有序排列聚甲基丙烯酸甲酯电纺纳米纤维作为大鼠原代雪旺细胞负载支架的可行性研究

目的:探讨有序聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)电纺纳米纤维作为雪旺细胞负载支架的潜力。方法:构建有序PMMA电纺纳米纤维,以随机PMMA电纺纤维作为对照,纯化大鼠原代雪旺细胞并在纤维结构上进行培养,利用慢病毒技术转染绿色荧光蛋白基因作为显色手段,观察有序PMMA电纺纤维的拓扑线索在定向引导SCs生长上的作用,分析细胞对纤维结构的依从性;并在此基础上,持续动态观察雪旺细胞对有序电纺纤维的依从性,从而评价有序PMMA电纺纳米纤维作为神经损伤后植入性雪旺细胞负载支架的潜力。结果:雪旺细胞在随机及有序PMMA电纺纤维上均能顺利贴壁并生长;较之随机电纺纤维,雪旺细胞对有序纤维具有更好的依从性,能够受其接触引导形成和纤维走行方向一致的定向生长,并能够生成更长的细胞突起(P=0.0079);动态的观察则进而显示SCs对有序电纺纳米纤维的拓扑线索能维持稳定的依从性。结论:有序PMMA电纺纳米纤维具有作为神经损伤后植入性雪旺细胞负载支架的潜力。     

有序聚甲基丙烯酸甲酯电纺纳米纤维作为大鼠背根神经元负载支架的可行性研究

目的探讨具备有序或无序拓扑结构的聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)电纺纳米纤维材料作为原代大鼠背根神经元(dorsal root ganglion neurons,DRGn)负载支架的可行性。方法构建具有随机或有序拓扑结构的PMMA电纺纳米纤维;利用PMMA薄膜组作为对照,分离纯化大鼠原代DRGn,利用慢病毒技术转染绿色荧光蛋白基因作为显色手段,分析在随机及有序纤维支架上DRGn神经突的生长能力以及神经突和电纺纤维的依存关系。结果大鼠原代DRGn能够顺利在PMMA材料上贴壁并生长,在培养第2天,较之平面环境,DRGn未见平均神经突数量及神经突长度的明显区别,电纺纤维的拓扑结构对于DRGn神经突的生长具有明显的接触引导作用,在有序电纺纤维上DRGn能够生成和基质纤维延伸方向一致的神经突;通过GFP表达与背景纤维的合成图,发现在随机或有序电纺纤维上,DRGn神经突均能循纤维向前生长,但相比随机纤维,神经突似乎更倾向于接受有序电纺纤维的引导。结论有序PMMA电纺纳米纤维具有作为神经损伤后大鼠DRGn负载支架的潜力。     

聚甲基丙烯酸甲酯静电纺丝纳米纤维对大鼠原代星形胶质细胞生长的影响

目的探讨聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate, PMMA）电纺纳米纤维的拓扑线索对于大鼠原代星形胶质细胞生
长能力及方式的影响,为脊髓损伤后植入性细胞支架的构建提供前期基础。方法构建具有随机或有序拓扑结构的PMMA电
纺纳米纤维;分离并纯化大鼠原代星形胶质细胞;利用PMMA薄膜作为对照,利用慢病毒技术转染绿色荧光蛋白基因作为显色
手段,分析在星形胶质细胞不同拓扑结构纤维支架上的生长特点。结果随机及有序PMMA电纺纤维均能支持星形胶质细胞
的生长,其拓扑结构能够显著影响星形胶质细胞的生长方式,在有序纤维系统上细胞突起的生长方向能够和基质纤维的延伸方
向保持高度一致;通过绿色荧光蛋白和基质纤维的合成图,发现在两种拓扑结构的纤维系统上,细胞突起均能依附在纤维上向
远处延伸;较之PMMA薄膜,在有序纤维上的星形胶质细胞能生成更长的细胞突起（P<0.01）,而在随机纤维上的细胞则形成更
短的突起（P<0.01）。结论PMMA电纺纳米纤维的拓扑结构能够显著影响大鼠原代星形胶质细胞生长能力及方式,其作为植
入性支架具有减轻脊髓损伤后损伤灶胶质瘢痕形成的潜在价值。
     

