人神经干细胞移植治疗大鼠脑创伤观察

目的:探讨人神经干细胞(NSCs)移植治疗大鼠脑创伤的可行性.方法:取孕14周流产胎儿脑组织,进行NSCs培养及鉴定,并应用Hoechest33258标记细胞.54只大鼠随机等分为假损伤组(A组)、治疗对照组(B组)及NSCs移植组(C组).采用自由落体撞击法制作大鼠脑创伤模型后,C组给予NSCs移植,B组给予生理盐水,A组不打击脑组织.3组分别于移植术后2 d及7 d进行大鼠行为学评分,分别于植术后2周和4周行Y迷宫试验测学习和记忆评分.移植后3 d、7 d脑组织切片荧光显微镜下观察移植细胞存活情况,移植后2周、4周行GFAP、NSE免疫组织化学染色.结果:NSCs移植后2 d行为学评分3组之间差异有统计学意义(P=0.00),B、C组间差异无统计学意义(P=0.09);移植后7 d行为学评分3组间差异有统计学意义(P=0.00),A、C组间差异无统计学意义(P=0.10);移植后2周学习评分和4周记忆评分3组间差异均有统计学意义(P=0.00),B、C组间差异均有统计学意义(P=0.00);C组脑组织GFAP、NSE染色阳性,可见标记的NSCs.结论:人NSCs植入大鼠创伤脑内后,可存活并和宿主组织融合在一起,促进大鼠行为学恢复,提高学习和记忆能力,并分化为神经元和神经胶质细胞.NSCs移植为治疗脑创伤提供了新的方法.     

神经干细胞移植抑制缺血再灌注大鼠脑内星形胶质细胞的激活和炎症反应

目的观察神经干细胞(NSCs)移植对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和炎症因子(IL-1β、TNF-α)表达的影响,探讨其可能的作用机制。方法大鼠随机分为脑组织缺血再灌注损伤模型组(MCAO组)和神经干细胞移植组(MCAO+NSCs组),每组16只,干细胞移植后进行神经功能损害评分(NSS),采用蛋白质免疫印迹法和免疫组织化学法检测脑组织GFAP表达,蛋白质免疫印迹法检测脑组织IL-1β、TNF-α的表达。结果移植后2周、4周神经功能评分显示MCAO+NSCs组显著优于MCAO组(P<0.05);MCAO+NSCs组Nestin、Brdu阳性细胞数多于MCAO组(P<0.05),GFAP阳性细胞数显著少于MCAO组(P<0.05);MCAO+NSCs组IL-1β、TNF-α表达水平显著低于MCAO组(P<0.05)。结论 NSCs移植可能通过抑制脑组织星形胶质细胞的激活、降低脑内炎症反应对大鼠缺血再灌注损伤脑组织发挥保护作用。     

永生化神经前体细胞治疗大鼠局灶性脑缺血的实验研究

目的 探讨永生化神经前体细胞(INPC)移植对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响及移植细胞在模型大鼠脑内的存活以及分化情况.方法 雄性SD大鼠24只,均采用线栓法建立大脑中动脉缺血(MCAO)模型,随机分为2组(每组12只):脑缺血对照组、INPC移植组.缺血后3 d通过立体定位注射方法分别将等体积的磷酸盐缓冲液、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的INPC悬液注射到2组大鼠纹状体缺血半暗带区.缺血再灌注后对大鼠进行神经损害严重程度评分(NSS).细胞移植后1和4周分别随机处死2组大鼠各6只,取脑组织制作冰冻切片,通过免疫荧光双标技术检测BrdU、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)双阳性细胞和BrdU、神经元特异性烯醇化酶(NSE)双阳性细胞,观察INPC在移植区域的存活及分化情况.结果 脑缺血对照组与INPC移植组比较,细胞移植前后各时点的NSS评分差异均无统计学意义(均P＞0.05).INPC移植组细胞移植后1及4周,均可在移植针道附近及缺血灶周围检测到聚集较明显的BrdU免疫荧光染色阳性的植入细胞,并观察到BrdU染色阳性细胞扩散至全脑,免疫荧光双标技术检测见部分细胞为BrdU、GFAP双阳性的星形胶质细胞或BrdU、NSE双阳性神经元.结论 INPC可在局灶性脑缺血大鼠脑内存活并分化为神经元和星形胶质细胞.     

