利用体外定点诱变技术构建人突变型α-L-艾杜糖醛酸酶基因

【目的】构建突变型α L 艾杜糖醛酸酶基因 (IDUA)cDNA ,为体外表达、鉴定突变的性质提供物质基础。【方法】以野生型pcDNA3 IDUA为基础质粒 ,采用双引物法体外定点诱变技术 ,引入突变E40 4X。【结果】突变区域经PCR SSCP和测序证实诱导突变成功。【结论】本研究成功构建了突变型IDUAcDNA ,可用于下游的体外表达 ;此定点突变技术具有简便、诱变效率高等优点 ,是体外构建突变型基因的一种有效方法。     

HO—1基因的亚克隆及策略

目的：为了获得血红素氧化酶－1基因的cDNA片段表达载体。方法：从正常鼠脾细胞提总RNA进行RT－PCR、分子克隆，并进行自动测序。结果：分离并鉴定了该cDNA重组子，成功的将血红素氧化酶－1基因亚克隆到pcDNA3.1真核表达载体上。结论：建立了一个编码血红素氧化酶－1基因cDNA重组子（762bp)的真核表达载体。     

人骨骼肌TnI-fast基因克隆和体外表达

目的：构建人骨骼肌TnI-fast基因分泌型真核表达载体，为利用TnI-fast基因进行抗肿瘤血管生成基因治疗奠定基础。方法：采用PCR和RT－PCR制备TnI-fast cDNA，构建TnI-fast基因克隆质粒，测序证实后将TnI-fast cDNA插入到pSecTag2B构建分泌型重组真核表达质粒。然后用TnI-fast基因重组表达质粒转染COS－1细胞，检测TnI-fast基因体外表达。结果：DNA测序证实，我们从人骨骼肌总RNA和cDNA文库中扩增的TnI-fas cDNA序列与NCBIGenebank TnI-fast cDNA序列完全一致。ELISA检测证实，TnI-fast/pSec Tag2 B转染后目的基因可在真核细胞中分泌表达。结论：本研究成功地构建了TnI-fast基因重组表达质粒，可进一步用于抗肿瘤血管生成基因治疗动物实验。     

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1—polβ的构建

目的：构建含突变型polβ基因重组表达载体。方法：从食管癌标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,克隆入pCDNA3．1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒,并进行测序。结果：测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论：成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体,可应用于下游研究。     

中国人粘多糖贮积症I型IDUA基因突变的检测

目的：检测中国人粘多糖贮积症I型患IDUA基因（IDUA）突变。方法：采用PCR－SSCP、PCR产物直接测序等技术对35例粘多糖贮积症I型患的IDUA第2、6、7、8、9和10外显子相邻区域进行突变筛查。结果；本研究筛查出7种突变，均为单碱基置换。一内含子区突变nt1486C→T；一中性突变nt945G→C；1种无义突变E404X；4种错义突变：F198L、L218V、A361T和V454I。结论：中国人IDUA在第2、6、7、8、9和10外显 子区存在突变。在上述检测到的7种突变中，A361T国外已确定为多态性，E404X国外已报道为重型突变。而nt1486C→T、F198L和L218V和V454I为我们首次发现和报道，可能为新突变，但其突变性质还有待于进一步鉴定。     

小鼠共刺激分子B7-1的分子克隆、测序与真核表达载体的构建

目的：克隆小鼠共刺激分子B7－1基因，测序并构建其真核表达载体。方法：从小鼠脾组织中提取总RNA，用RT－PCR方法将B7－1的DNA扩增出，克隆到真核表达载体pcDNA3中，测定其cDNA序列。结果：测序结果表明我们克隆的B7－1基因序列与GenBank中序列有1个碱基不同，所编码的氨基酸发生突变。结论：已成功构建小鼠B7－1的真核表达载体，为进一步应用B7－1进行肿瘤基因治疗打下基础。     

