纳米级脂质微泡超声造影剂肿瘤被动靶向研究

目的 观察纳米微泡通过肿瘤血管内皮间隙实现被动靶向的可行性.方法 20只SKOV3细胞皮下种植荷瘤裸鼠分为A组(超声显像组10只)及B组(冰冻切片组10只,再分为B1组及B2组).制备DiI标记的纳米微泡及微米微泡并调整至相同浓度.A组:各裸鼠先后经尾静脉注射相同浓度微米微泡及纳米微泡(35μl/只,间隔1.5h),分别进行超声显像观察.B组;B1组及B2组各裸鼠分别注射相同浓度微米微泡及纳米微泡(约10μl/只),1.5h后对裸鼠进行心脏灌注后切取肿瘤组织及肌肉组织进行冰冻切片、Hoechst核染,激光共聚焦显微镜下观察不同微泡在两组织中的滞留情况.结果 超声显示:纳米微泡组达峰时间及消退时间均长于微米微泡组,而峰值强度低于微米微泡组.冰冻切片观察;纳米微泡组肿瘤细胞周围见明显红色荧光聚集,微米微泡组肿瘤、肌肉组织中及纳米微泡组肌肉组织中均未见明显红色荧光.结论 纳米级脂质微泡可通过肿瘤血管内皮间隙,即实现了肿瘤被动靶向.     

自制脂质体超声纳米微泡的特性和显影效果

目的　测定自制纳米级脂质体超声微泡造影剂(nano-liposomal bubble,NB)的基本特性.方法　采用逆向蒸发法制备脂质体,用声震法制备NB后观察其形态,检测其平均粒径、表面电位及浓度等物理特性;在脱气水中分别注入生理盐水、NB及SonoVue (200μl),观察显影效果;分别经兔耳缘静脉团注生理盐水、NB及SonoVue (2.0 ml/kg),动态观察兔心脏及肝的增强情况.结果　镜下观察,NB粒径范围133.1～199.5 nm,平均粒径为(171.60±30.82)nm,平均电位为- (1.92±0.65)mV,分布均匀,浓度为(3.8～5.6)×108/ml.常温下造影剂放置1周、1月后观察,基本特性无明显改变.体外显影结果显示:NB与SonoVue一样具有显著的显影效果.体内造影后观察:NB与SonoVue均能明显增强兔心脏及肝的二维灰阶显像.结论　NB性质稳定,形态好,粒径均一,具有良好的显影效果.由于其粒径小且基于脂质体基础上易被修饰,因此在超声分子影像及基因/药物传递方面具有广阔的应用前景.     

以HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂的制备及实验研究

目的 制备以HER2受体为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂,并观察其体外寻靶能力及体外超声显像效果.方法 制备生物素化Herceptin单抗,检测其生物素化程度及生物学活性;薄膜水化-声振法制备生物素化纳米微泡,以生物素-亲和素为桥梁制备HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂,观察其对SKOV3卵巢癌细胞的体外寻靶能力及靶向结合的体外超声显像.结果 平均每分子Herceptin单抗可与16个生物素分子结合;与游离单抗相比,生物素化抗体的活性未见明显降低(P＞0.05).体外寻靶实验观察:靶向纳米微泡组SKOV3细胞表面有明显的红染纳米微泡与其牢固结合,沿细胞表面排列较规则;非靶向组SKOV3细胞表面未结合红染的纳米微泡.靶向纳米微泡体外超声显像:细胞爬片与靶向纳米微泡孵育后可明显增强超声显像效果,对照组均未见明显超声显像.结论 应用生物素-亲和素系统成功构建了以HER2为靶点的纳米级超声造影剂,与SKOV3细胞结合后有明显超声显像效果.     

