DDR2RNA干扰对CCl4诱导肝纤维化动物模型的实验研究

目的 探讨沉默大鼠盘状结构域受体2(discoidin domain receptor 2,DDR2)基因表达对CCl4诱导大鼠肝纤维化的影响及其机制.方法 SD大鼠随机分为正常组(8)、纤维化组(18)、阴性对照组(18)和治疗组(18),每组又据干预时间不同平均分为4周、6周两组.化学合成经胆固醇修饰的siRNA-DDR2尾静脉体内注射,干扰CCl4诱导大鼠纤维化模型DDR2基因表达.用荧光实时定量PCR及Western blot分别检测干扰DDR2基因后DDR2、MMP-2和Ⅰ型胶原纤维(COLⅠ)的表达;同时行肝脏组织学观察及肝功能检测.结果 经siRNA-DDR2干扰后,纤维化组大鼠DDR2、MMP-2和COL Ⅰ的mRNA水平(t4=6.78,t6=9.02;t4=4.71,t6=6.37;t4=8.81,t6=6.50,均P＜0.01)及蛋白表达水平(t=6.11,t=4.39,t=5.23,均P＜0.01,4周;t=7.82,t=4.80,t=7.64,均P＜0.01,6周)均显著降低;同时,肝脏的组织学病变及肝功能指标也显著改变.结论 尾静脉注射化学合成经胆固醇修饰的抗DDR2siRNA能显著降低DDR2基因表达,促进细胞外基质降解,具有潜在的抗肝纤维化作用.

Abstract：

Objective To explore the effects of silencing DDR2 expression by siRNA on CCl4-induced liver fibrosis and its mechanism in rats. Methods Liver fibrosis model was induced by intraperitoneal injection of CCl4 twice a week for 6 consecutive weeks. Some rats were administered siRNA targeting DDR2 (0. 3 mg/kg), saline or control siRNA every three days from the beginning of CCl4 injection via tail vein injection, while other rats were treated in the same pattern after 2-week CCl4 injection. Quantitative real-time polymerase chain reaction (QRT-PCR) and Western blot were used to detect the mRNA and protein expressions of DDR2, MMP-2 and COL Ⅰ . Meanwhile, the pathological changes of liver tissues and the levels of liver function were also observed. Results QRT-PCR showed that the DDR2, MMP-2 and COL Ⅰ mRNA in the chemically synthetic cholesterol-modified siRNADDR2 group were significantly decreased as compared with those in the control group (P＜0.01) ,and the protein expressions of DDR2, MMP-2 and COL Ⅰ were also significantly decreased (P＜0. 01,4 wand 6w). In addition, in comparison with those in the control group, the pathological changes of liver tissues in the siRNA-DDR2 treated group were markedly attenuated, and the levels of ALT(1356.17 ±83.80 nkat/L vs 2532. 70±145.11 nkat/L,4w,1367. 60±321.76 nkat/L vs 2604.37±255.02 nkat/L,6w,P＜0. 01 ) and AST (2460. 80 ± 207. 58 nkat/L vs 3983. 70 ± 253. 08 nkat/L, 4w, P＜ 0. 01,2383.27±290.16 nkat/L vs 3227.70±353. 34 nkat/L,6w,P＜0. 05)were also significantly lowered,while the level of TBIL (7. 97 ± 1.60 μmol/L vs 3.80± 0.60 μmol/L, 4w, 10.40±1.61 μmol/L vs 6.10±0.79 μmol/L,6w,P＜0. 01)was markedly increased. Conclusion Systemic administration of cholesterol-modified siRNA targeting DDR2 could significantly suppress the expression of DDR2, decrease the contents of the extracellular matrix,and thus has a potential antifibrotic effect.     

抗血小板衍生生长因子小干扰RNA表达质粒构建及其对肝星状细胞的影响

目的 研究靶向PDGF-B链的小干扰RNA(siRNA)对肝星状细胞(HSCs)细胞外基质分泌的影响.方法 根据PDGF-B链序列设计合成siRNA序列,将siRNA序列插入pSilencer 3.1-H1hygro质粒,酶切后测序鉴定;PDGF-B链siRNA表达质粒转染HSCs,潮霉素筛选阳性细胞株,RT-PCR和Western blot分别检测PDGF Mrna和蛋白的表达;将各组筛选的阳性HSCs细胞株培养,MTT观察各组细胞增殖,放射免疫法检测HSCs细胞株上清液中透明质酸和Ⅲ型前胶原的表达. 结果 成功构建3种表达PDGF-B链siRNA表达质粒,RT-PCR和Western blot结果表明各siRNA表达质粒阳性HSCs细胞PDGF Mrna和蛋白表达均有明显抑制.PDGF-B链siRNA表达质粒HSCs细胞组较对照组能明显降低HSCs增殖,下调透明质酸和Ⅲ型前胶原表达.结论 靶向PDGF-B链的siRNA能降低HSCs增殖和分泌细胞外基质的能力,具有抗纤维化治疗的潜力.     

