MGMT反义RNA对人脑胶质瘤耐药性的逆转

目的探讨O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)反义RNA对人脑胶质瘤细胞MGMT表达的调节作用。方法将分别为针对MGMTmRNA5’端和全长序列的反义表达载体pLaMT5SN和pLaMTSN,分别导入U251/BCNU耐药细胞,经G418筛选产生稳定抗性克隆aMT5U和aMTU;分别将正义表达载体pLMTSN和空载体pLXSN导入U251/BCNU耐药细胞,经G418筛选产生稳定抗性克隆MTU和XU作为对照。观察转染后的U251/BCNU细胞对MGMT表达的调节作用及U251/BCNU细胞对BCNU敏感性的影响。结果经RT-PCR检测显示,pLaMT5SN和pLaMTSN可在一定程度上降低MGMTmRNA表达水平;MTT检测显示,aMT5U和aMTU细胞对BCNU的敏感性分别较未转染细胞提高7倍和2倍,表明pLaMT5SN和pLaMTSN可在一定程度上提高U251/BCNU细胞对BCNU的敏感性。结论MGMT反义RNA能够在一定程度上抑制脑胶质瘤细胞MGMT的表达水平,提高肿瘤细胞对亚硝基脲类药物的敏感性。     

替莫唑胺改变人胶质瘤细胞系U251耐药机制的体外研究

目的 建立替莫唑胺耐药人胶质瘤细胞系,探讨其耐药性变化规律及耐药机制,以期为临床优化药物化疗方案提供理论依据.方法 采用分步诱导法使人胶质瘤细胞系U251对替莫唑胺耐药,磺酰罗丹明B比色法检测细胞耐药指数和存活率;Western blotting法检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)表达水平,以及倍增替莫唑胺终浓度后MGMT表达水平.结果 成功建立替莫唑胺耐药U251/TR细胞,在替莫唑胺初始诱导剂量0.25μg/ml、终浓度16.00μg/ml培养液中,U251/TR细胞半数抑制浓度为(220.87±2.34)μmol/L,约为U251细胞[(33.12±1.52)μmol/L]的7倍(t=-116.542,P=0.000),其耐药指数约为7;U251/TR细胞MGMT表达水平为(1.47±0.30),较U251细胞(0.19±0.03)明显升高(t=-20.230,P=0.000).与溶媒对照组比较,经倍增替莫唑胺终浓度诱导的U251/TR细胞仍呈现增殖抑制现象,以体外培养第3天时最为明显(P=0.000);MGMT表达水平相应降低(均P=0.000),呈现自身克服耐药现象.结论 采用分步诱导法可于体外成功建立替莫唑胺耐药人胶质瘤细胞系.MGMT表达水平升高是导致U251/TR细胞对替莫唑胺耐药的主要机制,替莫唑胺可以通过自身消耗MGMT而改变U251/TR细胞的耐药特性,发挥抗耐药作用.     

O6-苄基鸟嘌呤逆转人脑胶质瘤对BCNU耐药性的研究

目的 探讨提高BCNU为代表的CENUs对Mer 脑胶质瘤化疗疗效的途径。方法 采用MTT法及测定肿瘤生长观察O^6-苄基鸟嘌呤（O^6-BG)预处理Mer 人脑胶质瘤细胞及荷Mer 脑胶质瘤裸小鼠对BCNU疗效的影响。结果 O^6-BG能提高BCNU对Mer 胶质瘤细胞T98G的敏感性2．2倍，对Mer-细胞SHG－44无增敏作用，10μmol/L O^6-BG预处理2小时即能明显抑制MGMT活性，≥50μmol/L时能完全抑制MGMT活性；O^6-BG毒性极低，100μmol/L时细胞生存率＞95％。O^6-BG BCNU组较空白对照组延缓肿瘤生长34．16天，而单纯BCNU组延缓生长18天（P＜0．01），且O^6-BG BCNU组中还见到肿瘤暂时性退缩。结论 O^6-BG通过抑制MGMT活性，能逆转Mer 人脑胶质瘤细胞对BCNU的耐药性，提高BCNU时效，因而可望作为化疗增敏剂与BCNU联合使用。     