高糖环境下糖络宁对大鼠背根神经节神经元细胞凋亡水平及MAPKs信号通路的影响

目的 研究糖络宁对高糖环境下大鼠背根神经节神经元(DRGn)细胞凋亡及丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响.方法 6～8周体重(215±15)g清洁级雄性SD大鼠60只,按照随机数字表法分为高、中、低浓度糖络宁组和正常组,每组15只.各组分别以糖络宁组方生药5、2.5、1.25 g/(kg?d)和等量蒸馏水灌...     

5 nm金纳米颗粒对大鼠皮质神经元的作用及机制初探

目的:探讨直径5 nm的小尺寸金纳米颗粒(gold nanoparticles,GNPs)对大鼠皮质神经元细胞的作用及相关机制?方法:使用硼氢化钠还原法制备GNPs,用透射电镜(TEM)及紫外-可见光光谱(UV-Vis)进行鉴定?用5% 牛血清白蛋白(BSA)对GNPs进行包裹提纯后制备成不同浓度(600?1 200?2 400 μg/L)的GNPs培养液?采用免疫荧光染色鉴定原代培养的大鼠皮质神经元纯度?体外培养原代大鼠皮质神经元72 h后,以正常培养的神经元为对照组,以不同浓度GNPs溶液孵育48 h后的神经元作为实验组?采用TEM观察GNPs在细胞内的分布;采用CCK-8试剂盒检测细胞活力;采用TUNEL法检测细胞凋亡;采用丙二醛(MDA)?超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测氧化应激水平?结果:TEM及UV-Vis显示硼氢化钠还原法制备的GNPs呈尺寸均一的球形,在溶液中均匀分散?原代培养的大鼠皮质神经元纯度为(82.0 ± 2.3)%?GNPs主要以聚合体形式分布于胞浆?溶酶体?囊泡中?随着GNPs浓度的增高,细胞活性逐渐降低,尤其1 200和2 400 μg/L处理组细胞活力较对照组显著降低(P < 0.05)?TUNEL染色结果显示,随着GNPs浓度的增高,凋亡细胞数逐渐增加,1 200和2 400 μg/L处理组细胞凋亡明显,具有显著性差异(P < 0.05)?随着GNPs浓度的增高,细胞内MDA含量逐渐增加,SOD含量逐渐减少,1 200和2 400 μg/L处理组与对照组相比MDA含量显著升高,SOD含量显著降低(P < 0.05)?结论:5 nm GNPs能降低大鼠皮质神经元的细胞活力,促进其凋亡,其机制可能与氧化应激损伤相关?     

大鼠瘦素基因重组腺相关病毒的构建及在原代神经元细胞中的表达

目的 构建携带大鼠瘦素(Leptin)基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),并鉴定其在原代鼠神经元细胞中介导的瘦素过表达,为肥胖症基因治疗研究奠定实验基础。 方法 提取大鼠脂肪组织总RNA,利用RT-PCR技术,获取目的基因瘦素 cDNA,通过重组DNA技术,得到瘦素 cDNA与pGEM-T载体的重组质粒,阳性重组子用PCR及测序分析鉴定。用SpeⅠ和EcoRⅤ双酶切将pGEM-Leptin中的瘦素基因片段切出,再克隆到AAV2表达质粒pTR-UF22中,构建瘦素重组AAV2载体pAAV2-CBA-Leptin。以pDG作为辅助质粒用HEK293细胞包装AAV2-CBA-Leptin,并用一步重力流柱法纯化病毒,由荧光定量PCR测定病毒基因组DNA的拷贝数即为病毒滴度。然后将AAV2-CBA-Leptin 及对照病毒AAV2-CBA-EGFP感染大鼠原代神经元细胞,分别用免疫染色和Western blotting鉴定外源基因在神经元的表达。 结果 测序证实瘦素基因与GenBank 提供的原始序列完全一致。 重组载体经酶切鉴定与预期结果完全一致,HEK293细胞包装病毒效果良好,得到滴度为1.5x1012 vg/ml纯化的重组瘦素病毒AAV2-CBA--Leptin。Western blotting检测显示AAV2-CBA-Leptin能介导瘦素在大鼠神经元细胞中过表达,并随着病毒量的增加而增强。AAV2-CBA-EGFP 感染鼠神经元细胞5天后95%左右的细胞有明显的绿色荧光,免疫染色和DAPI核酸染色显示荧光细胞均为神经元而神经胶质细胞无荧光。 结论 成功构建并包装了瘦素重组AAV2病毒并可介导瘦素在神经元细胞中高效、特异表达,从而为研究瘦素在中枢神经系统控制体重和糖尿病等方面的功能及基因治疗研究打下基础。     