siRNA干扰ADAMTS2基因对肝星状细胞的影响

目的 探讨siRNA干扰大鼠含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶2(ADAMTS2)基因后对大鼠肝星状细胞(HSC)生物学特性的影响及其机制,评估ADAMTS2基因作为一种新的靶向基因在抗肝纤维化治疗中的应用前景.方法 设计并化学合成3对针对大鼠ADAMTS2 mRNA 2237、2597及690位点的siRNAs.用筛选出的抑制效率最高的siRNA体外转染HSC-T6,应用实时PCR、Westem blot及MTT等方法研究沉默ADAMTS2基因对大鼠HSC活化、增殖等生物学特性及对基因ADAMTS2、α-SMA、COL1α1、COL(I)、TGF-β1、MMP-2和TIMP-3表达的影响.结果 在相同注射剂量(50 nmol/L)及时间(48 h)下,2237位点的siRNA-ADAMTS2具有最高的抑制效率;能显著抑制ADAMTS2基因mRNA和蛋白表达(抑制率80％以上);显著抑制COL(I)、α-SMA和TGF-β1在HSC中的表达.HSC的增殖能力显著降低.结论 化学合成的siRNA-ADAMTS2干扰载体能有效抑制ADAMTS2基因在大鼠HSC-T6细胞系中的表达,抑制HSC的活化和增殖,同时显著降低COL(I)、α-SMA和TGF-β1的表达,具有潜在的阻止甚至逆转肝纤维化的作用.ADAMTS2可能是抗肝纤维化治疗的有效靶位,抑制ADAMTS2在肝脏的表达可能是一种有效的抗肝纤维化治疗策略.     

特异性siRNA抑制肝星状细胞Smad2表达

目的构建Smad2特异性siRNA表达克隆,探讨其在肝星状细胞(HSCs)中是否能够有效地抑制Smad2的表达。方法利用生物软件进行Smad2mRNA二级结构模拟,选择合适的靶位点,使用pBSKU6载体表达Smad2特异性siRNA,在体外转染HSC鄄T6细胞株,应用RT鄄PCR和Western鄄blot技术检测Smad2mRNA和蛋白的表达情况。结果成功构建siRNA表达克隆,转染后Smad2在基因和蛋白的表达水平均受到了明显抑制。在构建成功的4个克隆中,CR4抑制mRNA表达最为显著,达90%以上;抑制蛋白表达率也达到80%左右。同时CR1和CR4能有效地下调HSC分泌Ⅲ型胶原。结论在体外实验中,载体表达的特异性siRNA可有效地抑制HSCs中Smad2的表达,并可对激活的HSCs分泌细胞外基质产生有益的影响。     

结缔组织生长因子对Kupffer细胞诱导的肝星状细胞激活的影响

目的 探讨肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达对Kupffer细胞(Kc)诱导的HSC激活的影响.方法 构建含CTGF的RNA干扰载体.将肝星状细胞系rHSC-99分为3组:对照组、空载体组和RNA干扰组.采用RT-PCR方法 检测HSC的CTGF表达.分离培养KC,建立各组HSC与KC的共培养体系,MTT检测HSC的增殖情况;RT-PCR检测HSC的TGF-β1、I型前胶原的表达;Western Blot检测HSC的TGF-β1表达,ELISA检测共培养上清中I型胶原的表达;免疫荧光化学检测HSC的α-SMA的表达. 结果 构建CTGF的RNA干扰载体Psilencer 3.1H1-Neo-CTGF.RNA干扰后CTGF表达降低22%.KC得率为5×107,活率＞98%.在HSC和KC共培养体系中,RNA干扰HSC的CTGF表达后,与KC共培养的HSC活化和增殖明显被抑制,与对照组相比,HSC的增殖降低29%(t:20.17,P＜0.01).Ⅰ型前胶原和α-SMA的表达下降38%,细胞培养上清中Ⅰ型胶原的分泌量下降48%(t=12.18,t=7.81,t=15.96,均P＜0.05).TGF-β表达则没有明显的变化.结论 阻断HSC的CTGF表达能抑制由KC诱导的HSC激活.     