超声靶向破坏微泡技术的应用进展

随着分子生物学及生物技术的迅速发展,近年来基因治疗的基础研究与应用得到了长足进步。超声靶向破坏微泡(UTMD)是一种靶向、高效、有广阔应用前景的非病毒基因输送技术,其通过诱发细胞膜声孔作用,增加膜通透性,进而有效促进大分子物质的胞内传输,且可避免其他基因传输方法的不良反应。本文对UTMD介导基因或药物传递的应用领域予以综述。     

P-选择素靶向超声微泡与普通超声微泡粘附途径和效能的对比研究

目的荧光显微镜直视下对比评价P-选择素靶向超声微泡与普通超声微泡在炎症内皮上的粘附途径和效能。方法构建携荧光FITC、抗P-选择素单抗的靶向超声微泡（MBp）和携荧光FITC普通超声微泡（MB）,随机经静脉弹丸式分别注入对照组（10只）和肿瘤坏死因子（TNF—α）处理组（10只）的小鼠提睾肌炎症模型。同时,20高倍荧光显微镜观测5min内两组不同微泡在提睾肌微血管中的粘附数量和粘附途径。结果TNF—α处理组MBp粘附数量为（12±2．6）个／视野,而MB粘附数量为（3±1．2）个／视野,两者差异有统计学意义（P〈0．01）;且TNF—α处理组MBp粘附数量分别为对照组MBp和MB的（6．4±1．7）倍和（9．9±2．1）倍（P〈0．01）。TNF-Ⅱ处理组和对照组分别有（69．6±2．6）％和（56．6±25．4％）的MBp通过直接与内皮细胞结合实现粘附,而MB内皮粘附率仅为（24．6±23．3）％和（20．0±27．4）％。结论与MB比较,MBp能高效、特异地粘附于炎症组织血管内皮上,应用其可有效评价血管内皮炎症反应或其他组织损伤。     

机械振荡法与声振法制备纳米级微泡超声造影剂效能比较

目的 比较机械振荡法与声振法制备纳米级微泡超声造影剂(Nanobubbles,NBs)的效能.方法分别用机械振荡法和声振法制备NBs,比较两种方法制备NBs的粒径、粒径分布、浓度以及制备所耗时间等.结果 声振法与机械振荡法制备的NBs粒径分别为(373.88±18.43)nm、(360.74±14.39)nm,二者比较差异无统计学意义(P=0.523).声振法制备的NBs离心纯化前粒径分布较广,与机械振荡法制备的NBs粒径分布(分散系数,polidispersity值)比较差异有统计学意义(P＜0.001).机械振荡法制备的NBs浓度为(1.48±0.15)×1010,明显高于声振法制备的NBs浓度[(8.07±0.62)×108] (P＜0.001).声振法制备NBs较机械振荡法耗时长,两者比较差异有统计学意义(P＜0.001).结论 机械振荡法与声振法均能制备出NBs,但与声振法相比,机械振荡法制备的NBs粒径分布窄,浓度高,用时短,可更加快速有效地制备NBs,适合进行肿瘤超声造影成像方面的实验研究.     

超声辐射力促靶向微泡黏附的在体实验研究

目的 探讨超声辐射力对靶向微泡在体黏附性能的影响.方法 建立小鼠提睾肌炎症模型,经尾静脉团注脂质微泡(MB)或靶向微泡(MBIcAM),同时进行超声辐射力(USRF)照射或假照5 min.实验随机分为MB+假照组和MB+ USRF组,MBIcAM+假照组和MBIcAM+ USRF组.荧光显微镜下观察微泡黏附情况并计数.结果 USRF组MBIcAM在微循环中的黏附数量比假照组显著增高,分别为(43.4±2.1)/视野,(14.8±1.8)/视野,两者之间具有显著性差异(P=0.000).USRF组MB在微血管中的黏附数量[(6.2±1.3)/视野)较假照组(4.6±0.9)/视野]有轻度增高,但两者之间差异无统计学意义(P=0.129).MBIcAM黏附数量在辐射力组及假照组均显著高于MB的黏附数量.结论 超声辐射力可显著提高在体微血管内靶向微泡的黏附作用.     

微泡浓度对于超声辐照诱导生物效应的影响

目的 探讨全氟显微泡浓度对于超声辐照诱导体外培养的正常肝细胞"声致孔隙"效应、凋亡和坏死的影响.方法 应用超声辐照含不同量微泡的HL-7702细胞悬液.实验设空白对照组(无造影剂,无辐照)、超声辐照组(无造影剂,超声辐照)及不同微泡浓度组[微泡数/细胞数(B/C)值为1～200,辐照10 min].辐照后观察大分子荧光物质进入细胞情况以检测"声致孔隙"效应,检测细胞活力及凋亡.结果 与空白对照组及超声辐照组比较,B/C为5～200组荧光染色阳性率明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).与空白对照组及超声辐照组比较.分别为B/C 50、100及200组的细胞死亡率明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05);超声辐照组与空白对照组比较,各项结果差异无统计学意义(P＞0.05).结论 一定浓度下诊断超声辐照国产造影剂全氟显可诱导正常肝细胞发生"声致孔隙"效应及细胞死亡.应用于诊断目的 时,B/C值尽可能在10以下;应用于基因转染时则选择B/C值50较为适宜,必要时可达100.     