GDNF基因修饰的神经干细胞移植治疗大鼠局灶性脑缺血的实验研究

目的:观察转染胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)基因的神经干细胞(Neural stem cells ,NSCs)移植在脑缺血大鼠脑组织的分布,探讨其神经保护作用.方法:体外培养新生大鼠NSCs,采用改良的线栓法制作脑缺血再灌注模型,3 d后用脑立体定位仪分别经脑室移植生理盐水、NSCs和GDNF/NSCs.各组移植前及再灌注1～7周进行神经功能损伤程度评分(Neurological severity scores,NSS).免疫组织化学方法观察移植后NSCs的存活及分布情况.结果:NSCs经GDNF基因转染后2 d发绿色荧光,抗nestin免疫荧光检测呈阳性.GDNF/NSCs组与NSCs组NSS评分比较,在再灌注2周和3周显著降低(P＜0.05).移植的NSCs分布于缺血侧皮质、纹状体,移植后3、5、7周,阳性细胞数分别较1、2周显著增多(P＜0.05).GDNF/NSCs组与NSCs组比较,第2、3、5、7周纹状体、皮质阳性细胞数显著增多(P＜0.05).从病理学上观察,GDNF/NSCs组神经毡较NSCs移植组致密.结论:移植GDNF基因修饰的神经干细胞能改善脑缺血大鼠神经功能,对脑缺血所致的损伤具有一定修复作用.     

嗅鞘细胞联合神经干细胞对大鼠急性脊髓损伤及脑源性神经营养因子表达的影响

目的:探讨嗅鞘细胞(OECs)联合神经干细胞(NSCs)对大鼠急性脊髓损伤及脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)表达的影响。方法:取新生3 d SD大鼠的海马和嗅球制备神经干细胞和嗅鞘细胞,对80只SD大鼠做急性脊髓损伤造模,随机分为对照组(假手术组)、NSCs移植组、OECs移植组、NSCs+OECs联合移植组(记为实验A、B、C组),细胞移植。于术前,术后1、3、7、14、21 d行BBB评分、斜板实验和运动诱发电位(MEP N1波)潜伏期检测,在各组随机抽一只SD大鼠做免疫组化,观察比较受损脊髓中BDNF的表达情况。结果:(1)BBB评分变化:除第1天外,各实验组恢复程度均明显大于对照组(P0.05),第7天开始各实验组间两两比较差异均有统计学意义(P0.05)。(2)斜板试验角度变化:第1周开始,四组中任意两组比较差异均有统计学意义(P0.05)。(3)MEP(N1波)潜伏期变化:自第3天,四组中任意两组比较差异均有统计学意义(P0.05)。(4)BDNF染色阳性细胞数变化:细胞移植后,各组大鼠受损脊髓中BDNF开始升高,第3天到高峰后减少。术后第3天开始,四组中任意两组比较均有统计学意义(P0.05)。结论:采用细胞移植治疗大鼠急性脊髓损伤,OECs与NSCs联合移植治疗效果最佳;单细胞移植时,OECs比NSCs移植治疗效果更强。联合移植组中BDNF表达最高。     

脐血间充质干细胞治疗大鼠脑缺血性损伤的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞(UCB-MSCs)移植对大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠神经功能恢复的治疗效果及其作用机制。方法 MCAO模型大鼠随机分为实验组(n=20)和对照组(n=10),实验组大鼠经尾静脉输入经BrdU(5-溴脱氧核苷尿嘧啶)标记的UCB-MSCs,对照组尾静脉注射等量PBS,分别对大鼠神经功能缺损情况进行评分,并测定大鼠梗死灶体积,计数脑组织中BrdU阳性细胞、BrdU/NSE(神经元特异性烯醇化酶)、BrdU/GFAP(胶质纤维酸性蛋白)双阳性细胞。结果移植UCB-MSCs可有效降低MCAO大鼠神经功能缺损评分,减少大鼠脑梗死灶体积,并且实验组大鼠脑缺血区及周围组织中可检测到BrdU阳性细胞,及少量BrdU/NSE、BrdU/GFAP双阳性细胞。结论移植的UCB-MSCs能逐渐向MCAO大鼠脑缺血区及周围迁移,并可分化为神经元细胞及神经胶质细胞,促进脑缺血性大鼠神经功能恢复。     

大鼠骨髓间质干细胞脑内移植后分化行为的观察

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)植入大鼠脑内后,在脑微环境作用下的分化行为.方法:梯度离心法分离、培养、纯化MSC,Hoechst33342标记后植入大鼠海马CA4区;1,2,4周后处死大鼠取脑,制作冷冻切片;观察Hoechst33342阳性细胞,免疫荧光法CY3显示神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase, NSE)、神经巢蛋白(nestin)、神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)阳性表达细胞.结果:MSC植入后可见大量细胞存活,沿针道、注射区向周围散在分布,植入细胞有呈红色荧光的NSE,nestin,GFAP及NGF阳性表达细胞.结论:MSC植入动物脑内后能够存活,并分化为神经系统样细胞,表达功能产物NSE、nestin、GFAP及NGF.     

