胚胎体外共培养研究的进展

共培养是模拟早期胚胎在体内发育环境,延长体外发育时间,提高囊胚获得率的方法.因其可提高体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率,特别是提高反复种植失败(IF)者的妊娠率.尽管有不少争议,近年仍有较多与共培养有关的研究.对共培养系统的改进、应用、作用机制的探讨作介绍.     

人分泌早期子宫内膜共培养体系对早期鼠胚凋亡的影响

目的研究人分泌早期子宫内膜共培养体系对早期鼠胚凋亡的影响。方法将2一细胞期鼠胚与子宫内膜(A冻融、B传代)共培养以及单一培养液培养(C组)。72h后对桑椹期鼠胚用TUNNEL法进行凋亡检测。结果共培养组鼠胚的凋亡率明显低于单一培养组，且不受内膜细胞传代及冻融的影响；共培养组优质胚胎数均高于对照组，而共培养组之间无明显差异。结论共培养人分泌早期子宫内膜能减少早期鼠胚的凋亡，提高胚胎体外发育的质量，延长体外培养时间。     

人无血清输卵管上皮细胞模型与小鼠胚胎共培养的研究

目的了解２细胞期小鼠胚胎与人输卵管上皮细胞体外无血清共培养中的发育状况。方法配制无血清培养液,予小鼠超排卵并取２细胞期胚胎,将９０个２细胞期小鼠胚胎与人输卵管上皮细胞在无血清培养液中进行体外共培养,另以９０个同期胚胎在无辅助细胞的培养液中培养作对照,每日在显微镜下观察小鼠胚胎发育情况。结果共培养的胚胎有８２％发育到桑椹胚,７７％形成囊胚,６３％胚胎孵化。对照者仅４５％发育到桑椹胚,１３％到初级囊胚,无孵化胚胎。共培养胚胎发育速度快,碎片率明显低于对照者。结论人输卵管上皮细胞与小鼠胚胎共培养可以促进胚胎体外发育,并提高胚胎发育质量。     

人子宫内膜细胞共培养体系对早期鼠胚体外发育的影响

目的:研究人子宫内膜共培养体系对早期鼠胚体外发育的影响及移植后的妊娠情况。方法:将2-细胞小鼠胚胎与人子宫内膜细胞进行体外共培养,对照组为无营养细胞的单纯培养液,每日在显微镜下观察胚胎的发育情况。将培养到囊胚期的胚胎移植回小鼠的子宫腔,观察着床情况。结果:共培养体系中68.3％的2-细胞胚胎发育至桑椹胚期,50.8％发育至囊胚期,囊胚的孵化率为36.7％,胚胎的着床率为25.0％。而对照组只有24.8％的2-细胞胚胎发育至桑椹胚期,11.4％到达囊胚期,且其中大部分为早期囊胚即停止发育。另外对照组细胞碎片出现早且多,卵裂球不均匀,胚形态差,移植后胚胎的着床率仅为3.1％。结论:人子宫内膜细胞共培养体系可以促进小鼠胚胎的体外发育,改善胚胎的质量,提高着床率。     

应用颗粒细胞部分剥除法提高行体外受精-胚胎移植后胚胎质量及临床妊娠率的研究

行体外受精-胚胎移植（IVF—ET）后，约50％以上的胚胎发育至4～8细胞阶段，即发生阻断现象，胚胎不再继续发育。动物研究证明，应用颗粒细胞部分剥除法（即将保留的部分自体卵母细胞周围颗粒细胞与胚胎共培养），是克服体外胚胎发育阻断的有效方法，用于共培养的细胞可来自自体，也可来自异体。目前，有关研究报道较多的是选用输卵管上皮细胞，也有选用颗粒细胞的。本研究旨在探讨应用颡粘细胞部分剥除法在行常规IVF—ET中的应用价值。     