5-羟色胺受体在肝星状细胞上的表达及5-羟色胺对肝星状细胞生物学活性的影响

目的　探讨 5 羟色胺 ( 5 HT)受体在肝星状细胞 (HSC)的表达及 5 HT通过其受体的介导对HSC生物学活性的影响。　方法　采用肝脏离体胶原酶灌注消化及密度梯度离心的方法来分离培养HSC ;RT PCR方法检测HSC中 5 HT受体 1B、2A、2B、3等亚型的表达 ;Westernblot方法检测 5 HT及其 2A受体阻断剂酮色林、3型受体阻断剂恩丹西隆对HSC表达TGF β1和Smad4的影响。建立聚硅酮膜培养法 ,将HSC培养在聚硅酮膜上 ,研究 5 HT及酮色林、恩丹西隆对HSC收缩的影响。结果　HSC表达 5 HT的 1B、2A、2B等受体亚型 ,不表达 3亚型。5 HT明显促进HSC表达TGF β1和Smad4(P <0 0 5 ) ,酮色林能抑制TGF β1和Smad4的表达。恩丹西隆的作用不明显。 5 HT能促进HSC的收缩 ,并成量效依赖关系 ,这种收缩作用能被酮色林所阻断 ,不被恩丹西隆阻断。　结论　HSC表达 5 HT的多种受体亚型 ,5 HT通过其受体的介导对HSC的生物学活性发生影响 ,在肝硬化、门静脉高压症的发生发展中起了一定的作用。     

胆红素浓度对肝星状细胞活化增殖和凋亡的影响

目的 探讨低浓度胆红素( bilirubin)对活化态肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)增殖、活化、凋亡的影响.方法 从肝脏分离纯化培养HSCs,DCFH-DA法检测不同浓度胆红素对HSCs中活性氧的影响.通过CCK-8比色法检测胆红素对HSCs增殖的影响.Western blot检测HSCsα-肌动蛋白(d-SMA)的表达.流式细胞仪检测胆红素对HSCs凋亡的影响.PCR检测胆红素对HSCs纤维化相关基因表达的影响.结果 分离并培养HSCs,低浓度胆红素浓度(0、1、10、20 mg/L)抑制HSCs中活性氧的产生,明显抑制HSCs的增殖(0.624±0.092,0.536±0.127,0.407±0.033,0.399±0.022,F=13.454,P＜0.05)及α-SMA的表达(339 ±2,336±10,246±7,242±5,3.7±0.3,F=191.107,P＜0.05),促进HSCs的凋亡(2.69±0.07％,2.95±0.10％,4.41±0.22％,4.91±0.86％,F=34.731,P＜0.05),改变HSCs纤维化相关基因的表达,TIMP-1 mRNA/MMP-2 mRNA的比值呈降低趋势(54±2,65±2,47 ±2,44±2,F=73.400,P＜0.05).结论 低浓度胆红素具有抑制HSCs活化增殖,促进凋亡的潜能.胆红素的作用可能与其抗氧化功能有关.     

小干扰RNA抑制肝癌HepG2细胞VEGF表达的研究

目的 观察小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)对肝癌HepG2细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的抑制作用.方法 将VEGF siRNA经LipofectamineTM 2000脂质体转染肝癌HepG2细胞后,实时荧光定量PCR和Western blot方法分别检测VEGF mRNA和蛋白的表达,ELISA检测细胞培养上清液中VEGF蛋白浓度. 结果细胞培养6 h后siRNA的转染效率为(90.4±2.9)%,转染后肝癌HepG2细胞中VEGF mRNA和蛋白的表达明显减少,细胞培养上清液中VEGF蛋白表达下降. 结论运用RNA干扰技术,可以有效地干扰肝癌HepG2细胞VEGF的表达并能降低VEGF的生成.     

重组人肝再生增强因子可抑制大鼠肝星状细胞c-fos基因的表达

目的 观察重组人肝再生增强因子(hALR)对大鼠肝星状细胞c-fos基因表达的影响.方法 在培养的肝星状细胞株中加入高(200μg/L)、中(20μg/L)、低(2μg/L)3种浓度的hALR,于8、24、48、72 h四个时间点收集细胞,提取总RNA;用逆转录定量聚合酶链反应(PCR)方法测定c-fos的基因表达.结果 高、中、低浓度的hALR 3组肝星状细胞c-fos基因的表达水平在8、24、48、72 h四个时间点均明显低于对照组;低剂量组为对照组的50%～53%,中剂量组为对照组的38%～43%,高剂量组为对照组的26%～30%.结论 重组人肝再生增强因子对大鼠肝星状细胞c-fos基因的表达有明显抑制作用.     