自制纳米级超声微泡体外基本特性和肿瘤造影增强显影的实验研究

目的 探讨自制纳米级超声微泡的体内基本特性及体内造影增强显影效果.方法 机械振荡与低速离心法结合制备纳米级微泡,并对微泡粒径大小、分布、微观形态和稳定性进行研究.同时在裸鼠肝、肾及前列腺癌皮下移植瘤进行超声造影实验,与常规微米级造影剂对比造影效果.结果 所制备的微泡形态圆整,大小均一性较好,分布均匀无聚集,平均粒径(580.6±36.3)nm.该纳米级微泡能显著增强裸鼠肝肾及皮下移植瘤显影,与常规造影剂比较,不但增强强度相当,且显影时间显著延长.结论 自制纳米级超声微泡造影剂各项物理特性符合纳米级超声造影剂的要求,体内增强效果和稳定性较强,为下一步纳米级微泡在肿瘤显像和治疗中的应用提供实验依据.     

聚糖纳米微泡超声造影剂的制备及其超声显影效果

目的 制备聚糖纳米微泡超声造影剂,观察其基本特征及动物超声显影效果.方法 高速剪切法制备纳米微泡超声造影剂,光学显微镜和透射电镜观察纳米微泡大小、形态,马尔文粒度分析仪测粒径分布,细胞计数板计数纳米微泡,Zeta电位仪测表面电位,对比超声观察大鼠肾、心脏超声显影效果并测量声强度.结果 纳米微泡呈空心球形结构,分散均匀,形态规则,平均粒径(617±12)nm,浓度(7.2±0.6)×109/ml,Zeta电位(52.9±1.3)mV.24 h、45 d和90d三个时间点浓度、平均粒径和表面电位无明显差异(P＞0.05).用其可使小鼠肾、心脏超声显影明显增强,最大视频强度分别达(15.6±1.1)GU、(27.3±2.5)GU,可视增强持续时间(10±2)min.结论 聚糖纳米微泡稳定性和显像效果良好,有可能成为可穿过血管内皮间隙的新一代超声造影剂.     

医学超声微泡造影剂空化效应的研究进展

近年来,随着新型超声微泡造影剂的研究和应用,超声微泡介导靶向治疗可增强基因转染效率,提高特定组织的基因表达水平和药物浓度,是一种安全、简便、高效的靶向性基因转染及药物治疗的新方法。本文就超声空化效应和超声微泡的治疗机制和应用做一简要综述。     

超声定位辐照载pEGFP质粒DNA超声微泡转染新生血管性角膜组织的实验研究

±7.08;B组:97.02±8.31;C组:81.83±9.44),差异有统计学意义(F=23.56,P<0.05).结论 一定声强和时间的辐照下,超声微泡能有效提高质粒DNA在兔新生血管性角膜组织的基因转染率.     

超声斑点追踪技术评价微泡造影剂介导SERCA2a基因治疗心肌梗死大鼠的实验研究

目的 应用二维超声斑点追踪显像技术评价超声微泡造影剂介导rAAV2-SERCA2a基因靶向治疗心肌梗死大鼠左心室功能的疗效.方法 健康雄性SD大鼠35只,随机分为3组:假手术组、心肌梗死组和基因治疗组.心肌梗死组及基因治疗组结扎冠状动脉左前降支近端,造成前壁心肌梗死.假手术组单纯开胸不结扎冠状动脉.4周时,基因治疗组注射rAAV2-SERCA2a与造影剂混合液,假手术组及心肌梗死组仅注射造影剂,以上各组均给予心肌定点超声辐照.干预4周时,测量各组大鼠左心室短轴观乳头肌水平径向应变率(radial strain rate,SRrad)和圆周应变率(circumferential strain rate,SRcir)的收缩期峰值(SRrad-S,SRcir-S)及舒张早期峰值(SRrad-E,SRcir-E)以及左室心肌扭转角度等.结果 干预4周时,基因治疗组各节段SRcir-S、SRcir-E、SRrad-S、SRrad-E以及左室扭转角度较心肌梗死组增加(P＜0.01),与假手术组差异无统计学意义.结论 超声微泡造影剂介导rAAV2-SERCA2a基因转导至心肌组织,可有效改善心肌梗死大鼠左室心肌功能.     