电纺PLLA/PVP纳米纤维膜材料用于血管组织工程的前期研究

目的:研究静电纺丝在血管组织工程中的应用。方法:利用静电纺丝技术制备不同质量分数的聚乳酸(PLLA)/聚乙烯吡咯烷酮(PVP)电纺丝膜,并通过差示扫描量热分析(DSC)、扫描电子显微镜(SEM)观察、接触角测试(CA)和力学性能分析进行材料学表征。在不同的电纺丝膜上种植血管平滑肌细胞(VSMCs),并分别在2、4、6 d取样进行SEM、激光共聚焦显微镜(LCMS)观察,以检测VSMCs在材料上铺展的形貌和分布情况。经MTT测试,以了解材料对VSMCs增殖的影响,用血小板黏附实验测试材料的血液相容性。结果:混入PVP的PLLA电纺丝膜具有良好的表面结构,亲水性显著提高,且随着PVP含量的增多PLLA电纺丝膜的亲水性增高,但对力学性能影响不明显。细胞实验结果表明:混有PVP的PLLA电纺丝膜利于VSMCs的黏附生长,具有良好的细胞相容性和血液相容性。结论:成功地将PVP和PLLA进行了静电纺丝,该材料具有良好的细胞相容性和血液相容性,其在血管组织工程应用中具有广阔的前景。     

聚己内酯电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞增殖及分化的影响

目的:观察聚己内酯(PCL)电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞(BMSCs)增殖及分化特点的影响,评价其作为骨组织工程的支架材料的应用前景.方法:将兔BMSCs与PCL电纺纤维支架材料在培养板内共培养.采用形态学观察、MTT法及ALP检测等方法检测BMSCs在PCL电纺纤维表面的粘附、增殖和分化能力.结果:体外培养的BMSCs能在PCL电纺纤维表面正常粘附和增殖,并且表达较高的碱性磷酸酶活性.结论:PCL电纺纤维适合作为支架材料应用于BMSCs为种子细胞的组织构建.     

经皮电针对背根节慢性压迫模型大鼠相应腰髓节段GFAP和5-HT阳性神经元的影响和与疼痛的关系

目的研究经皮电针对背根节慢性压迫模型(CCD)大鼠相应腰髓节段神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和血清素(5-HT)的影响和与疼痛的关系。方法选用雄性Wistar大鼠42只,随机分为3组:A正常对照组(6只),B背根节慢性压迫模型组(18只),C经皮电针治疗背根节慢性压迫模型组(18只),其中从B、C组各挑选基础痛域基本相似的6只大鼠,隔日进行痛域的测定,并于2周同A组随机选出的2只大鼠共同进行免疫组织化学染色。其余28只分别于术后2 d,1周进行免疫组织化学染色。选取大鼠相应L4-L6脊髓阶段组织,进行GFAP和5-HT的特异性染色。结果①痛域变化:造模第2天开始出现痛敏,且痛域与术后时间呈负相关,C组经TENS治疗6 d后,痛域比B组有显著性的增加;②免疫组织化学染色结果:2 d时,B、C组GFAP和5-HT阳性神经元较A组显著性的增加;1和2周时,B组较A、C组GFAP和5-HT阳性神经元数均显著性的增加,C组较A组相比均无显著性的差异。结论GFAP和5-HT阳性神经元的活化率的减少可能是经皮神经电刺激(TENS)降低CCD模型疼痛的可能机制之一,且GFAP和5-HT阳性神经元之间可能存在相互激活作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上的培养及成神经诱导