脑胶质瘤MGMT表达与体外药敏相关性及其临床意义

目的研究胶质瘤体外药物敏感性与肿瘤细胞DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）的表达之间的相关性。方法①对手术中取得的胶质瘤组织进行原代细胞培养，采用MTT法对七种目前临床常用的脑胶质瘤化疗药物在血浆峰浓度下进行体外药物敏感性测定。②采用免疫组化二步法，检测了同组36例人脑胶质瘤标本MGMT的表达，将检测结果与同-标本来源者的药敏结果进行相关性分析。结果人脑胶质瘤标本MGMT表达阳性率为72.2％，其表达水平与BCNU、DDP、Me—CCNU这三种化疗药物血浆峰浓度下对肿瘤细胞的抑制率（IR）呈显著性负相关（P〈0．05），而与其它四种药物（Elemene、VCR、VM-26和VP-16）则无这种相关性（P〉0．05）。结论当患者肿瘤细胞MGMT阳性表达时，将与BCNU、DDP、Me—CCNU等烷化剂类化疗药物耐药，临床化疗时应避免使用此类药物；检测肿瘤MGMT表达可以作为不具备体外药敏试验条件下的补充．可为脑胶质瘤化疗方案制定提供参考。     

红霉素预适应诱发胶质瘤耐药作用机制探讨

目的 探讨红霉素预适应对胶质瘤细胞系U251对亚硝基脲类药物BCNU耐药的影响及其可能的机制. 方法 400 mmol/L红霉素预处理U251细胞3 h后以BCNU刺激细胞(预适应刺激组),同时设刺激组和空白对照组.应用MTT法和流式细胞技术分别检测细胞的增殖和凋亡率,RT-PCR方法检测U251细胞神经型一氧化氮合酶(nNOS)和Bcl-2 mRNA的表达情况. 结果与刺激组相比,红霉素预适应刺激组细胞的增殖能力增加,凋亡率减少,差异有统计学意义(P<0.05),RT-PCR结果显示nNOS、Bcl-2 mRNA的表达增加. 结论红霉素预处理U251细胞可以增加其对BCNU的耐药作用,nNOS和Bcl-2可能参与了这一过程的调节.     

利用RNA干扰技术抑制Cyr61表达对人脑胶质瘤细胞药物敏感性和凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制Cyr61基因表达增强人脑胶质瘤U251细胞对化疗药物敏感性及凋亡能力的研究.方法 针对Cyr61 Mrna序列设计合成小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建Prnat-Cyr61重组表达载体,转染人脑胶质瘤U251细胞:通过RT-PCR和Western blot分析其对U251细胞内源性Cyr61表达的影响;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察U251细胞对化疗药物顺铂和替莫唑胺敏感性的改变;用流式细胞仪检测U251细胞体外凋亡的变化.结果 成功构建Prnat-Cyr61重组质粒,并成功转染U251细胞;RT-PCR和Western blot结果证实重组质粒在Mrna及蛋白水平分别显著抑制Cyr61基因表达(P<0.01);MTT及流式细胞仪结果证明在和顺铂或替莫唑胺联合作用下,Prnat-Cyr61组U251细胞的生长抑制率和凋亡率都明显增高(P<0.01).结论 Prnat-Cyr61可抑制Cyr61在人脑胶质瘤U251细胞中的表达,并增强U251细胞对化疗药物敏感性及其体外凋亡率.     

