雪莲强筋壮骨方对膝骨关节炎软骨细胞p38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的影响

目的:探讨雪莲强筋壮骨方对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)软骨细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号传导通路的影响。方法:将24只3月龄雄性新西兰大白兔随机分为空白组、模型组、p38阻断剂组及含药血清组,每组6只。除空白组外,其余各组均采用改良Hulth法行KOA造模。造模成功后含药血清组以雪莲强筋壮骨方水煎剂灌胃(10 g·kg~(-1)),其余各组均以等量生理盐水灌胃,每天2次,连续干预7 d后静脉采血,分别制成10%含药血清和10%空白血清的DMEM培养液保存备用。血清制备完成后处死动物,分离膝关节软骨进行软骨细胞培养。空白组和模型组以空白血清进行干预,p38阻断剂组以空白血清和SB203580进行干预,含药血清组以含药血清进行干预。血清干预结束后,分别采用免疫荧光技术和蛋白免疫印迹法检测各组软骨细胞磷酸化p38MAPK水平。结果:免疫荧光检测结果显示,模型组磷酸化p38MAPK表达呈强阳性,p38阻断剂组和含药血清组次之,空白组最弱。蛋白免疫印迹检测结果显示,空白组磷酸化p38MAPK表达最弱,模型组磷酸化p38MAPK表达最强,p38阻断剂组和含药血清组磷酸化p38MAPK表达水平相当,介于空白组和模型组之间。经扫描定量检测,空白组、模型组、p38阻断剂组和含药血清组条带的光密度值分别为0.31±0.06、0.83±0.11、0.58±0.45、0.55±0.56,差异有统计学意义(F=3.872,P=0.034)。空白组的光密度值小于模型组、p38阻断剂组及含药血清组(P=0.007,P=0.031,P=0.038);模型组的光密度值大于p38阻断剂组和含药血清组(P=0.038,P=0.028);p38阻断剂组和含药血清组的光密度值比较,差异无统计学意义(P=0.066)。结论:雪莲强筋壮骨方能阻滞KOA软骨细胞p38MAPK信号传导通路,其效果与p38MAPK阻断剂SB203580相当。     

牛膝对人软骨细胞体外增殖的影响

目的:探讨牛膝对人关节软骨细胞体外增殖的影响。方法:膝骨关节炎患者口服不同浓度牛膝醇提物,收集不同浓度牛膝含药血清,取膝骨关节炎行关节置换手术患者的关节软骨,剪碎后,采用Ⅱ型胶原酶溶解消化软骨细胞,甲苯胺蓝染色确定软骨细胞的存在。将第3代软骨细胞分别接种于4组:空白对照组、含药血清高剂量组、含药血清中剂量组、含药血清低剂量组。荧光倒置相差显微镜观察软骨细胞形态和结构,采用CCK-8法检测软骨细胞增殖情况,RT-PCR法分析软骨细胞基因Ⅱ型胶原mRNA表达水平。结果:牛膝含药血清高、中剂量组细胞增殖率高于对照组(P0.05),含药血清低剂量组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05);RT-PCR法检测结果显示牛膝含药血清高、中、低剂量组均高于空白对照组(P0.05)。结论:牛膝含药血清能促进人软骨细胞体外培养增殖和Ⅱ型胶原的合成。     

