌肠毒素基因CTX。[结果]　检测霍乱弧菌特异性强,检测下限达4cfu/mL(100cfu/mL级水平)。[结论]　NESTED-PCR检定霍乱弧菌简便、快速、敏感度高且准确性好。     

PCR方法快速检测食品中的金黄色葡萄球菌

目的建立聚合酶链反应(PCR)方法快速检测牛奶、冰淇淋及肉中的金黄色葡萄球菌(金葡菌)。方法针对金葡菌耐热核酸酶基因(nuc)、纤维蛋白原结合蛋白基因(ClfA)设计并合成2对引物进行PCR扩增,特异的检测金葡菌,并对52株金葡菌和31株非金葡菌进行扩增,验证方法的特异性。在牛奶、冰淇淋及肉中人工污染不同菌量,增菌培养,在不同时间段提取DNA进行PCR扩增,确定该方法在食品中的检出限。结果nuc、ClfA两对引物对金葡菌的检出均有很好的特异性,在3种食品中的检出限均为10cfu/g(ml),全部检测可在24h完成。结论建立了适用于牛奶、冰淇淋及肉中的金葡菌检测的快速、灵敏、特异的PCR方法。     

应用Taq Man荧光定量聚合酶链反应技术检测鼠疫耶尔森菌

目的发展一种快速、敏感、特异的检测鼠疫耶尔森菌方法。方法应用荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术，针对pMT1质粒上的caf1基因，pPCP1质粒上的pla基因，染色体上的与色素沉着相关的hms基因和侵袭素inv基因设计TaqMan引物探针，进行荧光定量PCR检验，评价方法的特异性、敏感性；构造并应用上述引物探针的外标对照定量；构造pla的内标对照，采用多重荧光定量PCR（FAM，VIC荧光检测），发现假阴性；采用UDG抗污染、ROX参照荧光染料矫正背景噪音，提高检验能力；检验模拟鼠疫耶尔森菌强毒株和EV菌感染的动物脾脏器样本，评价该法在实际工作的应用。结果设计的引物、探针特异性良好，pla、f1、hms指标的敏感性分别是最低检出10拷贝、1拷贝、1拷贝。结论该方法能快速、灵敏、特异检出鼠疫耶尔森菌，对鼠疫监测、预防生物恐怖等方面具有重要意义。     

Clinical epidemiological applicability of real-time polymerase chain reaction for COVID-19

ObjectivesReal-time polymerase chain reaction is currently used as a confirmatory test for coronavirus disease 2019 (COVID-19). The test results are interpreted as positive, negative, or inconclusive, and are used only for a qualitative classification of patients. However, the test results can be quantitated using threshold count (Ct) values to determine the amount of virus present in the sample. Therefore, this study investigated the diagnostic usefulness of Ct results through various quantitative analyzes, along with an analysis of clinical and epidemiological characteristics.Methods Clinical and epidemiological data from 4,642 COVID-19 patients in April 2021 were analyzed, including the Ct values of the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), envelope (E), and nucleocapsid (N) genes. Clinical and epidemiological data (sex, age, underlying diseases, and early symptoms) were collected through a structured questionnaire. A correlation analysis was used to examine the relationships between variables.Results All 3 genes showed statistically significant relationships with symptoms and severity levels. The Ct values of the RdRp gene decreased as the severity of the patients increased. Moreover, statistical significance was observed for the presence of underlying diseases and dyspnea.Conclusion Ct values were found to be related to patients’ clinical and epidemiological characteristics. In particular, since these factors are closely related to symptoms and severity, Ct values can be used as primary data for predicting patients’ disease prognosis despite the limitations of this method. Conducting follow-up studies to validate this approach might enable using the data from this study to establish policies for preventing COVID-19 infection and spread.     

甲醇法制备的血模板DNA用于聚合酶链反应

建立从外周血标本制备用于聚合酶链反应的 DNA模板的甲醇法 ,并与 A/ B液法、Qiagen纯化柱法和 ISOCODE法进行比较。甲醇制备纸血片 DNA法为 :取直径为 3mm的血环 ,经甲醇固定后加去离子水 ,煮沸后离心 ,上清即为 DNA储备液。甲醇法与其它 3种制备模板 DNA的方法比较 ,具有提取的模板 DNA质量较高 ,血标本容易获得、保存且成本低 ,制备效率高 ,而且实验方法简单易行等诸多优点。     

单流向一体化临床定量PCR实验室的优化设计与设备配置

定量PCR技术以其高特异性、高灵敏性以及高自动化等特点在临床病原微生物诊断、部分遗传性疾病诊断和癌症辅助诊断等方面得以广泛应用。设计和建立符合相关标准的临床定量PCR实验室不但是相关基因扩增、检验的需要．而且是保障生物安全和保持检测结果准确性的需要。文中介绍了优化设计的单流向、一体化临床定量PCR实验室的结构布局、内部设施以及温度、噪音等人体适应性指标。     

PCR快速检测肠毒素大肠杆菌方法的研究

目的利用PCR技术,尝试建立特异性引物PCR快速检测肠毒素大肠杆菌的方法。方法设计肠毒素大肠杆菌LT基因的特异性引物,优化PCR反应条件,对16种样品进行细菌通用引物和特异性引物的PCR扩增,从而鉴定肠毒素大肠杆菌。结果所有样品都出现细菌通用引物的扩增条带,而只有肠毒素大肠杆菌有特异性引物的PCR扩增产物,结果与实际完全一致。结论该方法具有简单、迅速、准确的特点,可应用于对肠毒素大肠杆菌的鉴定。     

荚膜多糖基因聚合酶链反应在肺炎链球菌临床诊断中的应用

目的 评价荚膜多糖基因(capsular polysaccharide synthesis locus,CPS)聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)在肺炎链球菌病例临床诊断中的应用价值。 方法 收集保定市各医院诊断为肺炎病例的临床标本,其中痰液1 850份、血液1 850份、脑脊液245份,分别进行cpsA基因PCR检测和传统细菌培养,比较两种方法对肺炎链球菌的检测结果。同时根据cps基因血清特异性区域设计引物,采用多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction,MP-PCR)对210株肺炎链球菌分型,并与荚膜肿胀试验结果进行比较分析。 结果 cpsA基因PCR检测法在3945份临床标本中检出肺炎链球菌600例,检出率为15.21%,高于细菌培养法。以细菌培养法为参考标准,cpsA基因PCR检测肺炎链球菌的灵敏度为97.67%,特异度为89.54%。且在两种方法中痰液中肺炎链球菌检出率均高于血液与脑脊液,差异具有统计学意义(P<0.05)。210株肺炎链球菌中,198株被MP-PCR法分出血清型,分型率为94.29%,高于荚膜肿胀试验。两种方法鉴定血清型别一致率达80.81%。其中有7株被荚膜肿胀试验鉴定为其它型别:63株多重PCR鉴定为19F的菌株中,有5株被荚膜肿胀试验鉴定为6A;35株多重PCR鉴定为19A菌株中,有1株被荚膜肿胀试验鉴定为19F;8株多重PCR鉴定为14的菌株中,有1株被荚膜肿胀试验鉴定为19A。 结论 cpsA基因PCR检测和cps基因血清特异性区域的MP-PCR检测在肺炎链球菌检出和分型上优于传统细菌培养法和荚膜肿胀试验,可用于肺炎链球菌的临床诊断,且标本以痰液为宜。