胶质瘤干细胞对BCNU耐药的体外实验研究

目的 探讨胶质瘤十细胞(CSCs)对双氯乙基亚硝脲(BCNU)的耐药能力及导致耐药的相关分子机制.方法 从来源于手术切除的恶性胶质瘤中分离培养GSCs,并应用免疫细胞化学染色和FACS鉴定;分别利用MTT法和Ki67染色观察和分析不同浓度BCNU对胶质瘤细胞和GSCs的活力和增殖能力的影响;应用RT-PCR法测定O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanineDNA-transferase,MGMT)mRNA在胶质瘤细胞、GSCs和正常脑组织中的表达.结果 本研究中获得的GSCs为Nestin和CD133阳性,具有自我更新、分裂增殖和多分化潜能,流式细胞术分析证实收获的细胞克隆中99.79%的细胞为CD133阳性细胞,符合我们的实验要求;与胶质瘤细胞相比,GSCs具有较强的抗BCNU化疗能力(P＜0.01),在BCNU的浓度达到2 g/L后,胶质瘤细胞存活率近于0斤基本停止增殖,而GSCs仍有32.3%±4.5%的存活率并仍有43.6%±3.5%的增殖率,当BCNU浓度在2 g/L到8 g/L间尚可以进一步诱导GSCs耐药能力的增强;RT-PCR结果表明在GSCs中MGMT mRNA的表达明显高于胶质瘤细胞,而在正常脑组织中则无MGMT mRNA的表达.结论 GSCs比胶质瘤细胞更具耐药性,是胶质瘤产生耐药的关键,而MGMT是GSCs产生耐药的分子机制之一.     

MGMT阳性恶性脑胶质瘤病人的化疗(附51例体会)

O~6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O~6- methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)可使DNA烷基化损伤得到修复,是恶性胶质瘤对亚硝脲类药物及新药替莫唑胺(temozolomide,TMZ)产生耐药的主要原因。研究表明67.2%至     

AKT2在胶质瘤细胞中替莫唑胺化疗耐药的作用机制研究

目的研究AKT2基因在U251细胞株中对替莫唑胺化疗耐药中的作用机制。方法体外将慢病毒介导的AKT2-shRNA表达载体转染胶质瘤U251细胞。应用细胞计数试剂盒(CCK8)法检测RNA干扰AKT2后U251细胞对替莫唑胺敏感性的变化情况。流式细胞仪测定沉默AKT2基因表达后各组细胞凋亡的改变情况。AKT2-shRNA干扰胶质母细胞瘤细胞株U251的AKT2表达,进而采用Western blot实验方法,来进一步分析和评价AKT2与MDR-1、MRP-1、MGMT、bcl-2、caspase-3、P53等相关蛋白表达情况和相互调控关系。结果 CCK8法检测结果计算替莫唑胺对U251细胞的半数细胞抑制浓度(IC50)从U251空白对照组的(39.72±2.41)μg/ml、阴性对照组的(39.43±2.24)μg/ml降到(27.23±1.93)μg/ml,AKT2干扰组U251细胞对替莫唑胺药物的IC50值显著降低。流式细胞仪检测凋亡实验显示,与空白对照的U251细胞[调亡细胞(16.95±1.32)%]和转染阴性对照的U251胶质瘤细胞[调亡细胞(17.93±2.29)%]相比,转染AKT2shRNA的U251细胞中早期、晚期调亡细胞明显增加,总调亡细胞达(38.16±4.83)%,干扰组凋亡水平有显著性增强(P0.05)。AKT2-shRNA干扰U251后其凋亡明显增加,Real-time PCR和蛋白印迹实验结果提示bcl-2、survivin、MGMT明显下调,而caspase-3、PTEN、P53、beclin-1明显上调。结论 AKT2可能参与调控bcl-2、caspase-3、P53、survivin、beclin1等凋亡自噬相关蛋白及DNA损伤修复蛋白MGMT的表达,从而介导胶质母细胞瘤细胞株U251对替莫唑胺化疗抵抗。     

下调RNA甲基化酶NSUN2表达对脑胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的 探讨下调NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2(NSUN2)表达对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响。方法体外培养正常胶质细胞HEB、胶质瘤细胞系（A172、U251、U87）,免疫印迹法检测NSUN2蛋白表达水平;用shNSUN2慢病毒（sh-NSUN2组）及shRNA scramble慢病毒（sh-CON组）感染U87细胞下调NSUN2表达,用CCK-8法检测细胞增殖活力,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移。结果 与正常胶质细胞HEB相比,胶质瘤细胞系A172、U251、U87的NSUN2蛋白表达量均明显增高（P<0.05）。与sh-CON组比较,sh-NSUN2组NSUN2蛋白表达水平、细胞增殖活力、侵袭能力和迁移能力均明显降低（P<0.05）。结论 胶质瘤NSUN2呈高表达,下调其表达明显抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移。     