p53 cDNA突变和突变型p53蛋白表达与大肠癌预后的关系

目的 探讨p53基因cDNA突变和突变型p53基因蛋白表达与大肠腺癌预后的关系。方法 RT-PCR-SSCP检测大肠腺癌组织p53基因cDNA突变,PAb240单抗免疫组化检测大肠腺癌组织突变型p53基因蛋白表达,比较两者与大肠腺癌预后的关系。结果 100例大肠腺癌中,p53基因cDNA突变51例（51%）,突变型p53基因蛋白高表达76例（76%）,两者同步阳性49例;p53基因cDNA突变与突变型p53基因蛋白高表达相关,有显著统计学差异（P<0.01）;与Dukes分期无关（P>0.05）。从Kaplan-Meier 生存曲线和log-rank 分析结果看,突变型p53基因蛋白高表达与大肠腺癌预后无显著统计学差异（P=0.72）;p53基因cDNA突变与大肠腺癌预后有关,统计学差异明显 （P=0.03）。结论 p53基因cDNA突变与突变型p53基因蛋白高表达密切相关。高频率p53基因cDNA突变直接反映大肠腺癌预后差。突变型p53基因高表达则可能受多因素影响,不能直接反映大肠腺癌预后。     

c—erbB—2反义核酸真核表达载体pDOR—AE的构建及鉴定

许多研究表明，c－erbB－2在腺癌，特别是在乳腺癌、胃癌和卵巢癌中的表达明显增高．这些高表达与肿瘤的生长和转移有着密切的关系．反义核酸技术是近年发展起来的抑制有害基因表达的新技术，利用这一技术已在体外使多种肿瘤细胞的生长受到了抑制．为探讨c－erbB－2反义核酸对胃癌细胞生物学行为的影响，本研究拟构建c－erbB－2反义核酸的真核表达载体PDOR－AE．1材料和方法1．l材料含有c－erbB－2基因。DNA全长的质粒PSVZerBZ由美国Anderson癌症研究中心的Hung教授惠赠，4．4kb的c－erbB－2cDNA克隆在pSVZ的Hind皿位点；PDIR…     

白血病细胞株KG-1中Mxi1基因突变的检测和表达载体的构建

目的 检测白血病细胞株KG-1中Mxil基因SID和bHLHzip区突变情况并构建Mxi1基因的野生型和突变型真核表达载体,观察其转染真核细胞后基因表达的情况。方法 应用RT-PCR和SSCP分析KG-1细胞株Mxil基因的突变,将Mxi1野生型/突变型基因cDNA插入到pDs-red2-N1质粒中,构建pDs-red2-N1/Mxi1(野生型/突变型)真核表达载体,采用脂质体方法将质粒转染COS-7细胞,流式细胞仪检测红色荧光蛋白表达并计算转染效率。RT－PCR检测转染后Mxi1基因的表达。结果 Mxi1基因突变位于Helix II区第82编码子的CAT/TAT(His/Tyr)。成功构建pDs-red2-N1/Mxi1(野生型/突变型)真核表达载体,经酶切、电泳可以看到在4700、1845bp存在两条电泳条带, Mxi1基因在COS 7细胞中得到表达,转染后COS-7细胞红色荧光蛋白表达的阳性细胞为18.07％,表达高峰出现在转染后第3天,并可持续表达6d左右。结论 Mxi1基因的高度保守区域bHLHzip存在基因突变,Mxi1突变基因的真核表达载体构建成功,并成功转染真核细胞COS-7     

人类免疫共刺激信号B7-2分子逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建含B7－2基因片段的克隆载体pGEM-B7-2和表达载体pLSN-B7-2。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法从人类慢性淋巴细胞白血病Raji细胞株中扩增到人B7－2cDNA基因片段，并经回收纯化酶切后，分别连接到质粒pGEM-Teasy和pLXSN上。结果：琼脂糖凝胶电泳及序列测定证实，扩增的B7－2cDNA片段的碱基组成与Genebank提供的人B7－2cDNA的基因组成相同。结论：酶切证实成功构建得了克隆载体pGEM-B7-2和表达载体pLSN-B7-2,为将B7－2基因转导到肿瘤细胞制备肿瘤疫苗以及研究免疫细胞间相互作用、肿瘤细胞逃避免疫监视的机制奠定了基础。     

