肺炎链球菌自溶素核酸疫苗的制备及其免疫原性研究

目的构建肺炎链球菌自溶素（pneumococcal autolysin,LytA）核酸疫苗,并研究其免疫原性。方法采用聚合酶链反应方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将该基因插入到pVAX1真核表达载体中,构建表达LytA的重组质粒,制备成超螺旋比例大于90％的核酸疫苗。实验组：BALB／c小鼠5只,对其分3次肌内注射核酸疫苗（100μg）;对照组：BALB／c小鼠5只,肌内注射pVAX1空载体（100μg）3次。分别采集小鼠血清,采用间接酶联免疫吸附方法测定血清LytA特异性抗体水平。结果扩增出的LytA基因（957bp）与基因库中LytA的编码序列（957bp）一致。成功构建了LytA核酸疫苗。实验组小鼠的血清LytA抗体水平明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论成功克隆了LytA基因,制备了LytA核酸疫苗,后者可在小鼠体内诱导较强的特异性体液免疫反应。     

兔蒸发过强型干眼白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和黏附分子1的表达

目的探讨炎性细胞因子在蒸发过强型干眼的发病机制中所起的作用。方法20只新西兰大白兔被随机分为实验组和对照组两组．实验组烧灼免睑板腺开口制成蒸发过强型干眼模型,对照组不作处理。第1、第6、第11周用放射免疫法及酶联免疫法测泪液中白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的含量,第11周时处死兔,用免疫组化方法检测细胞间黏附因子1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）在角膜、结膜组织中的表达。结果实验组免SchirmerⅠ滤纸湿长、泪膜破裂时间均较正常组增加（P〈0．01）;实验组泪液中IL-6、TNF-Ⅰ的含量均较对照纽增高（P〈0．01）;ICAM—1在两组兔角膜、结膜组织上皮均有表达,阳性反应物呈棕黄色,主要表达于细胞浆。在实验组表达较强,在对照组表达较弱,两者差异有非常显著的统计学意义（P〈0．01）。每1000个细胞中阳性细胞表达数在实验组（角膜为272．1±46．8,结膜为302．7±56．3）明显高于对照组（角膜为50．2±5．9,结膜为60．4±153）（P〈0．01）。结论细胞因子在蒸发过强型干眼的发病机制中起着重要的作用．蒸发过强型干眼的发病机制与炎症有关。     

视网膜母细胞瘤高迁移率族蛋白A、MIB-1标记指数和let-7的表达及其相关性分析

目的 观察分析视网膜母细胞瘤(RB)肿瘤组织中高迁移率族蛋白A (HMGA)1和HMGA2、MIB-1标记指数(LI)及let-7的表达及其相关性.方法 44例RB肿瘤组织标本纳入研究.其中,低分化组织标本11例,高分化组织标本33例.侵袭性肿瘤组织标本8例,非侵袭性肿瘤组织标本36例.采用免疫组织化学染色方法检测RB肿瘤组织标本中HMGA1、HMGA2及MIB-1 LI的表达.HMGA1、HMGA2表达判定标准:以0为无表达,1％～10％为低度表达,11％～50％为中度表达,＞50％为高度表达;MIB-1 LI表达判定标准:以0为无表达,1％～40％为低度表达,＞40％为高度表达.采用逆转录聚合酶联反应检测let-7的表达;以≥80％为无明显下降,60％～79％为中度下降,＜60％为高度下降.结果 44例标本中,HMGA1无表达14例,占32％;低度表达11例,占25％;中度表达10例,占23％;高度表达9例,占20％.低分化组织标本的HMGA1表达率高于高分化组织标本,差异有统计学意义(x2=11.3,P＜0.01).侵袭性与非侵袭性肿瘤组织标本的HMGA1表达率比较,差异无统计学意义(x2=5.9,P＞0.05).HMGA2无表达11例,占25％;低度表达11例,占25％;中度表达9例,占20％;高度表达13例,占30％.低分化组织标本的HMGA2表达率高于高分化组织标本,差异有统计学意义(x2=20.9,P＜0.05).侵袭性肿瘤组织标本的HMGA2表达率高于非侵袭性肿瘤组织标本,差异有统计学意义(x2=8.7,P＜0.05).MIB-1 LI无表达4例,占9％;低度表达18例,占41％;高度表达22例,占50％.低分化组织标本的MIB-1 LI表达水平高于高分化组织标本,差异有统计学意义(t=5.2,P＜0.05).侵袭性肿瘤组织标本的MIB-1 LI表达水平高于非侵袭性肿瘤组织标本,但差异无统计学意义(t=-1.1,P＞0.05).let-7表达无明显下降27例,占61％,中度下降8例,占18％,高度下降9例,占21％.相关性分析结果显示,MIB-1 LI表达与HMGA1和HMGA2表达呈显著正相关(r=0.327、0.602,P＜0.05);let-7表达与HMGA1、HMGA2表达及MIB-1 LI表达均呈负相关(r=-0.247、-0.310、-0.392,P＜0.05).结论 在RB肿瘤组织中HMGA1、HMGA2和MIB-1 LI均呈现高表达,let-7表达下降.let-7有可能抑制HMGA1和HMGA2的表达.     