NSCs与OECs联合移植改善TBI大鼠运动功能

目的:探讨NSCs与OECs联合移植对TBI大鼠运动功能修复的作用。方法:85只SD成年大鼠采用经典的Feeney氏法自由落体撞击法造成TBI运动功能损伤。剔除死亡及不合格的10只,余75只大鼠随机分为损伤对照组(A组)、NSCs移植组(B组)、NSCs与OECs联合移植组(C组)。各组均咬开骨窗,显露硬膜,于造模后1、7、14、25、30天进行神经功能评分并取材行HE及免疫组化染色,比较各组行为学评分及组织染色结果。结果:各组25只大鼠均进入分析,B组、C组7天、14天、25天、30天较A组有显著差异性(P<0.05),C组在25天、30天与B组比较有显著差异性(P<0.05)。结论:NSCs联合OECs移植能改善TBI大鼠运动功能,且治疗效果优于NSCs移植。     

磁性纳米粒标记的神经干细胞不同移植途径对大鼠脑损伤治疗的实验研究

目的 探讨脑损伤后不同移植途径神经干细胞的迁移及分布情况并进行对比研究.方法 体外培养的胚胎神经干细胞,采用Feeney自由落体脑创伤模型制成大鼠脑损伤模型,超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)标记神经干细胞,并将其分别经枕大池穿刺注射入脑损伤大鼠蛛网膜下腔的脑脊液中及经立体定向脑内注射移植,分别进行大鼠运动功能缺失的神经功能评价、磁共振示踪及大鼠脑切片普鲁士蓝染色.结果 接受神经干细胞移植的两组大鼠神经运动功能评分均较损伤对照组明显提高(P<0.05),两移植组大鼠神经运动功能评分无明显差别.接受神经干细胞移植的两组大鼠神经运动功能评分均较损伤对照组明显提高(P<0.05),两移植组大鼠神经运动功能评分无明显差别.标记组移植经枕大池移植的神经干细胞即刻的MRI即可观察到大鼠脑内的移植标记细胞,移植后2周脑挫伤即可见到低信号影,组织切片的普鲁士蓝染色与MRI结果相符.结论 经枕大池移植的神经干细胞具有远距离迁移能力,并能像脑内移植一样明显有助于大鼠神经运动功能的恢复.用MRI活体示踪移植磁化标记神经干细胞在TBI模型大鼠脑内迁移和分布是可行的.     

人胚神经干细胞移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的实验研究

目的:研究侧脑室注射人胚神经干细胞(hNSCs)移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠的有效性及hNSCs在EAE大鼠脑内的状况。方法:从自然流产的孕9～15周的人胚脑组织中分离、培养神经干细胞。用豚鼠全脊髓匀浆免疫Wistar大鼠制备EAE大鼠模型,分别在免疫后10、15、21天经侧脑室注射移植未分化的hNSCs入大鼠体内,观察hNSCs对EAE动物模型神经功能评分、脑内脱髓鞘病灶数目的影响,免疫组化方法观察移植后的hNSCs在EAE大鼠脑内存活、迁徙、分化的状况。结果:从人胎脑中成功培养出hNSCs,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球。绝大多数细胞表达神经干细胞的标记物神经巢蛋白(nestin)。hNSCs移植组各时间点大鼠脑组织切片中均可见Brdu、nestin、NSE、GFAP、CNPase染色阳性细胞,CNPase阳性的少突胶质细胞比例随时间的延长而逐渐增多;hNSCs移植组大鼠自免疫后30天起其神经功能评分显著低于对照组(P<0.05);移植后20、30天脑内脱髓鞘病灶数目明显少于对照组(P<0.05)。结论:hNSCs体内体外均具有多向分化潜能,受炎症部位微环境信号的影响分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞。hNSCs移植能有效改善EAE动物的神经功能评分,减少病灶数目。     