牛膝含药血清对骨关节炎软骨细胞P38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路的影响

目的:探讨牛膝含药血清对骨关节炎软骨细胞P38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路的影响.方法:将20只雄性新西兰大白兔随机分为空白对照组、模型组、P38阻断剂组及含药血清组,每组5只.分组后含药血清组大白兔以牛膝水煎剂灌胃(2.5 g· kg-1),其余各组以等量生理盐水灌胃,每天2次,共3d.3d后静脉采血,分别配成10％含药血清和10％空白血清的DMEM培养液保存备用.除空白对照组外,其余各组大白兔均采用Hulth法行兔膝骨关节炎造模,空白对照组行假手术.造模成功后处死实验兔分离兔膝关节软骨进行软骨细胞培养,对空白对照组、模型组的第3代软骨细胞以空白血清进行干预,P38阻断剂组以SB203580进行干预,含药血清组以牛膝含药血清进行干预.血清干预结束后,分别采用免疫荧光技术和Western Blot技术检测各组软骨细胞磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶及Ⅱ型胶原蛋白含量.结果:①免疫荧光检测结果.各组细胞均有磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶阳性表达,其中模型组呈强阳性表达,P38阻断剂组及含药血清组略弱,空白对照组最弱;各组细胞均有Ⅱ型胶原蛋白阳性表达,其中空白对照组呈强阳性表达,P38阻断剂组及含药血清组略弱,模型组最弱.②Western Blot检测结果.各组磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶含量比较,差异有统计学意义(F =3.872,P=0.038).进一步两两比较,空白对照组(0.463±0.007)小于模型组(0.856 ±0.007)、P38阻断剂组(0.576±0.005)及含药血清组(0.508±0.004),差异有统计学意义(P =0.008;P=0.036;P=0.042);模型组大于P38阻断剂组和含药血清组(P =0.025;P=0.019);P38阻断剂组与含药血清组比较,差异无统计学意义(P=0.058).各组细胞Ⅱ型胶原蛋白含量比较,差异有统计学意义(F=3.963,P=0.034).进一步两两比较,空白对照组(0.884±0.007)大于模型组(0.434±0.007)、P38阻断剂组(0.616±0.003)及含药血清组(0.565±0.008),差异有统计学意义(P =0.007;P =0.031;P =0.038);模型组小于P38阻断剂组和含药血清组(P =0.035;P=0.028);P38阻断剂组与含药血清组比较,差异无统计学意义(P =0.066).结论:牛膝含药血清能阻断骨关节炎软骨细胞P38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路,进而保护软骨细胞,其效果与SB203580相当.     

杞精明目汤含药血清对结膜松弛症MAPK信号通路的影响

目的探讨杞精明目汤含药血清对结膜松弛症(CCh)成纤维细胞表达丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的影响及其作用机制。方法体外培养结膜松弛症结膜成纤维细胞并鉴定,分为CCh对照组、CCh+20%含药血清组(含药血清组)、CCh+20%无药血清组(无药血清组),予20%的含药或无药血清干预48 h。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)及其磷酸化水平的光密度值,Western Blot检测p38 MAPK、JNK、ERK蛋白及其磷酸化水平,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测p38 MAPK、JNK、ERK的m RNA表达,并行统计学分析。结果 ELISA结果显示:含药血清组较CCh对照组p38 MAPK、p-p38 MAPK光密度值明显降低(P0.05),而无药血清组与CCh对照组差异无统计学意义(P0.05)。含药血清组较CCh对照组JNK光密度值降低(P0.05),而无药血清组与CCh对照组差异无统计学意义(P0.05);含药血清组、无药血清组较CCh对照组p-JNK光密度值下降(P0.05)。含药血清组较CCh对照组ERK、p-ERK光密度值下降,差异有统计学意义(P0.05);而无药血清组与CCh对照组差异均无统计学意义(P0.05)。Western Blot结果显示:含药血清组、无药血清组较CCh对照组p-p38MAPK蛋白表达量明显下降(P0.05),且20%含药血清的p38 MAPK蛋白磷酸化水平下调更为明显。含药血清组、无药血清组与CCh对照组JNK、p-JNK蛋白表达量差异无统计学意义(P0.05)。含药血清组、无药血清组与CCh对照组ERK蛋白表达量差异无统计学意义(P0.05);含药血清组、无药血清组较CCh对照组p-ERK蛋白表达量均明显降低(P0.05),其中含药血清组的ERK蛋白磷酸化水平下调更为明显。RT-PCR结果显示:无药血清组和含药血清组较CCh对照组p38 MAPK、JNK、ERK的m RNA表达水平均显著下降,差异有统计学意义(P0.05),且20%含药血清组p38 MAPK、JNK、ERK m RNA水平下调更为明显。结论杞精明目汤含药血清可下调结膜松弛症成纤维细胞MAPK信号通路相关蛋白和基因的表达,其对p38 MAPK、ERK蛋白的磷酸化水平和基因表达的抑制,可能是该方疗效机制的关键。     

