应用PCR技术检测李斯特氏菌致病基因

李斯特氏菌广泛存在于自然界当中,是影响食品卫生的重要病原菌.有资料显示,在其传播途径中,动物性食品日显重要.为掌握李斯特氏菌在我省食品中的污染状况,我们调查了7类食品共315份样品,用常规检验方法检出9株李斯特氏菌,为快速测定其致病性,采用PCR技术对分离菌株做了2种主要致病因素李氏溶血素O和内化素的分析.现报告如下.     

李斯特氏菌快速检测研究进展

李斯特菌是一类十分重要的人畜共患病的病原体,其中尤以单核细胞增生李斯特菌最为重要。本菌可引起多种畜禽和人类的严重疾病,人畜感染后,主要表现为脑膜炎,败血症变化和血液中单核细胞增多;家禽感染后主要表现为脑膜炎,坏死性心肌炎及坏死性肝炎。畜禽感染后除骡、驴病死率较低外,马、牛、羊、鸡、兔、猪和犬等均有较高的病死     

单增李斯特菌不同PCR快速检测方法比较

目的比较3种PCR快速检测方法在检测单核细胞增生李斯特菌时的特异性和灵敏度方面的差异。方法针对单核细胞增生李斯特菌的毒力基因iap和prfA基因,分别设计引物,进行单个PCR、多重PCR、套式PCR等3种方法检测。结果3种PCR方法均具有较强的特异性;套式PCR的灵敏度为10²cfu/ml,高于单个PCR(10³cfu/ml)和多重PCR(10⁴cfu/ml)。结论多重PCR在特异性检测方面具有优势,而在灵敏度方面,套式PCR要明显优于单个及多重PCR方法。     

多重-巢式PCR检测食品中单增李斯特菌研究

〔目的〕建立多重—巢式PCR联合检测体系快速检测食品中的单增李斯特菌。〔方法〕针对单增李斯特菌中多个稳定的特异性基因(hlyA、plcB、prfAi、ap),设计并筛选出6对引物用于多重PCR、2对引物用于巢式PCR,组成多重—巢式PCR联合检测单增李斯特菌,并对珠海地区6类冷冻冷藏食品中单增李斯特菌的带菌情况进行了初步调查。〔结果〕建立的多重—巢式PCR联合检测体系特异性良好,多重PCR的灵敏度达到1×102cfu/ml,巢式PCR的灵敏度达到1×101cfu/ml。在检测的3439份样品中,单增李斯特菌阳性率达22.39%。〔结论〕该检测体系具有快速可靠、灵敏准确及特异性好的特点,有效缩短了检验周期,从传统的14d缩短到2d。对珠海地区6类冷冻冷藏食品中单增李斯特菌的带菌情况有了一定了解。     

Taq Man-MGB探针Real-timePCR快速检测单增李斯特菌的研究

目的：建立TaqMan—MGB探针Real—time荧光PCR快速检测单增李斯特菌技术。方法：在对单增李斯特菌invA序列进行分析、比较基础上，设计一对特异性TaqMan—MGB探针法引物及探针，通过Real—timePCR反应条件和反应体系的优化，实现对单增李斯特菌的快速检测；用克隆到pMD18-T载体上的李斯特菌invA基因阳参片段及不同菌株、食品标本验证方法的特异性和敏感性。结果：方法的灵敏性高，其循环阈值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系，最低可检测57个拷贝数，经18h增菌，可检测低至4．5cfu／ml的细菌；特异性强，检测6株单增李斯特菌标准株和100株单增李斯特菌样品分离株的PCR循环域值（cT值）均小于25，而90株威氏李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌以及非李斯特菌PCR循环域值（CT值）大于35；快速，最快1h可出结果，实际样品20h可出结果，而常规细菌培养法需要一周以上；对103份速冻米面食品进行检测，13份阳性，与常规方法无显著性差异（P〉0．05）。结论：TaqMan—MGB探针的单增李斯特菌Real—time荧光PCR检测方法具有特异性强，敏感性高，易操作等优点，可推广应用。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法研究

[目的 ]　建立一种快速准确检验食品中单核细胞增生李斯特氏菌的方法。　 [方法 ]　以miniVIDAS仪结合API系统 ,将该法与传统方法进行比较。　 [结果 ]　该方法能检出 <10个 /mL模拟样品中的单核细胞增生李斯特氏菌 ,与食品中常见的细菌无交叉反应 ,能对非单核细胞增生李斯特氏菌作出正确鉴定。在 4天内能作完全鉴定结果。对 2 2 6份实样的检测 ,检出率为 11.5 %。　 [结论 ]　以miniVIDAS仪结合API系统建立的方法具有特异性好、灵敏度高、快速简便的特点 ,是一种较好的检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法     

