应用COXⅠ基因PCR-RFLP对我国旋毛虫地理株的鉴定

目的对我国旋毛虫不同地理株进行分子鉴定。方法根据旋毛虫线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（cytochromec-oxidase subunitⅠ,COXⅠ）基因序列合成1对引物,以旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）、乡土旋毛虫（T.nativa,T2）、布氏旋毛虫（T.britovi,T3）、伪旋毛虫（T.pseudospiralis,T4）、纳氏旋毛虫（T.nelsoni,T7）的国际参考株作为对照,应用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-restrictionfragment length polymorphism,PCR-RFLP）技术对我国7个猪源旋毛虫地理株（河南、湖北、云南、西安、哈尔滨、同江及天津株）进行分子鉴定。结果T1、T2、T3、T4、T7和我国7个猪源旋毛虫地理株的COXⅠ基因均扩增出419 bp的片段,PCR扩增产物Tru1Ⅰ（MseⅠ）酶切后经RFLP分析,T2、T3、T4、T7和天津株均具有独特的酶切带型：T2为22、70和327 bp,T3为92和327 bp,T4为419 bp,T7为62、64、70和223 bp,天津株为92、126和201 bp;其他6个地理株的酶切带型和T1一致,为22、70、126和201 bp。结论我国7个旋毛虫地理株的COXⅠ基因片段（92、70和22 bp）存在种内多态性;河南、湖北、云南、西安、哈尔滨及同江株可归为一类,天津株可归为另一类。     

应用多重PCR技术鉴定我国6个旋毛虫地理株的研究

目的 对我国猪源旋毛虫地理株进行鉴定和分类。 方法 根据旋毛虫rDNA扩展片段V区（expansion segment V region,ESV）和内转录间隔区（internal transcribed spacers,ITS）ITS1和ITS2基因序列合成5对特异性引物,以旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）、乡土旋毛虫（T. nativa,T2）、布氏旋毛虫（T. britovi,T3）、伪旋毛虫（T. pseudospiralis,T4）及纳氏旋毛虫（T. nelsoni,T7）的国际参考株作为对照,应用多重PCR对我国6个猪源旋毛虫地理株（河南、云南、哈尔滨、黑龙江同江、湖北及天津）进行鉴定,并观察影响多重PCR扩增的因素。 结果 我国6个猪源旋毛虫地理株多重PCR扩增结果显示,均具1条与T1相同的条带（173 bp）。应用多重PCR对单条旋毛虫幼虫、不同保存条件的旋毛虫幼虫及含幼虫的新鲜小鼠肌肉提取液进行扩增,均得到173 bp的特异性条带。 结论 经多重PCR鉴定我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1。     

ISSR-PCR对我国旋毛虫7个地理株的分子鉴定

目的探讨对不同种和地理株旋毛虫进行分子鉴定。方法利用简单重复序列区间-PCR(inter simple sequencerepeat-PCR,ISSR-PCR)标准引物对5种旋毛虫及我国旋毛虫7个地理株基因组DNA进行扩增,并观察影响扩增效果的因素。结果5种旋毛虫均分别扩增出了各自的特异性条带:旋毛虫(T1)2条(950bp和850bp),乡土旋毛虫(T2)1条(850bp),布氏旋毛虫(T3)3条(1 300bp、950bp和700bp),伪旋毛虫(T4)1条(600bp),纳氏旋毛虫(T7)有4条带(1 700bp、1 450bp、1 050bp、900bp)。我国有6个猪源旋毛虫地理株均扩增出了与T1相同的2个特异性条带(950bp、850bp)。此外,T1、河南株、云南株、哈尔滨株、黑龙江同江株还扩增出了另外2条弱带(500bp和400bp);但湖北株和天津株则无这2条弱带,湖北株扩增出了1 350bp的条带,天津株扩增出了1 600bp的条带。非猪源的广西株与T1相比,缺少950bp的条带。对1条旋毛虫肌幼虫,在80%酒精保存24w的肌幼虫,在10%甲醛、0.2%叠氮钠及0.05%柳硫汞溶液保存9 w的肌幼虫,应用ISSR-PCR均可扩增出其特异性条带。结论ISSR-PCR用于旋毛虫种的分子鉴定具有良好的稳定性和敏感性;我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1,其中云南株、河南株、哈尔滨株及黑龙江同江株可归为一类,湖北株和天津株可归为另一类,来自果子狸的广西株分类地位待定。     

我国首次发现乡土旋毛虫的研究报告

目的 :对我国两株旋毛虫进行虫种归属鉴定。方法 :通过生物学特性的比较研究。结果 :单对虫体杂交试验 ,表明河南猪株与黑龙江犬株存在生殖隔离现象 ;冷冻耐力试验 ,在 - 15℃下 ,前者 9d即死亡 ,后者可存活 1年以上 ;在 4℃ ,前者肌肉期幼虫呈圆盘状卷曲 ,后者呈螺旋状卷曲 ;生殖力指数 ( RCI)在小鼠试验分别为 195.7和 6.2 ( P<0 .0 1) ,在大鼠分别为 191.3和 14.4 ( P<0 .0 1) ;前者对家猪易感 ,后者不易感 ;随机扩增多态性 DNA指纹分析其扩增后产物的 DNA片段电泳带型 ,河南猪株旋毛虫与 T.spiralis基本相同 ,黑龙江犬株旋毛虫与 T.nativa一致。结论 :我国至少存在上述两种旋毛虫 ,即 :河南猪株旋毛虫系 T.spiralis,黑龙江犬株旋毛虫系 T.nativa。     