hCG共培养自体PBMCs宫腔灌注治疗反复种植失败及相关机制的研究

目的:探讨人绒毛膜促性腺激素(hCG)共培养自体外周血单个核细胞(PBMCs)宫腔灌注对反复种植失败(RIF)患者妊娠结局的影响及宫腔内相关细胞因子的改变。方法:选择在我院生殖中心行冻融胚胎移植(FET)的RIF患者65例,接受移植前自体PBMCs宫腔灌注治疗及取宫腔液的患者28例为实验组,于排卵前抽取自体外周血分离PBMCs,与hCG混合共培养于移植前3天行宫腔灌注;另外37例为对照组,两组患者行常规FET,随访妊娠结局;Bio-plex悬液芯片分析系统检测灌注前、后宫腔液相关细胞因子。结果:两组患者年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、基础性激素水平(FSH、LH、E_2)、既往移植周期数、平均内膜厚度和移植胚胎数比较,差异均无统计学意义(P0.05)。实验组与对照组比较临床妊娠率(42.86%vs 16.22%)和胚胎种植率(25.86%vs 9.21%),实验组均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。宫腔灌注后宫腔液中Eotaxin表达水平升高,而INF-γ表达降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论:宫腔灌注hCG共培养PBMCs是一项针对RIF患者安全有效的治疗方法,可以提高此类患者FET周期的临床妊娠率,改善RIF患者宫腔局部细胞因子的表达,促进胚胎种植。     

短时受精改变受精卵透明带结构?——一项前瞻性随机自身对照研究

目的:探讨不同精、卵共培养时间(6h、18h)对受精卵透明带(zona pellucida,ZP)和胚胎质量的影响。方法:21个周期258枚卵子随机分成6h(A组)和18h(B组)精、卵共培养作为自身对照,受精后20h偏振光显微镜摄像,分析A、B组间正常受精卵ZP厚度(ZP thichness,ZPT)、ZP密度(ZP density,ZPD)和胚胎质量的差异。结果:A组中正常受精卵ZP内层、全层厚度和内层密度分别为8.3±1.3μm,19.0±2.6μm和2.09±0.50nm,显著低于B组(8.9±1.5μm,19.6±2.7μm,2.2±0.7nm)(P<0.05);A组发育为可移植胚胎的受精卵ZPD(2.07±0.49nm)显著低于B组(2.26±0.72nm),而发育为不可移植胚胎的受精卵外层ZPTA组(9.1±2.5μm)高于B组(7.7±1.4μm),P<0.05;受精率、可移植胚胎率及优质胚胎率A组与B组间无统计学差异,但A组移植胚胎所占比率高(76.67%vs23.33%,P<0.05)。结论:短时受精使透明带变薄,这可能有利于胚胎的发育。     

巨噬细胞对卵巢癌细胞SKOV3生物学功能的影响

目的:研究巨噬细胞对卵巢癌细胞株SKOV3生物学功能的影响。方法:(1)体外采用IL-4和佛波醇酯(PMA)分别诱导M2和M1型巨噬细胞,流式细胞仪鉴定分型;(2)Tranwell小室建立巨噬细胞与卵巢癌细胞SKOV3体外非接触式共培养模型。比较共培养后,SKOV3的增殖和凋亡、迁移和侵袭的变化。MTT法检测增殖;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染检测凋亡;Transwell检测侵袭和迁移。结果:(1)IL-4诱导的巨噬细胞高表达CD163,为M2型,PMA诱导组高表达HLA-DR,为M1型。SKOV3和普通巨噬细胞共培养后,巨噬细胞CD163高表达。(2)SKOV3的增殖和凋亡:M2共培养组SK-OV3的增殖活性显著高于M1共培养组和普通共培养组(P<0.05)。M2共培养组SKOV3的凋亡率显著低于M1共培养组和普通共培养组(P<0.05)。(3)SKOV3的迁移和侵袭:M2共培养组SKOV3的侵袭能力显著强于M1共培养组和普通共培养组(P<0.01)。M2共培养组SKOV3的迁移能力显著强于M1共培养组和普通共培养组(P<0.05)。结论:共培养卵巢癌细胞使巨噬细胞M2表型极化。M2型巨噬细胞促进卵巢癌细胞增殖,提高侵袭、迁移能力,减少凋亡,而M1型起相反作用。     

一种胚胎体外培养的新方法:滴中孔培养法

目的:建立并优化一种胚胎体外培养的新方法——滴中孔培养法。方法:用圆头玻璃管在培养皿上烫出多个圆孔,作为滴中孔培养的专用平皿;收集牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)并在滴中孔培养专用平皿中进行体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和体外培养(IVC)。结果:①滴中孔培养法与群卵共培养的效果相似,而单卵培养明显降低了卵母细胞的发育能力(P<0.05)。②培养滴体积和培养密度对卵母细胞核成熟没有明显的影响,但显著影响胚胎的发育能力。在培养密度不变的情况下,培养滴体积太小显著削弱了胚胎的发育能力,而培养密度过小或者过大也削弱胚胎的发育能力(P<0.05)。结论:滴中孔培养法可以达到群卵共培养的效果。     