缺氧诱导因子1α特异性小干扰RNA对髓样细胞表面黏附分子CD18及神经损伤诱导蛋白-1表达的影响

目的 观察早期糖尿病视网膜病变（DR）状态下,以pSUPER为载体的缺氧诱导因子1α（HIF1α）特异性小干扰（siHIF1α）RNA对髓样细胞表面黏附分子CD18及神经损伤诱导蛋白-1（Ninj-1）表达的影响。方法 实验分为健康人血清培养组（A组）、糖尿病血清培养组（B组）、糖尿病血清培养联合pSUPERH1 siHIF1α转染组（C组）及糖尿病血清培养联合pSUPER空载体组（D组）进行。A组采用健康志愿者血清培养人髓样细胞系白血病细胞系（K562）细胞;B、C、D组均采用DR患者血清培养K562细胞。C、D组在加入DR患者血清前24 h分别转染pSUPERH1 siHIF1α及pSUPER空载体。采用流式细胞仪检测各组K562细胞表面的CD18、Ninj-1表达。行细胞黏附实验,检测各组K562细胞与恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞系（RF/6A）细胞黏附率。结果 A、B、C、D组K562细胞表面CD18表达比较,4组间差异有统计学意义（F=14.33,P=0.01）。组间CD18表达两两比较,B组明显高于A组（P=0.001）;C组明显低于B组（P=0.001）和D组（P=0.02）;C组与A组间无明显差异（95%可信区间=-14.89~2.13,P=0.12）。A、B、C、D组K562细胞表面Ninj-1表达比较,4组间差异有统计学意义（F=39.38,P=0.001）。组间Ninj-1表达两两比较,B组明显高于A组（P=0.00）;C组与B组间无明显差异（P=0.06）;C组与D组间也无明显差异（P=0.49）。A、B、C、D组K562细胞与RF/6A细胞黏附率比较,4组间差异有统计学意义（F=20.62,P=0.00）。组间K562细胞与RF/6A细胞黏附率两两比较,B组明显高于A组（P=0.00）;C组较B组明显下降（P=0.01）,较A组明显提高（P=0.002）;B组与D组间无明显差异（P=0.68）。结论 早期DR状态下,以pSUPER为载体的siHIF1α RNA可降低K562细胞表面CD18的表达,但对Ninj-1表达无明显影响。     

缺氧诱导因子1α对早期糖尿病视网膜病变状态下人粒细胞系白血病细胞表面黏附分子CD18表达的调节

目的　观察在早期糖尿病视网膜病变(DR)状态下,缺氧诱导因子1α（HIF-1α）对细胞表面黏附分子CD18表达以及白细胞和血管内皮细胞黏附的影响。方法　收集早期DR患者及年龄匹配的健康人外周血血清,用于体外培养人粒细胞系白血病细胞（HL60）和恒河猴视网膜血管内皮细胞系细胞（RF/6A）。分为糖尿病血清培养组（B组）、糖尿病＋HIF 1α反义寡核苷酸组（ASODN）（C组）、糖尿病＋HIF 1α 正义寡核苷酸组（SODN）（D组）,健康人血清培养细胞为正常对照组（A组）。以流式细胞仪和Real-time PCR分别检测HL60细胞表面CD18蛋白阳性细胞比例和CD18 mRNA的表达水平,以虎红染色法观察HL60细胞和RF/6A细胞的黏附率。结果　A、B、C、D组CD18阳性细胞比例分别为17.06±6.01、42.23±2.60、25.33±3.05、32.40±10.57,各组之间差异有统计学意义（F=36.47,P＜0.001）。和A组比较,B、C、D组CD18 mRNA水平分别是A组的21.05±2.07、2.23±0.96、25.07±2.27倍,各组之间差异有统计学意义（F＝180.34,P＜0.001）。A、B、C、D组细胞黏附率分别为0.06±0.002、0.09±0.10、0.05±0.007、0.07±0.01,各组之间差异有统计学意义（F=13.06,P=0.002）。结论　在体外培养条件下,糖尿病血清可以促进HL60细胞表达CD18蛋白和CD18mRNA,促进HL60细胞和血管内皮细胞的黏附,HIF-1α表达被抑制后,这种促进作用减弱。HIF-1α对糖尿病状态下细胞表面黏附分子CD18表达及白细胞和血管内皮细胞之间的黏附具有调节作用。      

