食品中沙门菌实时荧光PCR快速检测方法的研究

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中沙门菌污染的快速敏感特异的检测方法。方法以沙门菌的fimY基因作为靶序列，设计一对引物和探针，以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板，优化引物和探针的浓度比和Mg^2＋浓度，以沙门菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性，并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0．8μmol／L，1．0μmol／L，Mg^2＋浓度为3mmol／L时，具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中，除沙门菌出现很好的阳性外，其余菌株均为阴性。在纯菌条件下，定量检测低限33cfu／ml。稳定性分析表明：同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5％。检测样品结果显示实时PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强，稳定性高，操作简便快捷，适应食品微生物检验发展需要，具有较大的推广及应用价值。     

疟疾四重巢式PCR检测方法的建立

目的建立一种能同时检测4种疟疾的多重巢式PCR检测方法。方法以4种疟原虫为研究对象,提取全血样本核酸,采用疟原虫18SSU r RNA作为分子标记,合成通用引物和4种疟原虫特异性引物,建立和优化四重巢式PCR反应体系。结果建立的方法在原虫之间无交叉反应,检测敏感性可达102copies/μl,经对随机选取的口岸发热样本进行检测,35份血液样本中,检出恶性疟13例、间日疟7例、卵形疟1例、以及恶性疟和间日疟的混合感染2例,阳性率为65.7%;比镜检的阳性率54.3%高,尤其是检出混合感染病例比例高,并对检测结果进行测序验证。结论建立的四重巢式PCR能同时检测4种不同疟原虫引发的疟疾,具有较高的特异性和敏感度,适合于口岸输入性疟疾的快速检测。     

实时荧光定量PCR快速检测对虾IHHNV载量方法的建立和应用

目的:建立一种快速、定量、特异、灵敏的PCR方法用于对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的早期诊断和疫情监测。方法:根据GenBank登录的IHHNV毒株序列,使用生物学软件进行序列比对,在IHHNV保守区序列设计特异性引物与Taqm an探针。对实时荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性、灵敏度、重复性,并与普通PCR进行盲样测试的比对。结果:本法线性范围5×102~5×107拷贝/ml,检出限5×101拷贝/ml,灵敏度超过普通PCR100倍,特异性高于普通PCR,重复性极好(S=0.035~0.39,CV=0.13%~1.05%),检测时间为普通PCR的1/5,现场盲样IHHNV检出阳性率高于普通PCR 26.00%。结论:本研究建立Taqm an实时荧光定量PCR用于对虾IH-HNV检测具有特异、灵敏、快速、定量、重复性好等优点。     

产毒真菌多重实时荧光PCR快速检测方法建立

目的建立一种能够在单体系中同时检测产黄曲霉毒素真菌及3种潜藏性产毒真菌的多重实时荧光PCR快速检测方法。方法分别根据产黄曲霉毒素真菌、赭曲霉、青霉和镰刀菌的蛋白活化基因aflR、ITS序列、β-微管蛋白编码区、LS rRNA,设计引物和探针,通过优化反应组分和反应条件,建立了可同时检测常见产毒真菌的实时荧光PCR方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行了分析。结果优化建立的反应体系对产黄曲霉毒素真菌、赭曲霉、青霉和镰刀菌的检测限分别可达到3.37×10⁴、1.91×10⁴、1.53×10⁴和3.95×10⁴拷贝/反应。结论本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法特异性强,灵敏度高,可在2 h内完成对产毒真菌的检测。     

TaqMan-实时荧光PCR快速检测副溶血性弧菌

[目的]建立TaqMan-实时荧光PCR快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)的方法,用于食物中毒快速诊断和食品中VP的污染状况调查。[方法]根据GenBank公布的VP tdh基因序列,设计引物和探针,建立TaqMan-实时荧光PCR快速检测体系,应用于食品中VP检测。[结果]TaqMan-实时荧光PCR快速检测体系灵敏度为1.3×104cfu/ml(33 cfu/PCR反应体系),特异性好,无交叉反应。[结论]TaqMan-实时荧光PCR检测体系灵敏度高,特异性强,能提高VP的检出率和准确性,可应用于VP食品污染状况调查和食物中毒的快速诊断。     