高静水压下益气活血汤通过p38MAPK信号通路对兔椎体终板软骨细胞的调控作用

目的观察益气活血汤含药血清在高静水压下对兔终板软骨细胞p38MAPK信号通路的调控作用,探讨益气活血汤治疗椎间盘退行性病变的可能作用机制。方法选用3月龄新西兰白兔制备益气活血汤含药血清,体外分离培养第3代兔椎体终板软骨细胞,建立体外高静水压加载干预模型,确定益气活血汤含药血清最佳干预条件。将体外培养的第3代终板软骨细胞随机分为空白组、模型组及含药血清组,空白组无任何干预,其余2组分别施加1 MPa静水压干预24 h后收集终板软骨细胞,运用Western Blot法检测各组终板软骨细胞p38、磷酸化p38蛋白表达情况。结果持续高静水压干预下,1μg/μL含药血清促终板软骨细胞增殖作用最明显。各组终板软骨细胞p38蛋白表达量比较差异无统计学意义;模型组磷酸化p38蛋白表达量显著高于空白组,而含药血清组磷酸化p38蛋白表达量显著低于模型组(P0.05)。结论益气活血汤可以提高持续高静水压下终板软骨细胞增殖率,抑制软骨细胞凋亡,可能与其降低磷酸化p38蛋白表达水平,抑制p38MAPK信号通路的激活有关,推测益气活血汤可能通过调控p38MAPK信号通路发挥延缓椎间盘退行性病变的作用。     

牛膝总皂苷含药血清对兔膝软骨细胞增殖与凋亡的实验研究

目的观察牛膝总皂苷(TSA)含药血清对兔膝软骨细胞增殖与凋亡的影响。方法建立离体软骨细胞培养体系,MTT法观察TSA含药血清对软骨细胞增殖的影响,RT-PCR法测定TGF-β1mRNA的表达;流式细胞分析法观察TSA含药血清对软骨细胞的凋亡,检测软骨细胞中Caspase-3活性。结果 TSA含药血清培养软骨细胞72h后,TSA高剂量组与硫酸氨基葡萄糖组能显著提高软骨细胞的增殖;TSA高、TSA中剂量组与硫酸氨基葡萄糖组能显著提高TGF-β1mRNA的表达;TSA高、中剂量组和硫酸氨基葡萄糖组在作用48h后,能够显著降低软骨细胞的凋亡数量,呈一定的量效关系;TSA高、中剂量组和硫酸氨基葡萄糖组在作用24h后,能够显著降低caspase-3在软骨细胞中的表达,随着干预时间的延长,低剂量组也出现抑制作用。结论 TSA含药血清对软骨细胞有促进增殖和抑制凋亡的作用,且呈浓度和时间依赖性,尤其是高剂量的TSA含药血清效果明显。     

基于Caspase-3/PARP通路探究龟鹿二仙胶及拆方对IL-1β诱导的退变软骨细胞凋亡及细胞外基质的影响

目的 基于半胱氨酸蛋白酶3/多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Caspase-3/PARP)通路探究龟鹿二仙胶及拆方对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的退变软骨细胞凋亡及细胞外基质(ECM)的影响。方法 采用SD大鼠制备空白血清、龟鹿二仙胶含药血清、龟甲胶含药血清及鹿角胶含药血清,采用酶消法体外培养C57BL/6小鼠软骨细胞。将软骨细胞分为5组,空白组加入空白血清培养,模型组加入IL-1β和空白血清培养,龟鹿组加入IL-1β和龟鹿二仙胶含药血清培养,龟板组加入IL-1β和龟甲胶含药血清培养,鹿角组加入IL-1β和鹿角胶含药血清培养,干预24 h后,采用CCK-8法检测软骨细胞活性,采用TUNEL法检测软骨细胞凋亡情况,采用免疫荧光染色法检测Caspase-3、PARP-1表达情况,分别采用Western blot和qRT-PCR法检测细胞中Caspase-3、PARP-1、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)蛋白及mRNA表达情况。结果 与空白组比较,模型组软骨细胞活性明显降低(P<0.05),软骨细胞凋亡率明显升高(P<0.05);细胞中Cas...     