目的通过将骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上,研究BMSCs的生长及成神经分化情况。方法用家蚕丝素、柞蚕丝素分别与聚乳酸共混制成静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维,将第5代大鼠BMSCs培养其上,于24h后通过活细胞工作站观察细胞的黏附情况,并进行表型鉴定及存活检测。接种后待细胞长至60%左右,用bFGF/BHA诱导细胞成神经分化,并设多聚赖氨酸组进行对照。在诱导5h和维持48h时,观察细胞的形态学改变,通过免疫荧光法鉴定神经细胞特异性标志物Nestin,β-Ⅲ-Tubulin和NCAM的表达并进行定量统计分析。结果BMSCs在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上的黏附情况良好,细胞生长于纳米纤维上。存活检测中几乎未发现死细胞,多数细胞在材料上可存活。神经分化的形态学改变与多聚赖氨酸组一致,并且培养在纳米纤维上的细胞分化时出现的突起可缠绕在纺丝纤维上。神经特异标志的表达情况与多聚赖氨酸对照组的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维具有良好的生物相容性,可支持BMSCs的黏附及成神经分化,且对细胞生存无毒性。     

乙酰胆碱对大鼠慢性压迫背根节神经元放电的影响

目的研究乙酰胆碱(ACh)对大鼠慢性压迫背根节(DRG)神经元放电的影响。方法采用单纤维记录神经元自发放电的方法,在DRG慢性压迫模型上观察ACh对受损DRG神经元自发放电的影响。结果受损DRG神经元有丰富的自发放电,77.9%有自发放电的受损DRG神经元对ACh有反应,其中反应类型有单纯兴奋和先兴奋后抑制两种形式,而且反应的幅度随ACh浓度的延长而逐渐增大。结论在慢性压迫DRG神经元有大量的自发放电,ACh可明显影响受损DRG神经元的自发放电。     

地昔帕明对大鼠背根神经节神经元钠电流的影响

目的:研究地昔帕明(desipramine,DMI)对大鼠背根神经节神经元电压依赖性钠电流的影响。方法:分离单个大鼠背根神经节,应用全细胞膜片钳技术观察地昔帕明对内向钠电流(INa)的影响。结果:地昔帕明浓度依赖性地抑制INa,即分别加入10,50,100μmol/L的DMI可使钠电流的抑制率达(5.56±0.62)%,(54.67±13.39)%和(86.63±16.08)%,并且,50μmol/L的DMI可使INa稳态失活曲线左移,V1/2分别由对照组的-(43.71±0.79)mV降低至-(47.91±1.14)mV,k值无明显变化。结论:DMI浓度依赖性地抑制背根神经节神经元Na+通道,并改变通道的失活,这可能是其影响痛觉传导通路,产生镇痛作用的机制之一。     

施万细胞与背根节神经元体外共培养成髓鞘模型的建立

目的：探讨施万细胞与背根节神经元髓鞘化共培养的标准化方法,为研究周围神经髓鞘化的形成机制提供稳定的周围神经髓鞘化体外模型。方法：取出生1~3 d新生SD大鼠,培养施万细胞,经纯化鉴定后用于共培养。取孕14~15 d的SD大鼠胚鼠背根神经节,经纯化后用于共培养;将2种分别纯化的细胞进行共培养,加抗坏血酸诱导髓鞘的形成。利用免疫组化染色、扫描电镜和透射电镜,检测髓鞘的形成。结果：纯化后施万细胞纯度可达到98%以上,可用于共培养。背根节神经元贴壁良好,经纯化后几乎无杂细胞可见,可用于共培养。对共培养细胞进行MAG与NF的免疫组化染色,发现有数量可观的髓鞘形成,并且髓鞘是紧密包绕在神经元轴突上。扫描电镜下可观察到施万细胞包绕轴突形成髓鞘,而透射电镜下则可观察到有致密的髓鞘板层结构形成。结论：本实验成功建立稳定可靠的体外成髓鞘模型,可用于轴突的新髓鞘化实验研究。     