实时荧光定量PCR快速检测嗜水气单胞菌方法的建立

目的利用实时荧光定量PCR技术,建立一种快速、特异、灵敏、定量检测嗜水气单胞菌的方法,用于病人腹泻物或水产品病变部位目的菌的快速检测。方法以GenBank中嗜水气单胞菌WP3的溶血素基因(hlyA)为靶序列,设计引物与TaqMan探针,对模板DNA制备方法,PCR反应时间和温度进行优化,以嗜水气单胞菌ATCC7966和20株相关细菌考核检测体系的特异性、灵敏性和重复性。结果本方法检测时间仅需30min,定量线性范围5.4×103～5.4×108cfu/ml,与20株常见肠道细菌均无反应,对4个浓度的嗜水气单胞菌测定的批内标准差在0.08～0.14之间。结论成功建立实时荧光定量PCR检测嗜水气单胞菌方法,该方法可在半小时左右直接定量检测病人腹泻物或水产品病变部位中的嗜水气单胞菌,具有推广应用价值。     

河弧菌Taqman实时荧光PCR检测方法建立

目的 建立以Taqman实时PCR检测河弧菌的方法。方法 根据河弧菌toxR基因的保守序列设计引物和Taqman探针,建立检测河弧菌的实时PCR方法;对引物和探针的浓度进行优化,对优化后建立的方法分别进行实验室内的灵敏度和特异性评价,并与常规PCR比较。结果 建立了检测河弧菌的实时PCR方法,经优化该方法选择引物的浓度为100 nmol/L,探针浓度为200 nmol/L;该方法对纯菌的检测下限为4.17×10²cfu/mL,比常规PCR高1000倍;针对toxR基因建立的河弧菌实时PCR方法,对8种其他弧菌和肠道细菌的染色体无扩增。结论 建立的方法能够特异和敏感地检测河弧菌,可用于河弧菌的快速筛检。     

TaqManTM实时荧光PCR快速检测沙门氏菌的初步研究

[目的]建立实时荧光TaqManTM检测沙门氏菌的快速检测方法,为食物中毒快速准确的定性检测及食品中沙门氏菌染菌的调查提供手段,也为建立实时荧光TaqManTM同时检测多种细菌性食物中毒目标菌奠定基础. [方法]通过分析沙门氏菌invA、hilA、fimA、hns、spy、hut基因和16S rDNA等目的基因,对比不同目的基因的优缺点,最终选择hut基因作为目的基因,在Genebank进行中查找多条hut基因序列,并利用DNAssist软件进行同源性分析,选取相对保守区段,用Beacon Designer软件自行设计引物和TaqManTM探针,并利用硅胶模型基因组DNA提取法制备基因组DNA,通过对TaqManTM实时荧光PCR缓冲液浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、引物浓度和探针浓度等反应条件的优化,初步建立沙门氏菌的TaqManTM实时荧光PCR快速检测方法. [结果]选取的hut基因同源性达到99％以上,特异性好.通过对各实验条件的优化,得到沙门氏菌TaqManTM实时荧光PCR的最佳反应条件,初步建立TaqManTM实时荧光PCR检测沙门氏菌的快速检验方法,该方法能在1h内完成整个检测过程.[结论]TaqManTM实时荧光PCR检测不但灵敏度高、特异性好,而且检测周期短,能提高沙门氏菌的检出率和检测准确性,可望应用于沙门氏菌食品及食物中毒的快速定性检测.     

实时荧光PCR法检测b型流感嗜血杆菌

目的利用荧光定量PCR技术,建立b型流感嗜血杆菌的快速敏感特异的检测方法。方法以b型流感嗜血杆菌荚膜基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以b型流感嗜血杆菌菌株,提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和退火温度。以b型流感嗜血杆菌和8种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为800 nM、200 nM,退火温度为56℃时,具有良好的特异性和敏感性。在8株相关菌株的检测中,除b型流感嗜血杆菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,定量检测低限100 cfu/mL。稳定性分析表明:同一样品重复检测4次C t值的最大变异系数为5.46%。与常规方法比较,符合率达100%。结论该方法特异性强,稳定性高,操作简便快速,具有较大的推广及应用价值。     

食品过敏原荞麦的实时荧光PCR检测

目的:荞麦是日本法规要求强制性标识的食品过敏原,我国需要建立出口日本食品中过敏原荞麦成分的标准方法。方法:参考现有文献,采用实时PCR方法建立食品过敏原荞麦成分的检测方法。结果:研究表明建立的检测方法具有特异性,灵敏度高,检测限为1 mg/kg。结论:本方法适用于食品中过敏原荞麦成分检测。     