剪切力对视网膜色素上皮细胞syndecan-1,血管细胞黏附分子-1,E-选择素蛋白表达和肌动蛋白的影响

目的:研究剪切力对视网膜色素上皮(RPE)细胞synde-can-1,血管细胞黏附分子(VCAM)-1和E-选择素(se-lectin)表达和细胞骨架的影响。方法:体外培养人RPE细胞,应用2dyns/cm2大小的剪切力干预0,0.25,0.5,0.75,1,1.5,3h后,用免疫荧光染色法观察RPE细胞syndecan-1,VCAM-1和E-selectin表达和肌动蛋白的变化。结果:静态下的RPE细胞呈多角形和不规则形。2dyns/cm2剪切力作用0.75h后,细胞间隙加大,部分细胞形状变圆、变小;作用后1.5h,细胞极性改至与剪切力作用方向一致。静态条件下,肌动蛋白呈黄绿色丝状分布于中央细胞内,排列松散不规则且微丝较细;剪切力作用3h后,肌动蛋白增多增粗,且沿切力方向排列于中央和远周边细胞。剪切力作用后,RPE细胞syndecan-1的表达在0.5h时最弱,1h时最强;VCAM-1的表达在0.5h时最弱,1.5h时最强;E-selectin的表达在0.75h时最低,3h时最高。结论:剪切力可引起RPE细胞syndecan-1,VCAM-1和E-selectin及细胞骨架蛋白发生变化,它们之间的相互协作对RPE细胞的形态、黏附和力学信号转导起重要作用。     

鼻内镜下腺样体切除术治疗儿童分泌性中耳炎

目的 探讨鼻内镜下吸割器切除腺样体治疗儿童分泌性中耳炎的疗效.方法 儿童分泌性中耳炎伴腺样体肥大52例,随机分为2组:治疗组在药物治疗的同时切除肥大的腺样体;对照组行单纯药物治疗,观察2组转归情况.结果 治疗后1个月治疗组有效率为93.95﹪,对照组为84.22﹪,差异无统计学意义(χ2=1.41,P=0.394).治疗后13个月治疗组有效率为87.88﹪,对照组为57.89﹪,差异有统计学意义(χ2=12.00,P=0.009).结论 鼻内镜下吸割器切除腺样体治疗儿童分泌性中耳炎是一种微创手术,可提高疗效,尤其是提高远期疗效.     

上鼓室根治术及鼓室成形术40耳治疗体会△

目的 观察经外耳道入路上鼓室根治术(上鼓室切除术)联合上鼓室重建、鼓室成形术治疗中耳胆脂瘤和慢性中耳炎的临床疗效。方法 回顾分析2016年1月~2018年12月随访完整的38例40耳临床资料,包括中耳胆脂瘤22耳、慢性活动期中耳炎18耳。采用外耳道入路上鼓室切开术清除病灶,通畅引流;以自体耳屏或耳甲腔软骨重建上鼓室。行单纯鼓膜成形术10耳,人工部分听骨赝复物(PORP)植入28耳,全听骨赝复物(TORP)植入2耳;显微镜手术27耳,全耳内镜手术13耳。术后随访0.5~3.5年,观察术腔愈合、听力改善及复发情况。结果 上鼓室自清洁内陷袋形成伴气导听力下降1耳,其余病例上鼓室、鼓膜和外耳道形态结构均恢复良好,随访未见复发。纯音测听:0.5、1、2、3 kHz频率区域的气骨导差(ABG)由术前(28.78±10.78)dB 缩小到术后(15.40±9.51)dB,差异有统计学意义(t=6.886, P<0.001);1、2、4 kHz高频骨导水平,术前(24.04±14.97)dB、术后(19.76±8.75)dB,差异无统计学意义(t=1.985,P>0.05),提示手术未造成高频骨导恶化。结论 外耳道入路上鼓室根治术,有利于清除局部病灶,改善引流,可避免不必要的乳突气房开放,联合上鼓室重建及鼓室成形术,可较好恢复鼓膜和外耳道的形态、结构,术后恢复快,复发率低,可有效提高听力。耳内镜下操作有助于清除隐匿病灶,减少去骨。     