内皮祖细胞对卵巢癌细胞SKOV3生物学功能的影响

目的:通过在卵巢癌细胞SKOV3中使用血管内皮生长因子(VEGF)抗体贝伐单抗,了解脐血内皮祖细胞(EPCs)对卵巢癌细胞SKOV3增殖、迁移、黏附和凋亡能力的影响。方法:在成功建立EPCs和卵巢癌细胞SKOV3体外培育模型后,将实验分为SKOV3单独培养组(SKOV3组),SKOV3+EPCs共培养组(SKOV3+EPCs组),SKOV3+100μg/ml的贝伐单抗共培养组(SKOV3+贝伐单抗组)和SKOV3+EPCs+100μg/ml的贝伐单抗共培养组(SKOV3+EPCs+贝伐单抗组),并比较4组SKOV3的增殖、凋亡、迁移和黏附能力的变化。结果:①SKOV3+EPCs组SKOV3的增殖能力、穿膜细胞数和OD值高于SKOV3组(P0.05,P0.01);②SKOV3+贝伐单抗组SKOV3的增殖能力、穿膜细胞数、凋亡率低于SKOV3组(P0.05,P0.01):③SK—OV3+EPCs+贝伐单抗组SKOV3的增殖活性、穿膜细胞数、凋亡率低于SKOV3+EPCs组(P0.05,P0.01),而OD值显著高于SKOV3+EPCs组(P0.01)。结论:共培养条件下EPCs能促进SKOV3生物学功能,贝伐单抗则相反,EPCs能协同贝伐单抗抑制SKOV3的生物学功能。     

盐酸克仑特罗对小鼠胚胎体外发育的影响

目的:探讨盐酸克仑特罗对小鼠1-细胞胚胎和2-细胞胚胎体外发育的影响。方法:获取小鼠1-细胞和2-细胞胚胎,分别与盐酸克仑特罗10 ng/mL,3 ng/mL和1 ng/mL的3个剂量组共培养,观察胚胎各阶段的发育情况并计算胚胎的发育率。结果:1ng/mL和3ng/mL组的1-细胞小鼠胚胎,从4-细胞期到囊胚阶段的发育率与对照组相比差异显著(P<0.05),3 ng/mL组显现出比1ng/mL组更强的抑制作用(P<0.01),10 ng/mL组,2-细胞期就与对照组有差异(P<0.05,其中 4-细胞至囊胚阶段P<0.01),囊胚率只有2.4％。10 g/mL组及3 ng/mL组的2-细胞小鼠胚胎,分别从4-细胞期和8-细胞期与对照组相比差异显著(P<0.05),1 ng/mL组的各个阶段胚胎发育率与对照组相比未见统计学差异(P>0.05)。培养液中含有盐酸克仑特罗使胚胎的粗颗粒增多,部分印裂球碎裂、退化。结论:盐酸克仑特罗对小鼠胚胎的体外发育有毒性作用并呈一定的剂量效应。盐酸克仑特罗使1-细胞小鼠胚胎被抑制在2-细胞期,对处于晚2-细胞期胚胎的影响明显降低。     

输卵管上皮细胞共培养技术对受精卵体外发育的影响及临床应用价值

目前 IVF-ET的成功率仍较低 ,主要是由于胚胎过早移植入宫腔所致。输卵管上皮细胞共培养体系可以延长胚胎的体外培养时间 ,提高发育至囊胚期的胚胎数 ,从而提高IVF-ET成功率 ,减少多胎妊娠。     

二甲双胍辅助克罗米芬用于多囊卵巢综合征促卵泡发育的效果观察

目的:探讨二甲双胍辅助克罗米芬对多囊卵巢综合征(PCOS)患者促卵泡发育的效果。方法:选择PCOS患者150例,随机分为A、B、C3组,A组(50例)口服克罗米芬;B组(50例)口服二甲双胍;C组(50例)口服克罗米芬和二甲双胍。3组用药时间均为12周,比较用药前后空腹血胰岛素和血睾酮及卵泡发育率的变化。结果:B组和C组患者治疗后血胰岛素及睾酮均下降,治疗前后比较,差异有显著性(P <0.05),C组治疗后卵泡发育率为89%,明显高于A组的59%和B组的34%,差异也有显著性(P <0.05)。结论:二甲双胍能有效降低PCOS患者的胰岛素抵抗,与克罗米芬合用能提高卵泡发育率。     

卵巢上皮癌细胞SKOV3通过分泌外泌体促进单核巨噬细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞的研究