Bβ448野生型及突变型纤维蛋白原稳定转染细胞系的建立

目的构建野生型(BβArg448)和突变型(BβLys448)纤维蛋白原稳定表达细胞系,为进一步研究BβArg448Lys基因多态性的病理生理学意义及相关蛋白功能研究提供实验基础。方法以含纤维蛋白原野生型Bβ链cDNA全长的表达载体pMLP-FGB(448G)为模板,采用PCR定点突变技术构建BβLys448表达载体,即突变型质粒pMLP-FGB(448A)。应用脂质体转染及药物加压筛选的方法,将纤维蛋白原Aα链、野生型/突变型Bβ链、γ链表达载体共同转染至CHO-K1细胞,RT-PCR检测各条链mRNA的表达。结果野生型及突变型纤维蛋白原稳定转染细胞系在转录水平构建成功。结论野生型及突变型纤维蛋白原稳定转染细胞等在转录水平构建成功,为进一步体外研究BβArg448Lys所致纤维蛋白原的结构与功能异常奠定了基础。     

人MUC-1全长cDNA基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

目的 构建含人MUC－1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察其在COS－7细胞中的表达。方法 将目的基因MUC－1克隆入pGEM-3zf(-)载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pcDNA3.1( )，构建真核表达载体pcDNA3.1( )-MUC-1。用电穿孔法将重组质粒转入COS－7细胞，以免疫荧光和流式细胞仪检测MUC－1的表达。结果 酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人MUC－1全长cDNA编码序列，转染实验表明MUC－1基因能在COS－7细胞中表达。结论 人MUC－1全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS－7中的表达均获成功，为基因疫苗的进一步研究奠定了基础。     

HBcAg显性失活突变体质粒的构建及体外表达

目的：探讨HBcAg显性失活突变体质粒pCDNA4-C-GFP的构建及体外表达。方法：选择编码乙肝核心抗原C基因片段及绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)基因片段，利用基因重组技术构建成DNA质粒pCDNA4-C-GFP,并将该质粒转染肝癌细胞株HepG2。结果：通过RT－PCR检测到其RNA的表达，Confocal观察到GFP绿色荧光。结论：HBcAg显性失活突变体质粒pCDNA4-C-GFP的构建成功可以进行对HBV作用的研究。     

鼠白细胞介素-12双亚基共表达质粒的构建及在体内外的表达

目的：构建双亚基共表达鼠白细胞介素－12（mIL-12）真核表达质粒，并观察其在体内外的表达。方法：将mIL-12p35和p40全长编码cDNA构建在pcDNA3.1载体上，然后把p35表达单元（CMV－p35－BGHPA）插入pcDNA3.1/p40载体，使两个目的基因均受各自的启动子CMV控制，构建成mIL-12双亚基共表达质粒pCmIL-12，并进行体内外表达。结果：pCmIL-12在体外转染COS－7细胞后，经ELISA证实有mIL-12表达，其表达上清能在体外明显增强小鼠NK细胞活性。小鼠皮内注射pCmIL-12亦能增强小鼠NK细胞活性。结论：所构建的质粒在体内外均能表达有生物学活性的mIL-12。     

人酪氨酸酶相关蛋白-2的cDNA克隆及表达

目的 克隆酪氨酸酶相关蛋白－2（TRP－2）编码基因，表达TRP－2蛋白。方法 从培养的人黑素细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，通过PCR方法扩增TRP－2编码基因，克隆至pUC19载体并测序，再亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融全表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达TRP－2／GST融合蛋白。结果 从培养的人黑素细胞中扩增出编码TRP－2的cDNA，序列测定证实与文献报道的序列一致；成功构建了GST融合表达载体pGEX-4T-1/TRP-2,表达了TRP－2／GST融合蛋白。结论 成功克隆了人TRP－2基因，构建了GST融合表达载体并表达了TRP－2／GST融合蛋白。     