大鼠癌钙调蛋白基因原核表达载体的构建及表达

目的 在原核表达载体中构建癌钙调蛋白（OM）基因,并对构建的原核表达质粒进行表达和鉴定.方法 取SD大鼠6只,提取腹腔巨噬细胞并活化,提取总RNA,设计引物对OM基因进行RT-PCR扩增.通过中间载体pUC57进行目的 基因克隆,将阳性克隆质粒酶切,与原核表达载体pET-22b（＋）连接,转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α,菌检PCR筛选阳性克隆后小量提取质粒,送样行核苷酸序列分析鉴定.成功构建的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组体的表达,并用Western blot鉴定表达产物.结果 琼脂糖凝胶电泳获得目的 基因OM,大小为350 bp左右,与预期的目的 基因大小一致.构建的重组质粒pET-22b（＋）/OM菌检PCR获得长度为500 bp左右的阳性克隆,与预期大小一致.抽提质粒经核苷酸序列分析后表明,克隆的片段与OM基因序列一致.在IPTG的诱导下,重组体表达出分子量约11.7 kD的表达产物,Western blot结果证实其为目的 蛋白.结论 实验成功构建了OM基因原核表达载体及其表达,为该蛋白促进视神经损伤后再生的研究奠定了基础.     

肺表面活性物质鼻内给药对豚鼠急性分泌性中耳炎的治疗作用

目的研究肺表面活性物质鼻内给药对豚鼠急性分泌性中耳炎的治疗作用,为临床应用肺表面活性物质治疗分泌性中耳炎奠定基础。方法豚鼠鼓室内注射灭活的流感嗜血杆菌,建立豚鼠急性分泌性中耳炎动物模型（听力下降、中耳积液）。50只豚鼠随机取10只作为正常组（A组）,40只中31只双耳造模成功,随机分为造模组（B组）10只;生理盐水组（C组）10只;肺表面活性物质组（PS组,D组）11只。观察各组鼓膜形态,记录声导抗鼓室图和听性脑干反应（ABR）阈值,计量资料采用单因素方差分析。结果A组鼓膜透亮,光锥形态正常;鼓室图A型;ABR阈值为（14．1±4．8）dBHL。B组鼓膜浑浊,光锥消失,鼓室积液;鼓室图为B型或C型;ABR阈值提高至（51．2±6．3）dBHL,与A组比较差异有统计学意义。C组鼓室积液无明显变化,鼓膜浑浊;ABR阈值为（52．8±7．1）dBHL,与B组比较差异无统计学差异。肺表面活性物质滴鼻7d后,D组鼓室积液减少或消失;鼓室负压降低;ABR阈值降至（27．4±8．8）dBHL,与B组、c组比较差异有统计学意义。结论肺表面活性物质滴鼻给药可以显著降低分泌性中耳炎豚鼠的中耳负压和ABR阈值。     

腺样体肥大及咽鼓管咽口形态学特征与慢性分泌性中耳炎相关性的临床观察

目的探讨儿童腺样体肥大病程、咽鼓管咽口形态学特征及腺样体与咽鼓管圆枕（以下简称咽圆枕）的毗邻关系与分泌性中耳炎（OME）病因的相关性。方法根据腺样体肥大的病程,将156例腺样体肥大患儿分为半年以下组和半年以上组;将咽鼓管咽口的形态分为三角形、圆形、裂缝形和脐形4类;将腺样体与咽圆枕的毗邻关系分为3型;观察3种分组情况下OME的发病率差异有无统计学意义。结果不同病程组及不同咽鼓管咽口形态组的OME发病率差异无统计学意义（P〉0．05）;不同的腺样体与咽圆枕的毗邻关系组之间OME发病率差异有统计学意义（P〈0．001）。结论腺样体肥大的病程及咽鼓管咽口形态学改变在儿童OME发病中并不重要,而肥大的腺样体与咽圆枕的毗邻关系在儿童OME的发病中可能起到关键作用。     

rhLEDGF P52基因原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化

目的构建rhLEDGFp52基因原核表达载体,获得rhLEDGFp52蛋白。方法利用基因重组技术将rhLEDGFp52基因构建于原核表达载体pET30a(+)中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后,通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,经免疫蛋白印迹试验对rhLEDGFp52进行鉴定并用Ni-NTAHis.Bind.Resin方法进行纯化。结果成功构建rhLEDGFp52基因原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得可溶性形式表达,rhLEDGFp52蛋白表达量占菌体蛋白总量的34.63%.WesternBlot结果显示rhLEDGF2蛋白能够特异性与LEDGF-ab结合。Ni-NTAHis.Bind.Resin方法进行纯化后的rhLEDGFp52,最终质量浓度达520mg·L-1,分析其纯度达87.93%.结论成功获得rhLEDGFp52蛋白,这为深入研究其生物学功能奠定了基础。     