小干扰RNA对特异性沉寂淋巴细胞白细胞介素-2基因表达和功能的影响

目的 探讨体外转录法合成的小干扰RNA（siRNA）对大鼠淋巴细胞白细胞介素（IL）-2基因的表达和功能的影响。方法 设计并合成3条siRYA（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3）在阳离子脂质体的介导下转染淋巴细胞。于转染后0、24、48h收集细胞，用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测IL-2mRNA的变化；酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测IL-2表达的变化。结果 体外合成的3条siRNA通过脂质体转染淋巴细胞后，均能不同程度地抑制I[,-2的表达。转染后24h的ELISA方法检测显示siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3组的抑制率分别为（79．20±1．83）％、（66．50±1．42）％、（43．90±1．22）％，以siRNA-1的IL-2抑制作用最强。半定量RT-PCR方法检测显示siRNA-1、6iRNA-2、siRNA-3转染后的IL-2mRNA均受到不同程度的抑制，其中siRNA-2组的抑制作用最明显（82，10±1．85）％。结论 siRNA可特异性的抑制淋巴细胞IL-2基因的转录和表达，为研究siRNA在移植免疫耐受及防移植物抗宿主病（GVHD）方面的应用提供了依据。     

肝星状细胞在肝脏疾病中的作用

肝星状细胞（HSC）是肝脏内重要的非实质细胞之一,可分泌、释放多种胶原纤维和细胞骨架蛋白参与肝脏疾病的病理生理过程。正常状态下,HSC通过调节细胞外基质蛋白的合成和降解维持肝脏正常的组织结构;肝脏损伤时,HSC被激活,活化的HSC导致细胞外基质的增加是肝纤维化形成并最终导致肝硬化、肝衰竭的主要原因。因此,深入研究HSC在肝脏疾病发生与发展中的作用和机制,并研究与HSC相关的治疗策略,对于提高患者生存率具有一定意义。     

PPARγ特异配体抑制肝星状细胞的活化

目的 研究不同浓度的过氧化物酶体增殖物活化的受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)特异配体罗格列酮对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)生物学特性的影响,以探究其在肝旱状细胞活化中的作用.方法 设立对照组,3μM罗格列酮组,10μM罗格列酮组,20μM岁格列酮组.用MTT法检测细胞的增殖情况;采用RT-PCR方法检测其中PPARγ、TGF-β1及Ⅰ型前胶原mRNA表达;用Western blot法检测PPARy、Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达;用免疫细胞化学方法测定α-SMA表达的变化;ELISA法检测细胞培养上清中的Ⅰ型胶原表达的变化.结果 (1)RT-PCR:20μM罗格列嗣组或10μM罗格列酮组与3 μM罗格列酮组或对照组相比,PPARY mRNA表达显著增高(P＜0.01),Ⅰ型前胶原mRNA表达显著降低(P＜0.01);20 α-SMA罗格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之间,3 α-SMA罗格列酮组与对照组之间,PPARγ和Ⅰ型前胶原mRNA的表达差异无显著件(P＞0.05).而各组之间的TGF-β1 mRNA的差异无显著性意义(P＞0.05).(2)Western blot:PPARγ及TGF-β1蛋白表达所得结果与RT-PCR结果相一致.Ⅰ型胶原表达与RT-PCR Ⅰ型前胶原mRNA表达结果相一致.各组之间的Ⅲ型胶原表达差异无显著性意义(P＞0.05).(3)免疫细胞化学:20α-SMA罗格列酮组或10 α-SMA罗格列酮组与3 α-SMA罗格列酮组或对照组相比,α-SMA表达明显降低(P＜0.05).20 α-SMA岁格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之问,3 α-SMA罗格列酮组与对照组之间,差异无显著性(P＞0.05).(4)ELISA:20 α-SMA罗格列酮组或10 α-SMA罗格列酮组与3α-SMA罗格列倒组或对照组相比,细胞的培养上清中Ⅰ型胶原表达明显降低(P＜0.01).20 α-SMA罗格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之问,3 α-SMA罗格列酬组与对照组之间,差异无显著性(P＞0.05).结论 PPAR?配体罗格列酬能够在促进PPAR?的合成表达的同时,抑制细胞的增殖及胶原合成,抑制α-SMA的表达,减少细胞分泌Ⅰ型胶原,对肝星状细胞的活化有明显的抑制作用.     