健骨方干预大鼠膝骨关节炎p38MAPK信号传导通路的实验研究

目的观察健骨方对大鼠骨关节炎软骨细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)表达的影响。方法选用SD大鼠40只,采用Hulth法制备大鼠膝骨关节炎模型,以健骨方灌胃为干预治疗手段,Western blotting测定各组p38 MAPK表达水平。结果Western blotting显示p38 MAPK在对照组持续表达,而健骨方组的表达明显下降(P0.05)。结论健骨方可有效影响p38 MAPK的表达。     

牛膝总皂苷含药关节液对骨关节炎体外软骨细胞增殖及凋亡的实验研究

目的:观察牛膝总皂苷(TSA)含药关节液对兔骨关节炎(OA)体外软骨细胞增殖及凋亡的影响。方法:将30只兔分为TSA组、硫酸氨基葡萄糖组、空白对照组,每组10只,分别予TSA、硫酸氨基葡萄糖、蒸馏水灌胃7d后制备含药关节液;进行OA造模,鉴定OA造模成功后体外提取关节软骨细胞进行培养、鉴定。将P3代软骨细胞分为TSA组、硫酸氨基葡萄糖组、空白对照组、经典软骨增殖组,分别用10%TSA含药关节液+10%FBS+DMEM∶F12(1∶1)培养液、10%硫酸氨基葡萄糖含药关节液+10%FBS+DMEM∶F12(1∶1)培养液、10%空白含药关节液+10%FBS+DMEM∶F12(1∶1)培养液、10%FBS+DMEM∶F12(1∶1)培养液进行培养,对培养后的软骨细胞进行细胞形态学观察,用CCK-8法检测细胞增殖情况,免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白表达,Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:OA软骨细胞体外分离成功,经甲苯胺蓝染色鉴定细胞为软骨细胞来源;CCK-8法观察四组细胞生长曲线,绘制的生长曲线符合Logistic生长曲线规律,TSA组在第2～7天细胞增殖速度明显高于其它3组,差异有统计学意义(P0.05);连续培养7d后,与空白对照组比较,TSA组Ⅱ型胶原蛋白表达显著,差异有统计学意义(P0.01),硫酸氨基葡萄糖组、经典软骨增殖组Ⅱ型胶原蛋白表达明显,差异有统计学意义(P0.05);流式细胞仪检测显示,与空白对照组(总凋亡率为17.61%±1.19%)比较,经典软骨增殖组(总凋亡率为16.50%±1.42%)细胞凋亡减少不明显,差异无统计学意义(P0.05)。与空白对照组比较,TSA组(总凋亡率为5.15%±1.96%)、硫酸氨基葡萄糖组(总凋亡率为7.76%±1.72%)细胞凋亡减少明显,差异有统计学意义(P0.01)。结论:TSA含药关节液能有效提高细胞活力、促进软骨细胞增殖、提高Ⅱ型胶原蛋白表达,且降低软骨细胞早期、晚期凋亡率,对证实TSA是牛膝作用于软骨细胞的主要物质基础具有重要意义。     

补肾活血复方含药血清对大鼠成骨细胞磷酸化GSK-3β、p38MAPK及ERK1/2蛋白的影响

目的:观察补肾活血复方含药血清对大鼠成骨细胞磷酸化糖原合成激酶3β(GSK-3β)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白的作用。方法:3月龄SD雌性大鼠灌胃制备空白血清和含药血清,并分离培养1日龄新生鼠颅骨成骨细胞。实验分为空白血清组和含药血清组,分别采用MTT、ELISA、Western-blot等方法检测两组成骨细胞的增殖、ALP和BGP的分泌及磷酸化GSK-3β、p38 MAPK和ERK1/2蛋白的变化。结果:与空白血清组相比,含药血清组可明显促进成骨细胞的增殖、ALP和BGP的分泌,并促进胞内磷酸化p38 MAPK和ERK1/2蛋白的表达,对磷酸化GSK-3β蛋白的表达未见明显影响。结论:补肾活血复方含药血清可促进大鼠成骨细胞的增殖和分化,提高p38 MAPK和ERK1/2蛋白磷酸化水平。     

基于P38 MAPK信号通路探讨扶正利湿抗癌方含药血清对前列腺癌LNCaP细胞增殖及凋亡的影响

目的：研究扶正利湿抗癌方含药血清对LNCaP细胞增殖、凋亡及p38 MAPK通路的作用。方法：应用CCK-8法观察扶正利湿抗癌方含药血清对LNCaP细胞的增殖抑制作用,以流式细胞仪分析扶正利湿抗癌方含药血清对LNCaP细胞凋亡的影响,Western Blot法检测LNCaP细胞p38 MAPK、p-p38MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53等蛋白的表达。结果：扶正利湿抗癌方含药血清能够以剂量依赖性地抑制LNCaP细胞增殖并诱导其凋亡,上调p-p38 MAPK、Bax、Caspase-3及p53蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达水平。结论：扶正利湿抗癌方含药血清可能通过激活p38 MAPK信号传导通路抑制LNCaP细胞增殖并促进其凋亡。     