基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,检测基孔肯雅病毒。方法通过序列比对挑选出基孔肯雅病毒基因组中高度保守的序列,在此序列上设计引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR反应体系。结果经优化的荧光定量PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒标准品的灵敏度可达21拷贝/μl,通过检测与传播媒介相似的流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应。结论该方法的建立在基孔肯雅热的疾病防控方面有较好的应用前景。     

裂谷热病毒荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于裂谷热病毒的检测。方法通过序列对比在裂谷热病毒L基因保守区设计引物及Taqman探针,建立实时荧光定量PCR反应体系。结果经优化的荧光定量PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒标准品的灵敏度可达37拷贝/μl,通过检测同为蚊媒传播的日本脑炎病毒、黄热病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒无交叉反应。结论本方法的建立在国境口岸传染病的防控方面有较好的应用前景。     

新型冠状病毒双重荧光RT-PCR检测方法

目的为快速检测新型冠状病毒,防控疫情的输入,建立一种快速的双重实时荧光RT-PCR检测方法。方法对WHO公布的单重实时荧光RT-PCR检测引物和探针进行重新设计和优化,建立双重荧光RT-PCR反应体系,分别采用羧基荧光素(FAM)和绿色荧光蛋白(VIC)荧光基团标记探针,实现双基因的同时检测。结果经优化的双重实时荧光RT-PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒检测灵敏度为31拷贝/μl,检测健康和普通发热人员咽拭子以及流感病毒无交叉反应。结论建立了双重实时荧光RT-PCR快速检测方法,提高检测效率和准确度的同时降低了成本,可用于新型冠状病毒的快速应急检测。     

实时荧光定量PCR快速检测无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染

目的　探讨将实时荧光定量PCR（qPCR）检测细菌16S rRNA基因用于快速判断无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染,并评价其分析性能。方法　以细菌16S rRNA基因为目标设计通用引物、通用探针及革兰阴性（GN）菌探针,对14种标准菌株、20种临床菌株、白色念珠菌、乙型肝炎病毒(HBV)、人基因组及阴性对照进行qPCR检测,评价该方法引物和探针的通用性和特异性及检测限。以104 cfu/ml菌悬液、阴性对照的循环域（Ct）值99%置信区间下限分别作为尿路、其他无菌性体液细菌感染判定的分界值。用271例临床无菌性体液标本评价qPCR法的临床效能。结果　通用探针-qPCR,所有实验菌株检测为阳性。GN探针-qPCR,所有实验革兰阴性菌株检测为阳性。通用探针的检测限为1×101～1×102 cfu/ml。GN探针的检测限可低至1.0×101 cfu/ml。判定尿路、其他无菌性体液细菌感染的分界值分别为23.76、29.37。结论　应用细菌16S rRNA基因通用探针和GN探针的qPCR方法通用性好、特异性强、检测限低,可快速检测临床无菌性体液常见细菌感染,为临床提供准确、可靠的病原学诊断依据。     

实时荧光定量PCR快速检测细菌对抗菌素敏感性与耐药性表型的方法建立

目的 建立快速检测细菌对抗菌素的敏感性与耐药性表型的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。方法 用基于细菌16S rRNA基因通用引物和通用探针的qPCR检测大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌临床分离菌株基因组DNA,绘制生长曲线以确定细菌显著生长的最短培养时间。计算细菌在含和不含抗菌素的M-H肉汤中的相对生长率,以VITEK 2 Compact 全自动细菌分析系统的药敏结果为金标准,对细菌相对生长率进行ROC曲线分析,确定区分细菌对抗菌素敏感与耐药的相对生长率分界值。用20株肠杆菌科细菌和10株革兰阳性球菌临床分离菌株验证方法的可靠性。结果 细菌显著生长的最短培养时间为3小时。区分大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌对抗菌素敏感与耐药的相对生长率分界值分别为0.44、0.40和0.48本方法检测30株大肠埃希菌对3种抗菌素的敏感性和耐药性的准确度分别为98.4%和100.0%,30株金黄色葡萄球菌对3种抗菌素的敏感性和耐药性的准确度均为100.0%,30株铜绿假单胞菌对3种抗菌素敏感性和耐药性的准确度分别为60.0%和64.0%。20株肠杆菌科细菌和10株革兰阳性球菌对抗菌素的敏感性与耐药性结果的总准确度分别为92.7%和93.3%。结论 本方法能快速准确为临床提供肠杆菌科细菌和革兰阳性球菌对抗菌素的敏感性与耐药性表型,但对非发酵菌药敏结果的准确性不能满足临床要求。     