大鼠创伤性颅脑损伤后脑室下区内源性神经干细胞的增殖与分化

目的探讨创伤性脑损伤后脑室下区（SVZ）神经干细胞（NSCs）的增殖分化的时程变化。方法采用随机数字表法将大鼠 分为3组,对照组不做任何处理,假手术组仅切开头皮和颅骨开窗,实验组采用Feeney氏法造成颅脑损伤（TBI）。选用Nestin与 BrdU两种细胞标志物及神经元特异标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）及胶质细胞标志物GFAP,采用免疫荧光化学方法对3 组脑组织标本分别行双标蛋白抗体免疫荧光染色,检测TBI 后SVZ 内源性NSCs 的增殖、分化变化。结果TBI 后,伤侧 SVZNestin/NSE 、Nestin/GFAP、BrdU/NSE、BrdU/GFAP标记阳性细胞均明显增多,伤后第1天开始升高,第3天达峰值,第14天 恢复正常,实验组4个时间点间及实验组与对照组对应时间点间的比较差异均有显著性意义,其中以Nestin/GFAP标记的增殖分 裂阳性细胞升高最显著。结论TBI后,动员了伤侧SVZ中的NSCs,诱导该区内源性NSCs的增殖分化,提示SVZ是NSCs增殖 分化的重要的生发中心之一。     

Differentiation of rat neural stem cells and its relationship with environment

Objective To explore the differentiation fates of rat neural stem cells (NSCs) in different environmental conditions. Methods NSCs derived from 16-day-old rat embryo were proliferated in vitro and implanted into the brain of rats with intra-cerebral hemorrhage. At the same time some NSCs were co-cultured in vitro with Schwann cells derived from newborn rats. MAP-2, GFAP and GalC (which are the specific markers of neural cells, astrocytes and oligodendrocytes respectively),BrdU and β-tubulin were detected by immunohistochemical and immunofluorescent methods.Results BrdU positive cells that were implanted into the brain distributed around the hemorrhagic area.The majority of them were GFAP positive astrocytes while a few of them were β-tubulin positive neural cells or GalC positive oligodendrocytes. After being co-cultured with Schwann cells in vitro,NSCs are predominately shown β-tubulin and MAP-2 positive,and only a minority of them were GFAP or GalC positive.Condusions The hemorrhagic environment in vivo induces NSCs to differentiate mainly into astrocytes while co-culture with Schwann cells in vitro induce the majority of NSCs to differentiate into neural cells.     

神经干细胞移植对脑挫伤大鼠神经功能恢复神经元存活和轴突再生的影响

目的 观察神经干细胞(NSCs)移植对脑挫伤大鼠神经功能恢复影响,并探讨其机制.方法 24只SD大鼠以投币法分为3组:假手术组、手术组和NSCs移植组.采用自由落体致大鼠皮质运动区脑损伤模型,将培养纯化并鉴定的NSCs于术后当天移植入损伤位点周围;术后0d、3d、7d、14d行神经功能缺失(NSS)评分,观察动物运动和平衡功能缺损与恢复情况;14d时取脑组织用免疫荧光技术检测hochest标记的移植NSCs在体内存活、迁移;用神经元核蛋白(NeuN)、生长相关蛋白(GAP-43)抗体检测并计数宿主神经元存活和局部轴突再生.结果 与假手术组比较,脑外伤组大鼠脑挫伤后即出现不同程度抽搐,瘫痪,平衡功能缺失.神经功能缺损评分较假手术组明显升高,并随时间推移有所降低.而NSC移植组的NSS评分至第7天后与单纯手术组比较有明显减少[(4.38±0.74)分,(5.50±1.07)分,P＜0.01].Ho-chest标记的移植NSCs能在宿主脑组织存活,并向四周迁移.免疫组化染色显示宿主NeuN阳性神经元[(51.46±3.303)个,(42.83±5.401)个,P＜0.01]和GAP-43阳性纤维数量[(13.3±1.7)个,(8.7±1.1)个,P＜0.01]在NSC移植组明显增多.结论 NSCs移植能在挫伤脑组织存活、迁移,并促进宿主神经元存活、局部轴突再生和改善脑挫伤大鼠神经功能.     