壮骨健膝方含药血清中药物成分骨碎补柚皮苷对IL-1β诱导兔退变软骨细胞“caveolin-p38MAPK”信号通路的影响

目的观察壮骨健膝方含药血清中药物成分骨碎补柚皮苷(简称柚皮苷)对IL-1β诱导退变软骨细胞中"caveolin-p38MAPK"通路相关信号因子小窝蛋白-1(caveolin-1)、磷酸化p38(p-p38)、磷酸化核转录因子-2(p-ATF-2)、IL-1β及TNF-α等的影响,进一步探讨该方保护关节软骨的机制。方法 (1)通过高效液相-飞行时间质谱联用(HPLC-TOF/MS)技术分析并获得壮骨健膝方含药血清中的原组方药物成分柚皮苷;(2)取4周龄新西兰兔双侧膝关节软骨,建立兔关节软骨细胞体外培养体系,取第二代软骨细胞用于后续实验。MTT法检测柚皮苷对软骨细胞增殖的影响;免疫组化方法检测柚皮苷对IL-1β诱导后的软骨细胞中Ⅱ型胶原表达的影响;Western blot法检测柚皮苷对IL-1β诱导后软骨细胞中caveolin-1、pp38与p-ATF-2蛋白表达的影响;RT-PCR检测柚皮苷对IL-1β诱导后软骨细胞中IL-1β及TNF-αmRNA表达的影响。结果 (1)柚皮苷标准品溶液及壮骨健膝方含药血清离子流图中柚皮苷的出峰时间均为23.5 min,分子量均在581.0~581.5 m/z之间;(2)柚皮苷能促进软骨细胞的增殖,抑制IL-1β对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响;(3)与模型组比较,柚皮苷能降低IL-1β诱导后软骨细胞中caveolin-1、p-p38、p-ATF-2等蛋白及IL-1β、TNF-αmRNA的表达(P<0.05),并接近正常组水平。结论壮骨健膝方含药血清中原组方药物成分柚皮苷不仅能够促进软骨细胞的增殖,还可保护软骨细胞的功能,其机制可能与柚皮苷降低诱导退变软骨细胞中caveolin-1、p-p38与p-ATF-2的表达,抑制"caveolin-p38MAPK"通路的活动,进而减少通路下游IL-1β及TNF-αmRNA表达有关。     

miR-145抑制VSMC增殖的作用及其相关信号通路研究

目的探讨miR-145对PDGF—BB诱导的大鼠原代血管平滑肌细胞（VSMC）的作用及丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号转导途径的作用。方法体外培养大鼠原代VSMC,再将细胞分为空白对照组、miR—NC组、PDGF—BB＋miR-145组及PDGF—BB组。CCK-8法检测各组细胞的增殖情况;实时RT—PCR方法检测PCNA、c—Jun及SM22a的表达水平;Western印迹方法检测ERK1／2和P—ERK1／2的表达、JNK和P—JNK的表达以及p38MAPK和P—p38MAPK的表达。结果miR-145过表达后能够抑制PDGF诱导的大鼠原代VSMC增殖,并下调VsMc增殖相关基因PCNA、c—Jun的表达、上调分化相关基因SM22a的表达;PDGF—BB诱导VSMC后,ERK、JNK、p38MAPK的磷酸化水平均明显上调,而转染miR-145慢病毒后再加PDGF刺激,ERK、JNK、p38MAPK的磷酸化水平均明显下调。结论miR-145能够抑制去分化型VSMC中的MAPK信号通路,进而抑制VSMC的增殖。     