白藜芦醇抗肝星状细胞活性和抗肝纤维化的实验研究

目的 探讨白藜芦醇调节肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活性及其抗肝纤维化作用.方法 从大鼠肝脏分离纯化培养HSCs;DCFH-DA法检测不同浓度白藜芦醇对HSCs中活性氧的影响;通过CCK-8比色法检测白藜芦醇对HSCs增殖的影响.Western blot检测HSCs的α-肌动蛋白(α-SMA)表达.通过PCR检测白藜芦醇对HSCs活性相关基因表达的影响.给大鼠肝纤维化模型经腹输注白藜芦醇,检测肝组织病理切片,肝纤维化指标.结果 从大鼠活体分离培养HSCs.白藜芦醇可抑制HSCs中活性氧的产生;明显抑制HSCs的α-SMA表达(103 ±7,90 ±7,63 ±4,53 ±3,F=62.179,P ＜0.05)与增殖(0.536±0.052,0.411±0.047,0.327±0.063,0.312±0.032,F=12.776,P＜0.05);抑制HSCs活性相关基因(大鼠生肌调节因子、胶原蛋白Ⅲ及胶原蛋白Ⅰ)的表达(122 ±.5,96±3,68 ±3,60 ±3,F=180.600,P ＜0.05) (100 ±8,82±3,53±3,51 ±2,F =77.451,P＜0.05) (170±3,147±4,92 ±3,90 ±2,F=462.878,P＜0.05).大鼠活体实验显示白藜芦醇可降低肝羟脯氨酸含量及血清胶原蛋白Ⅲ和透明质酸水平(358.3 ±20.2,320.5±15.3,290.3±24.5,F=23.929,P ＜0.05) (32.8±3.1,28.9±1.3,25.3±1.8,F=20.050,P＜0.05)(276.3±17.8,225.3±28.3,195.4±11.2,F=18.585,P＜0.05).结论 白藜芦醇能够抑制大鼠HSCs的活化增殖,对活体肝纤维化具有一定的抑制作用,这可能与白藜芦醇的抗氧化及抑制MyoD的表达作用有关.     

罗格列酮对肝星状细胞基质金属蛋白酶-2和-9基因表达的影响

目的 观察过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)特异配体罗格列酮对肝星状细胞(HSC)表达基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的影响.方法 在培养的HSC株中加入不同浓度的罗格列酮(终质量浓度为5、10、15、20 μmol/L),于24 h后收取细胞,利用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定MMP-2、MMP-9 mRNA表达.结果 MMP-2表达水平在罗格列酮5、10、15、20 μmol/L组分别为0.5708±0.0609、0.8900±0.0823、1.1348±0.1205、1.4490±0.0832,而空白对照组为0.3237±0.0796.MMP-9表达水平在罗格列酮5、10、15、20 μmol/L组分别为0.5487±0.0770、0.7554±0.0510、0.9497±0.0451、1.1088±0.0777,空白对照组为0.3220±0.0592.结论 罗格列酮可增强HSC对MMP-2、MMP-9的表达,并在一定范围内,呈剂量依赖性.     

血管紧张素Ⅱ及其受体拮抗剂对肝星状细胞收缩的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ及其受体拮抗剂对体外培养的肝星状细胞收缩的影响。方法采用HSC-T6肝星状细胞系作为活化的肝星状细胞的研究模型。将培养的肝星状细胞随机分为对照组、血管紧张素Ⅱ(1×10-9～1×10-5)mol／L组、受体拮抗剂组和血管紧张素Ⅱ+受体拮抗剂组,继续培养48 h后,比较胶原晶格收缩面积的变化,并绘制收缩的量效关系曲线和时效关系曲线。结果血管紧张素Ⅱ各浓度组,胶原晶格的收缩面积比较对照组均明显增加(P<0．05)。随着血管紧张素Ⅱ浓度的升高,胶原晶格的收缩面积逐渐增大,量效曲线呈近似直线的正相关关系;而且随着血管紧张素Ⅱ作用时间的延长,胶原晶格的收缩面积逐渐增大,在48 h之内呈时间依赖性。血管紧张素Ⅱ作用48 h后,胶原晶格面积为(379．337±37．755)mm2,同时加入受体拮抗剂,面积为(540．803±70．018)mm2,胶原晶格的收缩程度比较血管紧张素Ⅱ组明显减轻(P<0．05)。结论血管紧张素Ⅱ能够剂量依赖性和时间依赖性地促进肝星状细胞的收缩,而血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂能够抑制血管紧张素Ⅱ引起的肝星状细胞的收缩。