旋毛虫不同发育阶段同工酶的电泳分析

目的　通过对旋毛虫不同发育阶段同工酶酶谱变化的研究 ,以探讨其生物发育过程中的一些规律。　方法　应用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)和 UVP凝胶分析仪对猪型黑龙江株旋毛虫成虫、肌肉期幼虫和新生幼虫的酯酶同工酶(EST)、乳酸脱氢酶同工酶 (L DH)、苹果酸脱氢酶同工酶 (MDH)、延胡索酸酶同工酶 (MUF)进行分析。　结果　 3个发育时期的 MDH、EST酶谱基本相似 ;L DH的酶谱虽均有 1条带 ,但新生幼虫最深 ,肌肉期幼虫最浅 ;MUF酶谱新生幼虫最深 ,成虫较浅 ,肌肉期幼虫未见酶带。　结论　旋毛虫发育过程中 MDH、EST同工酶变化较小 ,但是 L DH、MUF同工酶存在较大差异     

不同种株旋毛虫肌肉期幼虫温变形态观察比较

目的探索我国是否存在旋毛虫的不同类型及其在生物学性状方面与布氏旋毛虫(T.britovi,T3)和南方旋毛虫(T.nelsoni,T7)存在的差异。方法在4℃低温下观察云南、湖北、黑龙江、河南4地和2株国际标准株(T3、T7)旋毛虫肌肉期幼虫(ML)形态及其分布。结果 4地旋毛虫及2株国际标准株旋毛虫 ML 形态分布各不相同,呈螺旋状卷曲者所占的比例分别为14.1%、41.1%、12.1%、39.5%、3.5%和25.7%。其中湖北株、河南株比例接近,并且比例较高;云南株、黑龙江株分布比例接近,比例较低。该四株与 T3、T7比例皆相差较远。云南、湖北、黑龙江、河南4地和2株国际标准株(T3、T7)的温变率分别为3.92、9.86、6.72、9.40、2.43、11.68。结论我国4地与2株国际标准株旋毛虫 ML 在低温下形态上存在着明显的差异,提示我国4地旋毛虫存在2种不同的生物学类型,且与国际标准株(T3,T7)的亲缘关系较远。     

用SSR-PCR和RAPD技术研究中国不同地域旋毛虫株的遗传变异

目的　对中国不同地域的旋毛虫株基因组DNA进行多态性分析 ,并为其种及种下分类提供依据。方法　采用微卫星锚定PCR(SSR PCR)及随机扩增多态性DNA技术 (RAPD)对我国 6旋毛虫株基因组DNA进行PCR扩增 ,根据扩增产物电泳条带情况进行SAS分析 ,计算遗传距离并构建进化树。结果　T3、T7与国内各地域株间遗传距离均大于 0 85 ;湖北株与天津株、黑龙江株与云南株之间的遗传距离均小于 0 2。河南株与前 4株的遗传距离在SSR PCR小于 0 3,在RAPD小于0 6。结论　中国 6株旋毛虫在基因水平可分为不同层次的 3类 :a 湖北株、天津株为一类 ;b 黑龙江株、云南株为一类 ;c 不明株与河南株归为一类或者不明株归为a类中。国内 6株归属于T1。此外 ,国际标准株T3、T7分为另两大类     

我国旋毛虫地理株遗传变异与系统发生关系的研究

目的通过分析旋毛虫线粒体基因分子标记,研究我国旋毛虫地理株间的遗传变异与系统发生关系。方法应用旋毛虫线粒体核糖体小亚基DNA（mitochondrial small subunit ribosomal DNA,mtSSU）和线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因（mitochondria cytochrome coxidase,COΙ）为分子标记,分别对我国7个旋毛虫地理株扩增后进行双向测序,利用DNAMAN软件将测序结果和GenBank中相应序列进行比对研究,并使用MEGA4.0程序包构建系统进化树。结果 PCR对7个旋毛虫地理株分别扩增出了649bp（mtSSU）和419bp（COΙ）的DNA片段,7个地理株的DNA片段与GenBank中T.spiralis的相应片段相比存在一定差异,其中mtSSU基因有4个变异位点（248、293、537和539位）,而COI基因仅存在2个变异（273和382位）,所有变异均为T-C或C-T的转换;进化树显示南阳株和云南株位于比较近的分枝,而西安株、广西株及西藏株亲缘关系较近。结论我国7个旋毛虫地理株的遗传变异较小,亲缘关系较近。     

河南猪株旋毛虫18S rRNA基因的同源性序列分析

目的通过分析18SrRNA基因序列同源性,对河南猪株旋毛虫进行分子鉴定及分类。方法收集河南猪株旋毛虫成虫,提取总RNA,反转录合成cDNA,经特异引物扩增获得18SrRNA基因片段。将此目的基因与pMD18-T载体连接,转化大肠埃希菌感受态细胞,阳性克隆经PCR及酶切鉴定后进行序列测定及分析,构建系统发育树。结果构建的重组质粒酶切片段大小分别为2 700和1 800bp,与预期值相符。根据18SrRNA碱基序列构建系统发生树,河南猪株旋毛虫与虫株Trichinella nativa(AY487254.1)的亲缘关系较近,同源性为99.1%。结论河南猪株旋毛虫归属于T2。     

旋毛虫不同发育阶段同工酶的电泳分析

目的 通过对旋毛虫不同发育阶段同工酶酶谱变化的研究，以探讨其生物发育过程中的一些规律。方法 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和UVP凝胶分析仪对猪型黑龙江株旋毛虫成虫，肌肉期幼虫和新生幼虫的酯酶同工酶时期的MDH，EST酶谱基本相似。LDH的酶谱虽均有1条带，但新生幼虫最深，肌肉期幼虫最浅，MUF酶谱新生幼虫最深，成虫较浅，肌肉期幼虫未见酶带，结论 旋毛虫发育过程中MDH，EST同工酶变化较小，但是LDH、MUF同工酶存在较大差异。