人参皂苷Rb1对胎鼠背根神经节损伤的保护作用

目的观察不同浓度人参皂苷Rb1对损伤胎鼠背根神经节（DRG）神经元形态学改变的影响,探讨人参皂苷Rb1对谷氨酸引起的兴奋性神经毒损伤的保护作用,为Rb1的进一步研究和临床应用提供理论依据。方法选择胎龄为15 d的SD大鼠,获取DRG神经元并进行体外分散培养48 h后,随机分为对照组、谷氨酸损伤组、谷氨酸损伤＋低浓度Rb1（10μg/ml）保护组和谷氨酸损伤＋高浓度Rb1（100μg/ml）保护组,继续培养12 h。终止培养后,倒置相差显微镜观察各组神经元的生长状态,MTT检测不同浓度人参皂苷Rb1孵育的背根神经节神经元的凋亡增殖情况。结果对照组DRG神经元细胞贴壁呈单层散在分布,少部分出现细胞聚集现象,突起较长且互相交织形成网状;谷氨酸损伤组DRG神经元细胞聚集现象明显,神经元突起变短、断裂甚至消失;谷氨酸损伤＋Rb1保护组DRG神经元细胞部分呈簇状聚集,部分呈单个散在分布,突起仍然相互交织。MTT结果显示谷氨酸损伤＋Rb1保护组细胞存活率均高于谷氨酸损伤组,但高浓度Rb1保护组与低浓度Rb1保护组之间差异无统计学意义。结论人参皂苷Rb1可以影响损伤胎鼠DRG神经元的形态学改变和凋亡增殖情况,对胎鼠背根神经节神经元具有一定的保护作用。     

Effects of olfactory ensheathing cells on hydrogen peroxide- induced apoptosis in cultured dorsal root ganglion neurons

Background Olfactory ensheathing cells （OECs） can promote many kinds of neuron growth and axonal extension. The aim of the study was to investigate the effects of co-culturing with OECs on neuron apoptosis in vitro. Methods Apoptosis was induced by treatment of cultured dorsal root ganglion neurons with 1 mmol/L hydrogen peroxide （H2O2）. Cells were randomly arranged into the following treatment groups. In group 1, OECs at different density （10^4/ml to 8×10^5/ml） were added immediately after H2O2 treatment and cells were co-cultured for 24 hours. In group 2, OECs were added at different time points （0, 4, 8, 12 and 24 hours） after H2O2 treatment. Apoptotic cell death was determined by Hoechst 33258 staining and flow cytometry （FCM）. Cell viability was determined by using methyl thiazoleterazolium （MTT） assays. Results The results showed in the Hoechest 33258 staining, FCM and MTT that OECs have both the density-dependent protection and time-dependent protection on neuron apoptosis. The apoptosis decreased and the dorsal root ganglion neuron viability increased, when the density of OECs was increased in co-culture groups. But further increasing OEC density above 2×10^5/ml （i.e. 8×10^5/ml） failed to exert additional protection. As the interval between adding H2O2 and adding OECs was increased, the amounts of apoptosis cells were also increased. When OECs were added 24 hours after H2O2, no significant protection was observed. Conclusion These results indicated that OECs could protect dorsal root ganglion neurons from apoptosis induced by H2O2 in a density- and time-dependent manner.     