神经干细胞移植联合PEP-1-SOD1对颅脑损伤大鼠神经功能恢复的影响

目的:探讨神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植联合PEP-1-SOD1对颅脑损伤后大鼠神经功能恢复的影响?方法:SD雄性大鼠80只,建立颅脑损伤模型后随机分为4组:对照组(损伤处注入生理盐水)?NSCs移植组(损伤处注入NSCs悬液)?SOD1组(损伤处注入PEP-1-SOD1蛋白)及NSCs+SOD1组(损伤处注入NSCs 悬液+PEP-1-SOD1蛋白)?4 d后采用定量PCR及Western blot法分别检测小鼠脑组织中AQP4基因表达及蛋白合成变化;分别于损伤后1?3 d和1?2?3?4周行Bederson评分,损伤后23~28 d行Morris水迷宫试验对大鼠运动神经功能进行评价;伤后第4周取材行病理切片BrdU 免疫组织化学染色?结果:脑损伤后4 d,对照组脑损伤周围组织AQP4及其mRNA的表达高于NSCs移植组及SOD1组,NSCs移植组及SOD1组均高于NSCs+SOD1组(P < 0.05)?分别于损伤后1?3 d及1?2?3?4周行Bederson评分显示4周时各组大鼠Bederson评分均低于24 h,并且4周时Bederson评分NSCs+SOD1组低于对照组(P < 0.05)?Morris 水迷宫试验结果显示NSCs+SOD1组神经功能改善较对照组明显(P <0.05)?免疫组化染色结果显示NSCs+SOD1组大鼠损伤灶脑组织中的BrdU 阳性细胞数高于NSCs移植组?SOD1组和对照组(P <0.05)?结论:神经干细胞移植可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能,联合应用PEP-1-SOD1有协同效果?     

成年小鼠脑室下区神经干细胞培养与鉴定体系的建立

目的 建立系统的成年小鼠脑室下区神经干细胞分离、培养及鉴定体系.方法 用无血清方法分离培养成年小鼠脑室下区来源的神经干细胞;用克隆培养、BrdU整合的方法检验培养细胞的干细胞特性;用免疫荧光细胞化学方法检测Brdu、神经干细胞标记物nestin和SOX2,分化的细胞标记物Tuj1、GFAP、NG2.用Western boltting和RT-PCR方法进一步检测神经干细胞标记物nestin和SOX2的表达.结果 从成年小鼠脑室下区分离培养出具有自我更新、增殖的神经球,构成神经球的细胞nestin和SOX2呈阳性,它们分化后产生Tujl阳性的神经元、GFAP阳性的星型胶质细胞、NG2阳性的少突胶质细胞.结论 建立了简单、稳定的培养成年小鼠脑室下区神经干细胞方法.     

沉默核仁素可诱导大鼠神经干细胞的分化

目的 探讨核仁素(nucleolin)对原代神经干细胞(NSCs)分化的影响及其相关机制.方法 构建核仁素siRNA腺病毒表达载体,将经鉴定正确的重组腺病毒质粒转染HEK293A细胞,包装得到具有感染能力的nucleolin-siRNA重组腺病毒.病毒体外感染原代NSCs,采用Western blot检测nucleolin蛋白的表达情况,Nucleolin-siRNA对神经干细胞Nestin、Wnt3、β-catenin蛋白表达的影响;采用免疫细胞化学检测nucleolin-siRNA对神经干细胞分化的影响.结果 经酶切和测序鉴定均证实nucleolin-siRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误.Western blot检测结果显示,转染nucleolin-siRNA2的细胞nucleolin表达明显受到抑制.siRNA+组NSCs分化为NSE阳性细胞和GFAP阳性细胞的分化率明显比CON组、siRNA-组增加,且差异具有统计学意义(P<0.01).与阴性对照组相比,siRNA+组Nestin的表达明显减少,Wnt3表达明显增多,β-catenin入核明显增多,其差异具有统计学意义(P<0.05).结论 本研究成功地构建了针对nucleolin基因的siRNA重组腺病毒载体,沉默nucleolin可诱导神经干细胞的分化,其机制可能与Wnt信号转导通路的激活有关.     

GDNF基因修饰的神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后GFAP表达的影响

目的探讨胶质源性神经营养因子（glial cell line-derived neural factor,GDNF）基因修饰的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）移植对大鼠脑缺血后（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的表达的影响。方法建立大鼠暂时性大脑中动脉梗塞模型（middle cerebral artery occlusion,MCAO）,再灌注3d,并将其随机分为：生理盐水移植组（NS）、神经干细胞移植组（NSCs）和GDNF基因修饰的神经干细胞移植组（GDNF/NSCs）。采用脑立体定位仪将移植入大鼠的右侧脑室。再灌注1、2、3、5、7周的各时间点,处死大鼠,取同侧大脑半球,用Western blotting观察GFAP的表达。结果 GDNF/NSCs组、NSCs组和NS组GFAP蛋白均在2周达到高峰,后逐渐降低。而再灌注1~7周,GDNF/NSCs组的GFAP蛋白显著高于NS组（P〈0.001）;GDNF/NSCs组GFAP蛋白显著高于NSCs组（P〈0.01）。再灌注1~5周,NSCs组GFAP蛋白显著高于NS组（P〈0.001）。结论 GDNF/NSCs移植治疗大鼠缺血再灌注的神经保护作用,其机制可能与促进GFAP的表达有关。