目的:研究上皮性卵巢癌细胞SKOV3分泌的外泌体(exosomes)能否调控单核巨噬细胞分化为M2型肿瘤相关巨噬细胞(TAMs),并进一步参与肿瘤的转移。方法:分离SKOV3细胞外泌体,透射电镜观察形态。卵巢癌细胞外泌体、M-CSF+IL-4和空培养基分别与人外周血CD14+单核细胞共培养3天,观察细胞形态。结晶紫计数单核细胞贴壁率;流式细胞仪检测共培养后单核细胞CD206、HLA-DR的表达情况;ELISA法检测共培养后上清中IL-10和IL-12的含量;体外迁移实验检测肿瘤细胞迁移能力的变化。结果:透射电镜显示,外泌体近似圆形,直径30~80nm。结晶紫计数显示,外泌体共培养组和M-CSF+IL-4组的OD值(分别为0.13±0.06,0.16±0.04)较空培养基组(0.04±0.01)增加,差异有统计学意义(P0.05)。倒置显微镜发现,细胞贴壁,形态类似巨噬细胞。流式结果显示,外泌体共培养组和M-CSF+IL-4组的单核细胞CD206(分别为71.86±5.62、99.27±0.32)表达水平升高,HLA-DR(分别为12.71±7.22、3.55±0.27)表达水平降低,与空培养基组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。ELISA检测结果显示,外泌体共培养组和M-CSF+IL-4组的上清IL-10含量(分别为71.72±0.81、82.13±2.11)增加,IL-12含量(分别为34.88±4.75、19.71±4.28)减少,与空培养基组比较,差异有统计学意义(P0.05)。体外迁移实验显示,外泌体刺激单核细胞上清组的肿瘤细胞迁移数(121.58±2.25)明显增加,分别与空培养基对照组、单核细胞上清组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论:卵巢上皮癌细胞SKOV3的外泌体可诱导单核巨噬细胞分化极化为卵巢癌腹膜内TAMs表型,从而促进卵巢癌细胞的迁移能力。     

子痫前期血清对滋养-平滑肌细胞共培养体系平滑肌细胞凋亡的影响

目的:探讨子痫前期血清对细胞滋养细胞-平滑肌细胞共培养体系平滑肌细胞凋亡的影响。方法:采用组织块贴壁法培养人早孕期细胞滋养细胞(CTB)和人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC),传代后建立滋养细胞与人脐动脉平滑肌细胞共培养模型并分别加入正常和子痫前期患者静脉血清培养24h,并设立相对应的单培养组;Transwell小室检测CTB的侵袭能力;细胞计数试剂盒(CCK-8)测定HUASMC活力;Annexin V-FITC检测HUASMC凋亡率;RT-PCR检测滋养细胞FasL mRNA与HUASMC的Fas mRNA的表达;W estern blot检测HUASMC的Fas蛋白的表达。结果:子痫前期患者血清能显著降低共培养体系中CTB的侵袭能力,上调HUASMC活力,降低HUASMC早期凋亡率、FasmRNA和Fas蛋白的表达。结论:子痫前期血清可能通过降调细胞滋养细胞-平滑肌细胞共培养体系滋养细胞的侵袭能力,降调共培养体系HUASMC Fas的表达,从而抑制HUASMC凋亡。     

北京市0~6岁儿童智力低下的现患率调查

目的了解北京市0~6岁儿童视力、听力、肢体、智力、精神残疾的现患率及其分布特征，重点考察智力低下儿童(残疾)的现患及分布特点。方法2003 07—2004 11北京市残疾人联合会、北京市卫生局联合组织采用概率比例、二阶段分层整群抽样的方法进行现况调查，使用丹佛发育筛查测验及Gesell发育诊断量表进行智力筛查和诊断，采用SPSS100软件对数据进行统计分析。 结果北京市0~6岁儿童智力低下现患率为931‰，城市为760‰，农村1037‰，男童(1124‰)高于女童(725‰)(χ2=1242，P<001)，现患率有随年龄增长而增高的趋势(趋势χ2=2358，df=6,P<001)，智力低下严重程度构成分别为轻度6554%、中度2097%、重度599%、极重度749%。 结论北京市儿童智力低下的防治应以轻度类型为主，重点在农村地区；北京市需结合世界发达国家的经验，建立自己的智力低下监测、防治体系。     

溶血磷脂酸在卵母细胞体外成熟过程中作用的研究进展

卵母细胞体外成熟(IVM)已成为一项热门的辅助生殖技术(ART),有广泛的应用和发展前景。但其体外成熟率和受精后的发育能力还有待提高,培养条件需要进一步优化。溶血磷脂酸(LPA)是磷脂激素家族的重要成员,有生长因子和激素样活性,可产生广泛的生物学效应。研究表明LPA存在于卵泡液中,对卵泡发育、卵母细胞IVM、受精、胚胎发育、种植等产生重要作用。本文就LPA特性及其在卵母细胞体外成熟过程中的作用做一简要的阐述。     