乌头碱对受损背根节神经元自发放电的作用

目的：研究钠通道失活门抑制剂乌头碱(aconitine)对受损背根节(DRG)神经元不同模式的背景放电的作用．方法：在大鼠DRG慢性压迫模型上记录A类单纤维自发放电,观察和分析乌头碱作用下动作电位峰峰间期序列(isi)的变化及特征．结果：在大鼠L5DRG浸浴乌头碱(10～200μmol／L)后,80％簇放电(bursting)和70％不规则放电(irregular)逐渐转化为持续的周期放电;91％周期放电(period)只表现为放电频率的不断增加,并没有发生放电模式的转化．对于静息的神经元,乌头碱则不能引发放电．结论：在阻断钠通道失活门之后,受损DRG神经元的自发放电可以发生模式转化,并且乌头碱对DRG神经元的作用具有活动依赖性．     

Edaravone对脊髓神经细胞体外存活的作用

目的探讨Edaravone对脊髓神经细胞体外存活的作用和对谷氨酸兴奋性神经细胞毒性的影响。方法分离培养脊髓背根神经节(DRG),加入谷氨酸并使用Edaravone进行干预,倒置显微镜下观测细胞在不同培养条件下存活;流式细胞仪观测分析神经细胞凋亡。结果谷氨酸可诱导体外培养的DRG细胞凋亡,Edaravone抑制谷氨酸的神经细胞损伤作用,且浓度更高作用明显。结论Edaravone对谷氨酸的兴奋性神经细胞毒性具有浓度依赖性保护作用,其作用机制可能与其抗自由基导致的细胞凋亡有关。     

Skin-visceral divergent projection of cholecystokinin — containing dorsal root ganglion neurons: A tri-labelling study with fluorescent tracers and immunohistochemistry

Summary Skin-visceral divergent projections of cholecystokinin (CCK)-containing dorsal root ganglion neurons were studied by combined technique of fluorescent double-labelling and immunohistochemistry. Fast blue (FB) and nuclear yellow (NY) were injected into the coeliac ganglion and the cutaneous branches of left 9th–11th intercostal nerves, respectively. Three kinds of neurons labelled with fluorescein were observed in T_9-11 dorsal root ganglia: FB-labelled neurons with blue-fluorescent cytoplasm; NY-labelled neurons with yellow-fluorescent nucleus and double-labelled neurons with blue cytoplasm and yellow nucleus. The double-labelled neurons were found to account for 2.8 % of total labelled neurons. The sections containing neurons labelled with fluorescein were stained by CCK-immunohistochemical procedure. Four kinds of neurons could be identified: NY-neurons with CCK-immunoreactivity (NY+CCK); FB-neurons with CCK-immunoreactivity (FB+CCK); NY+FB neurons with CCK-immunoreactivity (NY+FB+CCK); and neurons only CCK-positive. NY+FB+CCK tri-labelled neurons accounted for approximately 11.5 % of NY+FB double-labelled neurons, and for 0.4 % of all CCK-positive neurons. The findings clearly indicated that the peripheral processes of some sensory dorsal root ganglion neurons divergently project to both skin and visceral structure and contain CCK.     

施万细胞样细胞对大鼠背根神经节细胞突起生长和神经生长因子表达的影响及其机制

探讨施万细胞样细胞（SCLCs）对大鼠背根神经节（DRG）细胞突起生长和神经生长因子（NGF）表达的影响,阐明SCLCs促进DRG细胞生长的作用及其机制。     

Electrophysiological and relevant morphological properties of neurons in toad dorsal root ganglion

Summary Intracellular recordings were performed on isolated preparations of toad dorsal root ganglion (DRG). Of the 87 neurons examined, 83 were of type A cells and 4 of type C cells. The conduction velocity (CV) of type A cells ranged from 2.55 to 35.19 m/s with a mean of 11.18±0.78 m/s (x ± s x), while that of type C cells ranged from 1.34 to 2.43 m/s with a mean of 2.11±0.22 m/s (x ± s x). On the basis of tne characteristics of Ap configuration, these 87 cells can be classified into three groups: H neuron (24/87); F neuron (50/87) and F-H neuron (13/87). The Sizes of DRG cells were examined by measuring of HRP labelled cells in part of the experiment. By comparing the size of F and H cell with tneir CV, we proposed a revised view which is against the public opinion concerning the relation between tne size and CV of DRG cells.