柴胡三参胶囊对p38MAPK通路介导BMSCs向心肌细胞分化的干预研究

目的研究柴胡三参胶囊含药血清干预骨髓间充质干细胞在p38MAPK通路向心肌细胞分化的作用,探讨其抗心律失常机制与p38MAPK信号转导通路的相关性。方法根据不同处理因素将骨髓间充质干细胞分为4组:空白对照组、BMP-2诱导剂组、柴胡三参含药血清+BMP-2诱导剂组、柴胡三参含药血清组,分别加入空白血清、BMP-2、柴胡三参含药血清+BMP-2及柴胡三参含药血清,用WB法检测各组内p38MAPK m RNA表达水平,RT-PCR法检测干预后各组中MEF2C、CTn T蛋白表达。结果 WB法结果显示:与其他各组对照,柴胡三参+BMP-2组p38MAPK m RNA表达均上调(P0.01);以最佳浓度即20%的含药血清给予柴胡三参+BMP-2组、柴胡三参组干预后,空白组、BMP-2组、柴胡三参组p38MAPK m RNA表达较柴胡三参+BMP-2组均见下调(P0.05或P0.01),而空白组表达与其他组比较均无统计学意义。RT-PCR结果显示:诱导后BMP-2组、BMP-2+柴胡三参组、柴胡三参组MEF2C及CTn T表达水平均高于空白血清组,差异有统计学意义(P0.01);BMP-2+柴胡三参组表达水平高于BMP-2组、柴胡三参组(P0.05);BMP-2组与柴胡三参组比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论柴胡三参胶囊含药血清在一定条件下能促进骨髓间充质干细胞的增殖,对P38MAPK通路介导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化具有一定的促进作用。     

蠲痹胶囊对膝骨关节炎豚鼠关节软骨组织形态及滑膜中Toll样受体4、NF-κB p65及肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的:观察蠲痹胶囊对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)豚鼠关节软骨组织形态及滑膜中Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、NF-κB p65及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响,探讨其治疗KOA的可能作用机制。方法:将40只1月龄豚鼠随机分为正常组、3月龄组、5月龄组、氨基葡萄糖组和蠲痹胶囊组,每组8只。分组后正常组豚鼠直接进行标本采集,其余4组饲养至3月龄建立自发性KOA模型。造模结束后,3月龄组豚鼠进行标本采集;5月龄组、氨基葡萄糖组和蠲痹胶囊组分别以纯水、盐酸氨基葡萄糖胶囊和蠲痹胶囊灌胃,每天1次,连续干预2个月后进行标本采集。采集标本为豚鼠左后下肢膝关节髌下韧带表面的滑膜和胫骨内侧平台软骨,制成石蜡切片。软骨组织切片以番红固绿染色后光镜下观察软骨组织形态,采用Mankin’s病理评分标准进行评分;滑膜组织切片进行免疫组织化学染色(SP法),用Image-pro Plus 6.0图像分析软件对阳性染色的平均光密度值进行半定量分析,测定指标包括TLR4、NF-κB p65及TNF-α的表达水平。结果:5组豚鼠关节软骨Mankin’s评分比较,差异有统计学意义[(0.132±0.125)分,(5.011±0.180)分,(7.324±0.293)分,(4.250±0.250)分,(2.500±0.327)分,F=108.400,P=0.000];3月龄组评分高于正常组(P=0.000),5月龄组评分高于3月龄组(P=0.000),氨基葡萄糖组评分低于5月龄组(P=0.000),蠲痹胶囊组评分低于氨基葡萄糖组(P=0.000)。5组豚鼠关节滑膜中TLR4、NF-κB p65及TNF-α表达量比较,组间差异均有统计学意义(0.000±0.000,0.268±0.021,0.454±0.043,1.879±0.013,0.116±0.015,F=97.000,P=0.000;0.023±0.019,0.251±0.142,0.525±0.103,0.217±0.087,0.211±0.019,F=40.293,P=0.000;0.047±0.023,0.386±0.142,0.812±0.174,0.289±0.151,0.204±0.108,F=78.242,P=0.000);3月龄组TLR4、NF-κB p65及TNF-α表达量均高于正常组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),5月龄组TLR4、NF-κB p65及TNF-α表达量均高于3月龄组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),氨基葡萄糖组TLR4、NF-κB p65及TNF-α表达量均低于5月龄组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),蠲痹胶囊组TLR4、NF-κB p65及TNF-α表达量均低于氨基葡萄糖组(P=0.011,P=0.019,P=0.008)。结论:蠲痹胶囊和盐酸氨基葡萄糖均可延缓KOA豚鼠关节软骨退变,蠲痹胶囊的作用更加明显;其作用机制可能是通过激活TLR4/NF-κB信号转导通路来抑制炎性因子TNF-α表达,从而减轻组织炎症反应。     