改良原核评分法—Z评分法的临床应用

体外受精-胚胎移植(IVF-ET)和卵胞浆内单精子显微受精(ICSI)是治疗不孕不育的重要手段。选择发育潜能最好的胚胎移植以稳定临床妊娠率、提高活产率、降低多胎率是研究的焦点。卵裂期胚胎评分联合原核期评分法是目前最适宜的胚胎选择方法,本文现就原核期胚胎评分-Z评分法的临床应用做一综述。     

大卵泡穿刺抽吸用于GnRH-a长方案卵泡发育不同步时对IVF-ET结局的影响

目的:探讨GnRH-a长方案周期中出现卵泡发育不同步患者采用大卵泡穿刺抽吸治疗后对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠结局的影响.方法:对64例GnRH-a长方案周期中出现卵泡发育不同步患者的临床资料进行回顾性分析,根据促性腺激素(Gn)启动10日内是否进行大卵泡穿刺抽吸治疗分为穿刺抽吸组(31例)和未穿刺抽吸组(33例),比较两组患者启动Gn4～6天和启动Gn 7—10天卵泡发育不同步情况、促排卵用药情况及妊娠结局,以及未穿刺抽吸组患者取卵时卵泡中有卵子和无卵子(即囊肿)情况及其临床妊娠率的比较.结果:①两组启动Gn 4～6天和启动Gn 7～ 10天时,出现卵泡发育不同步情况比较,差异无统计学意义(P＞0.05).②两组患者GnRH-a剂量、GnRH-a天数、Gn天数、Gn总量、HCG日内膜厚度、HCG日E2/P值、获卵数、获卵率、成熟卵数、成熟卵率、优质胚胎数、临床妊娠率和流产率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).③未穿刺抽吸组患者仅依靠Gn使用的调整,取卵日大卵泡中有卵子与证实为囊肿的患者的临床妊娠率比较,差异无统计学意义(P=1.000).结论:卵泡的不同步发育可以发生在GnRH-a长方案控制性超促排卵的不同时间,出现卵泡发育不同步现象不需要中途进行穿刺抽吸治疗,其与通过调整Gn的使用来调节卵泡的发育而获得的妊娠结局相同.     

苯丙酮尿症患儿脑髓鞘发育延迟与血苯丙氨酸浓度关系的研究

目的应用MRI观察苯丙酮尿症(PKU)患儿脑髓鞘发育延迟与血苯丙氨酸(PHE)浓度的关系。 方法对2002—2004年北京中日友好医院PKU门诊确诊的经典型PKU患儿29例，治疗前进行头颅MRI及血苯丙氨酸浓度检查，脑髓鞘发育按Staudt标 准对不同年龄阶段患儿脑10个区域进行量化评估。HPLC法定量测定血PHE浓度。根据开始接受治疗年龄不同分为甲(28~48周，11例)、乙(49~390 周，18例)两组,另随机选取其中19例治疗１年后复查MRI进行治疗前后对照,根据该19例治疗中血苯丙氨酸浓度控制情况分为A组(血PHE控制在 0.12~0.48mmol/L)和B组(血PHE控制在0.12~0.48mmol/L以外)。 结果29例患儿治疗前均存在髓鞘发育延迟,在10个脑区域髓鞘发育延迟平均发生率为45.6%，主要部位在脑叶和胼胝体,其中甲组髓鞘发育延迟平 均发生率为40.8%,乙组发生率为51.2%,甲乙组间差异有显著性意义(P<0.05);经低苯丙氨酸饮食治疗1年后,19例10个脑区域髓鞘发育延迟平均发 生率为32.2%;治疗前后髓鞘延迟有显著性改善(P<0.01),且治疗中血PHE浓度控制较好的A组髓鞘延迟改善率为1.75±0.66,B组病例为0.78± 0.44,差异有显著性(P<0.01),髓鞘延迟改善与血PHE浓度间有密切相关性。 结论治疗延迟的PKU患儿的脑髓鞘发育延迟的高发病率，与高血PHE浓度影响时间有关;经低苯丙氨酸饮食治疗延迟的改善率，与治疗中血PHE浓 度控制情况直接影响延迟改善,因此提示PKU患儿血PHE浓度是影响脑髓鞘发育延迟发生及改善的重要原因。