两种方法检测单增李斯特菌的比较研究

[目的]探讨建立快速、准确的单增李斯特菌的检测方法。[方法]采用荧光定量PCR和传统细菌培养法,同时对单增李斯特菌进行检测,并对其敏感性与特异性进行比较。[结果]荧光定量PCR检测的敏感性可达19cfu／ml,敏感性高于细菌培养法,且特异性强,从细菌核酸提取至完成检测仅需3h。[结论]荧光定量PCR检测是快速敏感的方法,在应对突发公共卫生事件中能起到重要作用。     

基于Taqman探针双重实时荧光PCR检测单增李斯特菌

目的:建立双重荧光PCR对单增李斯特菌(LMO)特异性检测同时检测其毒力基因的方法。方法:根据LMO溶血素基因hlyA和內华素基因InlA的保守序列分别设计特异性引物和Taqman探针,优化多重荧光PCR反应体系,进行特异性、敏感性试验。结果:用建立的方法检测LMO标准菌株和24株分离株均出现hlyA和InlA扩增曲线,而沙门菌等其他菌株未见扩增曲线;敏感性试验结果方法的敏感性达到2.5×102 cfu/ml。结论:本研究建立的LMO实时荧光PCR检测方法特异性好、灵敏度高,是快速检测LMO及其毒力基因的有效手段,可用于食品中LMO检测。     

李斯特氏菌食物中毒

李斯特氏菌食物中毒是由单核细菌李斯特氏菌引起的,自１９２６年Ｍａｒｒａｙ等从兔和豚鼠的肝脏中分离现该菌以来,有关该菌报道不断。尤其是该菌被证实为食源性致病菌的十年以来,在欧美日等发达国家报道逐年呈上升趋势,其危害程度甚至超过沙门氏菌食物中毒［１］。李斯特氏菌食物中毒能引起人和动物的脑膜炎、败血症等,死亡率达高３０以上［２］。迄今为止,我国尚无人类李斯特氏菌食物中毒的报道,人散在病例和动物食物中毒已见报道［３,４］,由于该菌在自然界存在较为广泛,且其具有独特的生理特性,极易引起食物中毒的暴发流行…     

PCR法对单核细胞增生李斯特菌食品分离株的鉴定

〔目的〕采用PCR法对常规法分离的八株单核细胞增生李斯特菌 (LM )再鉴定 ,以验证PCR法作为检测LM的有效性及可靠性。〔方法〕八株从食品中分离的LM在BHI培养基纯培养 2 4h后 ,提取基因组DNA ,用PCR扩增hly基因特异性 85 6bp的片段。〔结果〕八株从食品中分离并经传统方法鉴定的LMPCR扩增均出现特异性的条带 ,而其他属的李斯特菌和非李斯特菌未出现特异性的条带。〔结论〕采用hly基因作为PCR扩增的目标基因检测LM具有较好的特异性 ,可用于食品中LM的检测与分离。     

李斯特菌属荧光定量PCR检测方法的建立

目的采用荧光定量PCR技术,建立可以同步检测李斯特菌属与单增李斯特菌的快速检测方法。方法选取单增李斯特菌hlyM基因和李斯特菌属23Sr DNA基因为靶基因,分别设计引物和探针,在构建二者的阳性重组质粒基础上,对李斯特菌属和单增李斯特菌进行荧光定量PCR的检测。结果建立的李斯特菌属和单增李斯特菌单重荧光定量PCR检测方法与双重荧光定量PCR的检测方法敏感度一致,分别为18.6拷贝/μl和23.2拷贝/μl。结论建立的双重荧光定量PCR方法可以同步检测李斯特菌属与单增李斯特菌。     

单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法建立

[目的]建立单核细胞增生性李斯特氏菌(Lm)快速检测(PCR)方法.[方法]用PCR特异性检测方法,根据Lm的inlA、 plcA、 plcB、 hlyA基因设计4对相应的引物,检测不同浓度Lm纯培养物、金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌标准菌株的纯培养物以及Lm模拟污染的牛奶样品.[结果]Lm扩增出4个相应的产物(分别为255bp、 129bp、 260bp、 234bp),金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌菌株均未扩增出特异性的片段,其中inlA基因最低检出限为25.5μg/ml,其他3对引物最低检测限达2.55μg/ml.对模拟污染的牛奶TSBYE增菌培养液用PCR检测,只扩增出3个相应基因的产物(plcA、 plcB、 hlyA).[结论]扩增plcA、 plcB、 hlyA基因的PCR法对Lm的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点,可用于食品的Lm的分离.     