脑胶质瘤耐放射细胞亚株的建立方法

目的探索诱导并建立脑胶质瘤耐放射细胞亚株的体外实验方法,为进一步研究胶质瘤放疗抵抗发生的分子生物学机制提供基础。方法以脑胶质瘤U251细胞株为实验对象,通过体外细胞培养,应用60Co射线对脑胶质瘤U251细胞株进行小剂量重复的诱导照射,得到U251耐放射细胞亚株RR-U251。观察RRU251细胞形态的变化;MTT检测其细胞活力,流式细胞仪(FCM)检测其细胞凋亡;集落形成实验检测细胞克隆团形成。结果放射治疗后,RR-U251与U251细胞的相比:细胞增殖活力增强11.5%,迁移能力增强50%,侵袭能力增强87.5%,凋亡率下降69.6%,细胞集落形成率升高88.5%;RR-U251放射敏感性明显下降。结论小剂量重复照射诱导法能较好地建立胶质瘤耐放射细胞亚株RR-U251。     

反义miRNA-221/222上调p27kip1抑制胶质瘤细胞生长的体外研究

目的 探讨敲低miRNA-221/222表达上调p27kip1抑制U251人脑胶质瘤细胞株生长的效果及机制.方法 脂质体共转染反义miRNA-221/222下调U251人脑胶质瘤细胞株miRNA-221、miRNA-222的表达.使用Northern blot方法 鉴定转染后U251细胞miRNA-221、miRNA-222表达水平下调;MTT法评价反义miRNA-221/222抑制U251细胞生长效果;流式细胞术检测转染后U251细胞周期分布;Western blot分析p27kip1蛋白的表达变化.结果 Northern blot显示反义miRNA-221/222共转染组使miRNA-221、miRNA-222的表达水平明显下降.反义miRNA-221转染组仅使miRNA-221的表达水平明显下降,反义miRNA-222转染组仅使miRNA-222的表达水平明显下降.转染无意序列组及对照组的miRNA-221、miRNA-222表达水平没有改变.MTT结果 显示反义miRNA-221/222共转染组肿瘤细胞生长速度小于对照组、转染无意序列组、转染反义miRNA-221组、转染反义miRNA-222组.流式细胞术检测可见反义miRNA-221/222共转染组细胞周期存在G0/G1期阻滞且明显高于其他各组.Western blot显示反义miRNA-221/222共转染组的p27kip1蛋白表达明显上调.结论 反义miRNA-221/222通过上调p27kip1蛋白表达来抑制胶质瘤细胞U251的生长.     

反义hTERT抑制恶性胶质瘤生长的体内外研究

目的 探讨腺病毒介导的反义hTERT在体内外对恶性胶质瘤细胞生长的影响.方法 构建含有hTERT反义序列的腺病毒载体在体内外转染恶性胶质瘤细胞系U251,检测肿瘤细胞生长情况、细胞周期变化、端粒酶活性、hTERT蛋白表达等.结果 腺病毒介导的hTERT反义治疗在体外明显抑制肫瘤细胞生长,增殖减慢,凋亡增多,细胞较多聚集在G1/G0期,转染后第6天细胞生存率为46.9%,端粒酶活性和hTERT蛋白表达都明显下降,在体内实验中肿瘤生长明显减慢.结论 腺病毒介导的反义hTERT在体内外能明显抑制恶性胶质瘤细胞的生长.     

人脑胶质瘤耐药细胞系SKMG-1/TMZ的建立及其耐药机制的研究

目的 建立对替莫唑胺（TMZ）耐药的胶质瘤细胞系并初步对其耐药机制进行探讨.方法 通过体外分阶段递增药物浓度诱导法使SKMG-1细胞对TMZ产生耐药性;采用细胞集落形成实验及MTT法检测SKMG-1/TMZ细胞对TMZ的耐药性;采用RT-PCR检测SKMG-1/TMZ细胞中MGMTmRNA表达情况.结果 细胞集落形成相对率显示,SKMG-1/TMZ-6细胞形成相当率是未诱导组SKMG-1细胞的4～11倍;MTT法检测显示SKMG-1/TMZ对TMZ的耐药指数为5.8;RT-PCR检测显示SKMG-1/TMZ细胞中MGMTmRNA表达上调,并可扩增出571bp的特异性片段.结论 通过分步诱导法在体外建立了一株对TMZ耐药的细胞系SKMG-1/TMZ,MGMTmRNA表达上调是其对TMZ产生耐药的机制之一.     