应用非同位素PCR—SSCP方法检测乳腺癌p53基因点突变

目的 探讨乳腺癌组织中p53基因点突变。方法 应用非同位素PCR－SSCP技术检测48例石蜡包埋乳癌组织中,p53基因点突变。结果 48例乳腺癌中20例出现异常电泳,表明这些病例相应DNA片段中发生了点突变,其中8例位于第5－6外显子,9例位于第7外显子,3例位于第8外显子。免疫组化检测突变p53蛋白的表达25例为阳性（52％）,其中5例SSCP未发现基因突变,突变可能发生在所检测的基因片点以外。结论 非同位素PCR－SSCP是一简便、快速、有效的检测基因点突点的方法,特别适用于大量标本基因点突变的筛选;p53基因点突变与突变型蛋白表达呈相关关系。     

白细胞介素—6相关新基因的生物学分析

目的：通过白细胞介素－6（IL－6）相关新基因的生物学分析，研究IL－6的作用机制。方法：利用IL－6相关表达序列标签（EST）进行电子克隆获得924bp全长新基因，后采用RT－PCR方法从IL－6激活的人U937细胞所提的总RNA中钓取，此片断连到pGEM-Teasy质粒上并测序。结果：成功钓取了IL－6相关EST电子克隆的全长cDNA基因。结论：使用电子克隆技术对于发现新基因有重要的指导意义。     

单顺反子表达人GM—CSF和B7．1融合基因自核表达载体的构建和鉴定

目的 构建单顺反子表达人GM-CSF和B7．1融合基因真核表达裁体。方法 应用巨引物PCR技术对hGM-CSF基因cDNA进行定点突变；应用PCR重叠延伸法，将hGM-CSF和hB7，1基因的cDNA编码序列通过一1inker序列拼接，构建hGM-CSF与hB7．1融合基因hGM-B7．1，将其插入pcDNA3真核表达裁体，测定核苷酸序列。结果 序列分析表明：(1)hGM-CSF突变体基因cDNA编码序列的178位核苷酸由C变为A，其余核苷酸序列均未发生变化；(2)hGM-CSF、1inker、hB7.1的连接顺序、方向及序列完全正确。结论 构建pcDNA3-hGM-B7.1融合基因真核表达载体成功。     

利用PCR技术构建GM—CSF／Feγ2^—融合蛋白真核表达载体

目的 对融合基因GM－CSF／Feγ2^-进行定点突变,去除其补体结合位点,构建GM－CSF／Feγ2^-融合蛋白真核表达载体。方法 通过设计突变引物,利用PCR定点突变技术扩增融合基因GM－CSF／Feγ2^-。并通过T－A克隆策略,把突变后的融合基因GM－CSF／Feγ2^-重组到真核表达载体pRc/CMV2中,构建真核表达质粒pRc/CMV2/GM－CSF／Feγ2^-并经过酶切和测序确证。结果 成功对融合基因GM－CSF／Feγ2^-进行突变,构建了真核表达载体pRc/CMV2/GM－CSF／Feγ2^-。结论 利用该PCR方法进行基因定点突变可行。     

p^53cDNA突变和突变型p^53蛋白表达与大肠癌预后的关系

目的 探讨ｐ＾５３基因ｃＤＮＡ突变和突变型ｐ＾５３基因蛋白表达与大肠腺癌预后的关系。方法 ＲＴ－ＳＳＣＰ检测大肠腺癌组织ｐ＾５３基因ｃＤＮＡ突变，ＰＡｂ２４０单抗免疫组化检测腺癌组织突变型ｐ＾５３基因蛋白表达，比较两者与大肠腺癌预后的关系。结果 １００例大肠腺癌中，ｐ＾５３基因ｃＤＮＡ突变５１例（５１％），突变型ｐ５３基因蛋白高表达７６例（７６％），两者同步阳性４９例：ｐ＾５３基因ｃＤＮＡ突变与突