土拉菌套式PCR检测技术的研究

[目的]为快速诊断土拉菌病拟建立套式PCR技术。[方法]设计出2对特异引物,取1986年1月收集的13名土拉菌病患者的抗凝血及对照组细菌,提取DNA并进行套式PCR扩增。[结果]套式PCR检测到患者血液中土拉菌阳性率为84.6%,对照组细菌均为阴性。用直接PCR能观察到10条位于900 bp的暗带。而行套式PCR后能观察到11条亮度较高为于550 bp处的条带。[结论]套式PCR方法检测土拉菌具有特异性强、敏感性高,简便快速的特点。     

改良分子信标-实时PCR快速检测产单核李斯特菌

目的：建立改良分子信标-实时PCR检测产单核李斯特菌（LMO）的快速方法，应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。方法：根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，建立改良分子信标-实时PCR检测体系，应用于食品中LMO检测。结果：改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110fg，菌液灵敏度为99cfu／ml或4cfu／PCR反应体系，无交叉反应。以此反应体系检测28株LMO，均出现特异的荧光信号。上述方法可将检测时问由原来的至少4d缩短至1d。对228份食品进行LMO检测，8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性，其中6份1310细菌培养阳性。结论：改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高，特异性强．能提高LMO的检出率和准确性，可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断。     

奶液模拟标本中单增李斯特菌real-time PCR检测方法的建立

目的建立了基于TaqMan探针的real-time PCR技术针对奶液模拟标本中单增李斯特菌的快速检测方法。方法用单增李斯特菌hlyO基因的部分片段作为靶基因,制作标准曲线,定量检测奶液中的单增李斯特菌。结果通过对不同李斯特菌及一些较为常见的致病菌的DNA进行扩增,只有单增李斯特菌能够产生扩增曲线,其余菌株均不产生扩增曲线。单增李斯特菌的检测灵敏度可以达到9copies/反应体系。结论该方法特异性好,灵敏度高,整个实验可在1.5h内完成,可用于食品中单增李斯特菌的快速检测和疫情暴发时的相关病原调查。     

食品中李斯特氏菌的污染状况调查及快速检验方法的研究

李斯特氏菌（以下简称李氏菌）是一种重要的人畜共患病,对人的致病作用正日益受到重视,ＦＤＡ、ＷＨＯ等组织都相继成立了相应的机构或规定相应的策略去预防和控制该菌的污染、传播。近几年来,许多国家报道从多种食品中分离到李氏菌或因食品污染李氏菌而引起的食物中毒暴发事例,为此李氏菌成为新的重要的食源性疾病的病原菌,已引起了食品卫生管理部门的广泛关注。目前,在国际上已将此菌列为九十年代的食品四大致病菌之一。为了解该菌在国内食品中的污染状况、分布特点及血清型别,建立各种快速鉴定方法,防止食源性李氏菌病的暴发,卫…     

食品中李斯特氏菌分离株的致病基因检测

１９９６－１９９７年我们对我省的七类食品共３００份进行了李斯特氏菌的污染调查，用ＧＢ４７８９．３０－９４的方法并分离出李斯特氏菌６株，用ＰＣＲ技术对分离菌株中李斯特氏菌的两种主要致病因子李氏溶血素 Ｏ（Ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ Ｏ， Ｈｌｙ）和内化素基因     

志贺氏菌iPaH基因PCR法检测结果

从业人员健康体检和临床腹泻病人都要做大便三线培养。但这种传统的细菌培养及生化鉴定方法 ,步骤较烦琐 ,出结果时间较长 ,血清凝集还有交叉凝集现象影响结果的判断。随着ＰＣＲ技术的发展和推广应用 ,我们用ＰＣＲ技术来验证和鉴定志贺氏菌。本文通过ＰＣＲ法检测ｉＰａＨ基因来验证肠道致菌病的属、种 ,以确定病原体。材料与方法1　菌株来源　菌株由市卫生防疫站于 1998年 5～ 10月份 ,从市一医院和儿童医院的腹泻患者中分离的菌株 ,小部分菌株由西湖区防疫站于 2 0 0 0年 4月份从西溪卫生院及本站的健康体检人群中分离得到。2　引物　引…     

单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测技术研究

目的建立快速检测单增李斯特菌的PCR-ELISA方法,将其应用于人工污染的食物样品检测。方法根据GenBank数据库资料,应用分子生物学软件DNAMAN6.0和Primer Premier5.0,以单增李斯特菌的致病基因hlyA为基础,选用PCR引物,应用地高辛标记试剂盒,获得单增李斯特菌特异的地高辛标记片段。根据PCR目的片段序列,设计特异性捕获探针,建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。应用该方法对不同血清型的单增李斯特菌食品分离株进行了检测,并将PCR方法与PCR-ELISA方法对人工污染单增李斯特菌的牛奶样品的检测敏感性进行了比较。结果应用单增李斯特菌特异的PCR-ELISA方法完成检测约需6h。该方法对单增李斯特菌分离株检测的结果,与国家食源性疾病检测网的鉴定结果100%符合。经过12h的增菌培养,PCR-ELISA方法最低可从25ml样品中检出1CFU,检测敏感性为传统PCR方法的10～100倍。结论建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。该方法敏感性高、特异性强、可靠性好,对于提高食源性疾病预警、预测能力,增强检测的时效性和准确性,具有推广应用价值。