rhLEDGF p52基因原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化

目的 :构建 rhLEDGF p52 基因原核表达载体 , 获得rhLEDGF p52 蛋白。方法:利用基因重组技术将 rhLEDGF p52 基因构建于原核表达载体 pET30a( )中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后,通过 IPTG 诱导在大肠杆菌 BL21(DE3)中获得表达,经免疫蛋白印迹试验对 rhLEDGF p52 进行鉴定并用 Ni-NTA His.Bind.Resin 方法进行纯化。结果:成功构建 rhLEDGF p52 基因原核表达载体,在大肠杆菌 BL21(DE3)中获得可溶性形式表达,rhLEDGF p52蛋白表达量占菌体蛋白总量的 34.63%。Western Blot 结果显示 rhLEDGF2 蛋白能够特异性与 LEDGF-ab 结合。Ni-NTA His.Bind.Resin 方法进行纯化后的 rhLEDGF p52,终浓度达 520mg/L,分析其纯度达 87.93%。结论:获得 rhLEDGF p52 蛋白,这为深入研究其生物学功能奠定了基础。     

成人分泌性中耳炎预后相关因素及临床疗效研究

目的分析成人分泌性中耳炎(OME)临床因素与预后的关系,找出影响成人OME治疗疗效的相关因素。方法收集291例(342耳)成人OME患者的基本资料,了解患者30 d内上呼吸道感染史、变应性疾病史、鼻及鼻窦疾病病史,评估患者咽鼓管功能。统计各临床因素与治疗有效率的相关性。比较上呼吸道感染是否合并咽鼓管功能不良与鼻及鼻窦疾病病史是否合并咽鼓管功能不良疗效的差异。结果①单因素分析显示,患者的性别(P=0.974)、单双侧发病情况(P=0.296)差异无统计学意义,与疾病疗效无明显相关性。而上呼吸道感染病史(P=0.049)与患者的疗效及预后呈正相关;鼻及鼻窦疾病病史(P=0.005)、咽鼓管功能状况(P=0.001)与患者的疗效及预后呈负相关,差异均有统计学意义。②多因素分析显示,上呼吸道感染病史(P=0.019,RR=1.692)、鼻及鼻窦疾病病史(P<0.001,RR=0.392)、咽鼓管功能不良(P<0.001,RR=0.248)仍与患者治疗疗效及预后相关。③鼻-鼻窦疾病病史合并咽鼓管功能不良治疗有效率明显降低(与鼻及鼻窦疾病病史且咽鼓管功能正常、上呼吸道感染合并或不合并咽鼓管功能不良相比,差异有统计学意义;慢性中耳炎发生率及鼓膜置管率明显升高,差异有统计学意义)。结论成人OME的危险因素为上呼吸道感染、鼻-鼻窦疾病、咽鼓管功能不良。鼻-鼻窦疾病合并咽鼓管功能不良是成人OME保守治疗效果欠佳的重要因素。     

癌钙调蛋白／鱼精蛋白截短体融合基因在原核表达载体中的构建及鉴定

目的在原核表达载体中构建癌钙调蛋白（OM）／鱼精蛋白截短体（tp）融合基因,进行基因测序鉴定。方法提取SD大鼠腹腔巨噬细胞,并进行细胞计数,经巨噬细胞特异性抗体CD68鉴定。设计引物扩增OM基因,并在其3’端引入印的编码基因,经PCR扩增获得OM／tp融合基因,通过中间载体PUC57进行目的基因克隆,将阳性克隆质粒酶切,与原核表达载体PET32a连接,转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,小量提取质粒,送样经公司测序鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳获得OM／tp目的基因,与预期的目的基因大小一致,回收目的基因与中间载体PUC57连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后,菌检PCR获得约500bp的阳性克隆,与预期大小一致。抽提质粒PUC57-OM／tp,经测序鉴定后与预期的序列一致。质粒PUC57-OM／tp酶切后与载体PET32a连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,菌检PCR获得约500bp的阳性克隆,与预期大小一致。抽提质粒PET32a—OM／tp经测序后与预期的序列一致。结论OM／tp融合基因的成功构建,为该融合蛋白促进视神经损伤后再生的研究奠定了基础。