超声爆破微泡介导内皮抑素基因抑制兔颈动脉粥样硬化的实验研究

目的 探讨利用超声爆破微泡介导内皮抑素(endostatin,ES)基因转染对兔颈动脉粥样硬化斑块内新生血管及斑块生长的抑制作用.方法 20只颈动脉粥样硬化模型兔随机分为三组:A组,微泡+超声;B组,对照质粒+微泡+超声;C组,ES质粒+微泡+超声.建模2周行超声爆破微泡介导基因转染,间隔3周时重复转染1次.建模14周时行超声及数字减影血管造影(DSA)检查,病理检测病变血管新生内膜、斑块内新生血管及ES表达情况.结果 超声显示A组和B组内膜明显增厚,斑块较大,管腔明显狭窄,收缩期峰值流速(PSV)增加,C组上述指标明显较A组和B组低(P＜0.05).病理检测C组内中膜厚度(IMT)、内膜厚度(IT)、内中膜厚度比(IT/MT)、内膜面积(IA)、内中膜面积比(IA/MA)及新生内膜狭窄率与A组和B组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).C组颈动脉新生血管及血管内皮生长因子(VEGF)表达均较A组和B组低,内膜及胫前肌可见较多ES表达,而A组和B组无明显ES表达.结论 一定超声辐照条件下,超声爆破微泡介导ES基因转染可抑制兔颈动脉粥样硬化病变的发展,有可能为动脉粥样硬化性疾病的基因治疗提供一种安全有效的方法 .

Abstract：

Objective To explore the inhibition effect on angiogenesis and plaque growth of carotid atherosclerosis by transfection of endostatin gene using microbubbles combined with ultrasound exposure.Methods Twenty rabbit models of carotid atherosclerosis were randomly divided into 3 groups:group A,microbubble+ ultrasound; group B, control plasmid + microbubble + ultrsound; group C, ES plasmid +microbubble+ ultrasound. Two weeks after surgery, ultrasound/microbubble mediated gene transfer was performed,and it was performed once again three weeks after the first transfection. Ultrasonography and digital subtraction angiography(DSA) were performed at the time of 14 weeks. The carotid arteries were taken to detect the neointima and angiogenesis, and the expression of endostatin was detected using pathological means. Results The imagings of ultrasound showed that the intima in group A and B were thick significantly with larger plaques, and the lumen became stenosis with the peak systolic velocity increasing,however,in group C,the parameters mentioned above were significantly less than those of group A and B ( P＜0.05). Pathological results displayed that intima-media thickness (IMT), intima thickness (IT), intima thickness/media thickness (IT/MT), intima area (IA), intima area/media area (IA/MA) and neointimal stenosis rates were greater in group A and B, however, they were less in group C ( P＜0.05).The number of neovascularization and vascular endothelial growth factor(VEGF) expression in group A and B were more than those of group C. There was more endostatin positive expression in carotid arteries and anterior tibial muscles of group C, while there was nearly no expression in group A and B. Conclusions Under the conditioned ultrasonic irradiation, ultrasound/microbubble mediated endostatin gene transfection can inhibit the development of carotid atherosclerosis in rabbits, which might provide a safe and effective strategy for gene therapy of atherosclerotic disease in future.     

超声微泡造影剂实现肿瘤靶向性治疗研究进展

低功率超声辐照微泡栓塞肿瘤血管是治疗肿瘤的一种新方法,特异性抗体偶联微泡介导的药物或基因靶向运输在肿瘤治疗方面也显示出巨大潜力,具有广阔的应用前景。现对超声微泡造影剂介导肿瘤靶向性治疗的研究进展做一综述。     