补肾活血方通过p38 MAPK信号通路影响人成骨细胞功能的机制

目的：观察补肾活血方含药血清对人成骨细胞功能及其对p38 MAPK信号转导通路的活性影响,探讨补肾活血方防治骨质疏松症的作用机制。方法：将人成骨细胞株分为Control组、补肾活血方含药血清组（Z组）、含药血清＋p38抑制剂SB203580组（Z＋SB组）,采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测各组成骨细胞的增殖情况,通过PNPP法分析检测成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）的活性,采用免疫印迹（Western blot）法检测和磷酸化p38（p-p38）的表达水平。结果：补肾活血方含药血清能刺激成骨细胞的增殖,使分化增强,与Control组比较有显著性差异（P〈0.01）;阻断p38 MAPK信号转导通路后,与Z组比较,对成骨细胞的增殖无明显抑制（P〉0.05）,而对成骨细胞的分化功能有显著抑制作用（P〈0.01）;Western blot结果显示,补肾活血方含药血清能刺激p-p38表达,阻断p38 MAPK信号转导通路后,p-p38含量明显减少（P〈0.01）。结论：补肾活血方可能通过p38 MAPK通路调控促进成骨细胞分化的功能,起到防治骨质疏松症的作用。     

益气化瘀清热方及其拆方对大鼠肾小球系膜细胞表达p38MAPKmRNA及其蛋白的影响

目的:对益气化瘀清热方进行拆方,通过观察各类含药血清对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导下体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(primary mesangial cells,Ms C)表达p38MAPKmRNA及其蛋白的影响,探讨不同中药的作用强度以及益气化瘀清热方治疗肾小球肾炎的作用机制。方法:RT-PCR法检测各组含药血清对Ms C表达的p38MAPK mRNA。Wersten Blot法检测各组含药血清对大鼠Ms C表达的p38MAPK蛋白。结果:1RT-PCR结果显示:各组含药血清均能抑制体外培养的Ms C表达p38MAPKmRNA,复方组作用最强(P0.01),清热组与化瘀组比较无明显差异(P0.05),但优于益气组,差异显著(P0.01);2 Wersten印迹结果显示:各组含药血清均能抑制体外培养的Ms C表达p38MAPK蛋白,复方组作用最强(P0.01),清热组与化瘀组比较无明显差异(P0.05),但优于益气组,差异有统计学意义(P0.01)。结论:各类含药血清对大鼠Ms C表达p38MAPK mRNA及其蛋白的影响在不同组中药的比较中,复方组作用最强,化瘀组和清热组的作用明显优于益气组。     

口服蠲痹汤和盐酸氨基葡萄糖胶囊治疗膝骨关节炎的疗效观察及作用机制研究

目的:观察口服蠲痹汤和盐酸氨基葡萄糖胶囊治疗膝骨关节炎的临床疗效并探讨其作用机制。方法:将80例膝骨关节炎患者随机分为2组,每组40例,分别采用口服蠲痹汤和盐酸氨基葡萄糖胶囊、单纯口服盐酸氨基葡萄糖胶囊治疗。蠲痹汤口服每日1剂,水煎400 m L,早晚各200 m L,连续服用8周;盐酸氨基葡萄糖胶囊口服每次2粒,每日3次,连续服用8周。分别于治疗前、治疗开始后8周测量并比较2组患者膝关节疼痛视觉模拟量表(visual analogue scale,VAS)评分、日本骨科协会(Japanese orthopaedic association,JOA)膝关节功能评分以及Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的血清含量。结果:1膝关节疼痛VAS评分和JOA膝关节功能评分。治疗前2组患者膝关节疼痛VAS评分及JOA膝关节功能评分比较,组间差异均无统计学意义[(8.01±1.16)分,(8.05±1.12)分,t=0.157,P=0.876;(70.02±9.86)分,(68.32±10.28)分,t=0.755,P=0.453]。治疗开始后8周,口服蠲痹汤和盐酸氨基葡萄糖胶囊组膝关节疼痛VAS评分低于单纯口服盐酸氨基葡萄糖胶囊组[(2.33±0.68)分,(5.86±0.97)分,t=18.850,P=0.000],JOA膝关节功能评分高于单纯口服盐酸氨基葡萄糖胶囊组[(86.24±5.32)分,(79.46±7.54)分,t=4.647,P=0.000];2组患者膝关节疼痛VAS评分均低于治疗前(t=26.720,P=0.000;t=9.348,P=0.000),JOA膝关节功能评分均高于治疗前(t=9.156,P=0.000;t=5.526,P=0.000)。2TLR4、TNF-α血清含量。治疗前2组患者TLR4、TNF-α血清含量比较,组间差异均无统计学意义[(17.90±6.80)ng·mL~(-1),(18.40±6.50)ng·mL~(-1),t=0.336,P=0.738;(188.70±38.90)pg·mL~(-1),(192.40±46.50)pg·mL~(-1),t=0.386,P=0.701]。治疗开始后8周,口服蠲痹汤和盐酸氨基葡萄糖胶囊组TLR4、TNF-α血清含量均低于单纯口服盐酸氨基葡萄糖胶囊组[(11.40±3.60)ng·mL~(-1),(15.10±4.30)ng·mL~(-1),t=4.173,P=0.000;(122.40±39.20)pg·mL~(-1),(158.20±37.37)pg·mL~(-1),t=4.181,P=0.000],2组患者TLR4、TNF-α血清含量均低于治疗前(t=5.343,P=0.000;t=2.678,P=0.000;t=7.593,P=0.000;t=3.636,P=0.000)。结论:口服蠲痹汤和盐酸氨基葡萄糖胶囊治疗膝骨关节炎,能够缓解或消除膝关节疼痛,改善膝关节功能,其疗效优于单纯口服盐酸氨基葡萄糖胶囊;其作用机制可能是通过抑制TLR4的表达,使TNF-α的表达受到抑制,从而减轻了炎症反应。     