2011年北京市顺义区应用实时荧光PCR检测肺炎支原体检测结果分析

目的:通过对北京市顺义区2011年肺炎支原体(mycoplasma pneumonia,MP)实时荧光PCR检测数据进行分析,为支原体肺炎早期诊断及防控工作提供科学依据。方法:采用实时荧光PCR法对肺炎病例鼻咽拭子进行MP核酸检测。采用SPSS13.0对检测结果进行统计学分析。结果:117例肺炎病例中共检出MP核酸阳性18例,阳性率为15.38%。各季节、性别之间MP阳性率差异无统计学意义。分年龄组对MP阳性率进行比较,主要感染人群在35岁以下,差异具有统计学意义。结论:青少年为MP检测阳性的重点人群。MP感染与性别、发病季节无明显关系。实时荧光PCR检测对支原体肺炎的早期诊断和临床用药具有重要意义。     

复合探针荧光定量PCR法检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的建立用复合探针荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。方法研究根据鼠疫耶尔森氏菌pla基因的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,用于鼠疫的筛选和诊断。结果该检测方法的特异性为100%,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×101~1×106拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×102cfu/ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定3次及同一时间5次重复实验结果Cv值均<5%。结论本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,可对鼠疫耶尔森氏菌进行快速检测、准确辨别和早期诊断,对鼠疫的早期快速诊断具有重要意义。     

多重聚合酶链反应技术诊断疟疾及混合感染的研究

目的建立一种特异、敏感、简便的疟疾聚合酶链反应（PCR）快速诊断方法。方法针对疟原虫SSU rRNA基因序列设计3条分别具有属、种特异性的引物,通过多重PCR反应扩增间日疟原虫和恶性疟原虫不同大小的DNA片段。结果 19份恶性疟原虫血样均扩增出长度为400 bp的特定基因片段,16份间日疟原虫扩增出长度为300 bp的特定基因片段,20份健康人群对照血样经PCR扩增均为阴性。结论该多重PCR检测系统具有高效、敏感、特异、稳定、简便等特点,适宜于大批量样品同时检测,对疟疾的快速诊断、鉴别混合感染有较高的应用价值。     

荧光定量PCR快速检测幽门螺杆菌的研究

目的:建立一种快速检测幽门螺杆菌的荧光定量PCR方法。方法:根据每个幽门螺杆菌有一个拷贝的尿素酶A基因,设计并优化SYBGReen荧光定量PCR条件,评价荧光定量PCR的灵敏度与重复性;收集胃粘膜标本65份,并对其同时进行培养和荧光定量PCR检测。结果:该方法连续8个浓度模板良好线性关系(相关系数,0.997),灵敏度达1拷贝/微升;随机选取两个浓度的样本做重复试验,结果显示具有较高的重复性。65份标本中采用荧光定量PCR方法检出幽门螺杆菌42例(64.62%);细菌培养方法检出31例HP(47.69%)。结论:荧光定量PCR技术能够快速、准确检测幽门螺杆菌,适合于临床检测及科学研究。     

Evaluation of a real-time PCR assay for malaria diagnosis in patients from Vietnam and in returned travellers

Real-time PCR diagnosis of malaria has advantages over traditional microscopic methods, especially when parasitaemia is low and when dealing with mixed infections. We have developed a new real-time PCR with specific genes in each Plasmodium species present only in one copy to identify the four pathogenic Plasmodium spp. for humans. The sensitivity was less than 25 parasites/microl. No cross-hybridisation was observed with human DNA or among the four Plasmodium spp. Using LightCycler PCR and conventional microscopy, we compared the diagnosis of malaria in patients from Vietnam and in returned European travellers with suspicion of malaria. In patients from Vietnam with suspicion of malaria, one mixed infection was observed by PCR only; the remaining data (54 of 55 patients) correlated with microscopy. In 79 patients without symptoms, low parasitaemia was detected in 7 samples by microscopy and in 16 samples by PCR. In returned travellers, PCR results were correlated with microscopy for all four species in 48 of 56 samples. The eight discrepant results were resolved in favour of real-time PCR diagnosis. This new real-time PCR is a rapid, accurate and efficient method for malaria diagnosis in returned travellers as well as for epidemiological studies or antimalarial efficiency trials in the field.