超声介导微泡靶向传输基因促血管新生的实验研究

目的探讨超声介导微泡靶向传输血管内皮生长因子VEGF165促心肌血管新生即心肌“分子搭桥”的新途径。方法利用分子生物学方法构建人血管内皮生长因子真核表达质粒pcDNA3.1-/VEGF165;制备载VEGF165基因脂质体微泡,分析其理化性质和功能,在超声场利用超声辐射向大鼠梗死心肌靶向传输VEGF165;2周后取材,逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)评价大鼠心肌中人源VEGF165mRNA表达,蛋白印迹杂交(WesternBlot)观察大鼠心肌VEGF165的蛋白表达,CD34免疫组化微血管密度(MVD)计数半定量法评价超声介导微泡靶向传输VEGF165促梗死心肌血管新生效果。结果①成功构建、克隆血管内皮生长基因VEGF165重组真核表达质粒pcDNA3.1-/VEGF165,测序分析、酶切鉴定准确无误;②研制的脂质体微泡超微结构显示可粘附或包载DNA,粒度分析显示平均粒径<5μm;③在超声介导下该脂质体载基因微泡可靶向传输VEGF165至大鼠梗死心肌,超声介导靶向传输组VEGF165的mRNA、蛋白表达及促血管新生作用(MVD表示)仅次于VEGF165基因心肌注射组。结论超声介导微泡可向大鼠心肌靶向传输VEGF165基因并产生促血管新生效应。     

超声造影剂在肝癌基因治疗中的靶向性实验研究

目的 探讨结合了肝细胞配体的超声造影剂在超声辐照下介导目的 基因转染肝癌细胞的可行性,寻找一种新的基因靶向导入方法.方法 制备肝细胞表面特异性配体半乳糖基化多聚赖氨酸(GPLL),并对产物进行红外光谱分析.将c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)、G-PLL与SonoVue微泡三者偶联,在超声波介导下,促使c-myc ASODN转染人肝细胞癌SMMC-7721细胞及肺腺癌A-549细胞(作对照),实验结束后行半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以观察不同组问c-myc基因的表达情况.结果 超声介导微泡破裂可增加c-myc ASODN在SMMC-7721细胞和A-549细胞中的表达;SMMC-7721细胞加入G-PLL组中c-myc基因表达水平显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01),而A-549细胞中加入与未加入G-PLL组间c-myc基因表达量的差异无统计学性意义(P＞0.05).结论 超声介导微泡造影剂破裂的方法可促进基因的转染,而超声联合肝细胞受体介导的微泡造影剂则更具有肝细胞靶向性,能有效地促进目的 基因在肝癌细胞中的表达,为肝癌基因治疗提供了新的途径.     

超声辐照联合微泡造影剂介导血管内皮生长因子基因转染损伤动脉的研究

A及蛋白在各组血管中的表达情况.结果 免疫组化可见4、5组血管中大量棕黄色的VEGF阳性颗粒.RT-PCR、Western Blot检测提示第5组VEGF表达高于其他4组(P<0.05),第4组VEGF表达高于前3组(P<0.05),第1、2组间和第1、3组间的VEGF表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 单纯质粒难以有效转染血管内皮,靶向超声组和超声微泡组均可实现VEGF基因转染血管内皮,其中靶向超声组的转染效率高于超声微泡组.     

脂质体微泡对超声介导基因转染的增效作用研究

目的 探讨超声介导基因转染时,脂质体微泡(LM)对体内、外红色荧光蛋白基因(RFP)转染的增效作用及其安全性.方法将RFP和LM加入培养的Hela细胞后行超声辐照(US),对微泡浓度、超声强度、辐照时间进行优化研究,运用荧光显微镜、流式细胞术评估基因转染率,并对细胞损伤进行分析.在裸鼠移植瘤的体内实验中,将LM和RFP质粒(P)经尾静脉注入后予以超声辐照(P+LM+US),以单纯质粒注射(P)、P+US、P+LM作为对照,行冰冻切片,组织学检查,RFP表达检测.结果培养的Hela细胞经LM和超声辐照联合处理后,RFP基因转染率显著增加,差异有统计学意义(P＜0.01),在超声强度为1.0 W/cm2、微泡浓度为6%、辐照3 min的条件下最显著,且未发现显著的细胞损伤.P+LM+US组的裸鼠移植瘤内RFP表达显著高于P组、P+US组或P+LM组,差异均有统计学意义(P＜0.01),且未观察到明显的组织损伤.结论 LM对超声介导基因转染的体内、外转染效率有显著的增效作用,而无明显的细胞或组织损伤,为临床基因治疗提供一种新颖、高效、安全的非病毒基因转染方法.