补肾康膝方对家兔软骨细胞增殖与凋亡的影响

目的 观察补肾康膝方含药血清对体外培养的兔关节软骨细胞的增殖凋亡和端粒酶活性的影响.方法 取兔的关节软骨,将软骨细胞分离传代后,分为补肾康膝方含药血清组和对照组,置入37℃,50 ml/L的CO2培养箱内培养7 d后,采用MTT法检测细胞增殖;TUNEL法检测各组软骨细胞的凋亡;软骨细胞经扩增后用ELISA检测端粒酶活性.结果 补肾康膝方高、中、低剂量组细胞增殖均高于对照组(P<0.05);补肾康膝方含药血清各组的软骨细胞凋亡率明显低于对照组(P<0.05);补肾康膝方含药血清各组的软骨细胞端粒酶活性明显高于对照组.结论 补肾康膝方可能通过上调软骨细胞端粒酶活性,从而抑制软骨细胞的凋亡.     

少阳生骨方对去分化软骨细胞增殖以及Ⅱ型胶原表达影响研究

目的：对比观察少阳生骨方（SYSGF）与盐酸氨基葡萄糖胶囊对去分化软骨细胞增殖以及Ⅱ型胶原表达的影响,探讨少阳生骨方对膝关节软骨保护方面的作用。方法：①去分化软骨细胞体外培养体系的建立以及鉴定;②用CCK-8法观察少阳生骨方以及盐酸氨基葡萄糖对去分化软骨细胞增殖影响;③用免疫组化法观察少阳生骨方以及盐酸氨基葡萄糖对去分化软骨细胞Ⅱ型胶原表达影响。结果：①通过酶消化法建立1周龄SD大鼠去分化软骨细胞体外培养体系,通过镜下观察、甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原表达染色鉴定,确认分离培养的软骨细胞符合软骨细胞的生物学特性。②CCK-8法观察去分化细胞结果显示：0.6%、1.2%、2.4%含少阳生骨方药物以及盐酸氨基葡萄糖的药物血清与空白组相比,其均能促进去分化软骨细胞的增殖（P〈0.05）,但少阳生骨方组与盐酸氨基葡萄糖组相比其结果差异性没有统计学意义（P〉0.05）。③用免疫组化染色法观察去分化软骨细胞结果显示：不同药物以及不同药物浓度干预去分化软骨细胞后其Ⅱ型胶原均有表达,表达部位在胞浆,为红棕色颗粒或成片状,但与空白组相比,少阳生骨方组与盐酸氨基葡萄糖组表达率明显增加（P〈0.05）。同浓度含药血清少阳生骨方组与盐酸氨基葡萄糖组Ⅱ型胶原表达结果差异性没有统计学意义（P〉0.05）。结论：少阳生骨方能促进去分化软骨细胞的增殖以及Ⅱ型胶原的表达,提示少阳生骨方能有效保护关节软骨,这或许是其防治骨性关节炎的机制之一。