CD147反义RNA抑制神经胶质瘤侵袭的实验研究

目的 探讨CD147在人脑胶质瘤侵袭中的作用机制. 方法构建 CD147反义RNA表达质粒并转染人胶质瘤细胞系U251(转染组),同时设空载体对照组和空白对照组,经筛选、鉴定后应用明胶酶谱实验和重组基底膜实验分别检测3组细胞中基质金属蛋白酶(MMPs)的分泌和侵袭细胞的数量. 结果与空载体转染组和空白对照组比较,CD147反义RNA转染组U251细胞产生MMPs的能力下降,侵袭细胞的数量降低,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 CD147反义核酸能抑制胶质瘤的侵袭浸润,提示其可能成为胶质瘤治疗的药物靶点.     

CD147反义RNA抑制神经胶质瘤侵袭的实验研究

目的 探讨CD147在人脑胶质瘤侵袭中的作用机制. 方法构建 CD147反义RNA表达质粒并转染人胶质瘤细胞系U251(转染组),同时设空载体对照组和空白对照组,经筛选、鉴定后应用明胶酶谱实验和重组基底膜实验分别检测3组细胞中基质金属蛋白酶(MMPs)的分泌和侵袭细胞的数量. 结果与空载体转染组和空白对照组比较,CD147反义RNA转染组U251细胞产生MMPs的能力下降,侵袭细胞的数量降低,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 CD147反义核酸能抑制胶质瘤的侵袭浸润,提示其可能成为胶质瘤治疗的药物靶点.     

hTERT反义cDNA对人脑胶质瘤细胞的抑制作用

目的探讨人端粒酶催化亚基(hTERT)反义cDNA(pAdeasy-hTERT)在体外对胶质瘤细胞生长的抑制作用。方法将腺病毒介导的pAdeasy-hTERT作用于人胶质瘤细胞系U251,用MTT法检测细胞存活率、端粒酶重复序列扩增法测定端粒酶活性、Westem杂交鉴定hTERT蛋白的表达、RT-PCR法检测hTERT cDNA水平、PCNA观察肿瘤细胞的凋亡情况以及用流式细胞仪对转染后肿瘤细胞的周期进行分析。结果pAdeasy-hTERT在体外明显抑制肿瘤细胞生长,降低端粒酶活性,抑制hTERT表达。结论pAdeasy-hTERT显著抑制人胶质瘤细胞生长,可成为恶性胶质瘤基因治疗的靶基因。     

4E‐BP1 regulates the sensitivity of human glioma cells to chemotherapy through PI3K/Akt/mTOR‐independent pathway

Drug resistance is one of the most formidable obstacles for treatment of glioma. Eukaryotic initiation factor 4E‐binding protein (4E‐BP1), a key component in the rate‐limiting step of protein translation initiation, is closely associated with poor prognosis in multiple tumor types. However, it is unclear whether 4E‐BP1 is involved in the drug resistance of human glioma. Herein we show that the expression of 4E‐BP1 in human SWOZ2‐BCNU drug‐resistant glioma cells is significantly lower than that of the parent SWOZ2 cell line. Moreover, down‐regulation of 4E‐BP1 by short interfering RNA significantly impaired the sensitivity of SWOZ2 and U251 cells to carmustine (BCNU). Furthermore, overexpression of 4E‐BP1 with plasmid transfection regained this sensitivity. Clinical studies showed that the expression levels of 4E‐BP1 in primary glioma tissues were markedly higher than those of recrudescent glioma tissues. Taken together, our results suggest that 4E‐BP1 is a novel protein that contributes to acquired drug resistance and it may be a potential target for reversing drug resistance in human glioma.