常见腹泻病毒多重荧光逆转录聚合酶链反应检测方法的建立及临床应用

目的建立能同时检测星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒和诺如病毒的多重荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法。方法根据上述4种病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析多重荧光RT-PCR的特异性、敏感性、灵敏度;以所建立方法对256例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的腹泻病毒多重荧光RT-PCR检测方法对具有星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒特异性,灵敏度可达500 copy/mL。256例粪便标本中,星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒和诺如病毒的检出率分别为3.13%、42.97%、9.38%和10.16%,与基因测序比对结果相符。结论成功构建可用于常见腹泻病毒检测的多重荧光RT-PCR检测方法,该法具有快速、灵敏、特异等优点,可用于临床病原诊断。     

深圳市儿童腹泻标本病毒病原学初步分析

目的 对深圳市腹泻儿童中轮状病毒、肠道腺病毒、星状病毒、诺瓦克类病毒的感染进行调查和初步分析.方法 采用酶联免疫技术(ELISA)和核酸扩增检测技术(PCR)对2007年8月～2008年3月的82份腹泻标本进行病毒检测,PCR阳性标本进行测序,并与GenBank中公布的基因进行同源性比较.结果 82份标本病毒抗原酶联免疫检测总阳性率为64.6%(53/82),病毒核酸检测总阳性率为67.1%(55/82).其中酶联免疫法轮状病毒、星状病毒、诺瓦克病毒、肠道腺病毒的阳性率分别为54.9%,0,7.3%,4.9%.PCR法轮状病毒、星状病毒、诺瓦克病毒、肠道腺病毒的阳性率分别为50%,1.2%,11%,12.2%.测序比较结果表明轮状病毒,星状病毒,诺瓦克病毒,肠道腺病毒与GenBank中公布的基因序列同源性比较符合率分别为92%～100%,90%～100%,94%～100%,90%～100%.结论 深圳市儿童腹泻的病毒感染率比较高.酶联免疫技术的灵敏度和准确度低于核酸检测技术,酶联免疫技术检测病毒抗原适合于基层医院使用.耍幼儿腹泻标本病毒检测对降低耍幼儿死亡率有重要的作用.     

20世纪80年代我国142份成年人腹泻粪便标本中常见致腹泻相关病毒筛查

目的了解我国142份成年人腹泻粪便标本中常见腹泻相关病毒性病原谱。方法采用聚合酶链式反应(PCR)检测方法筛查中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所毒种库保存的20世纪80年代142份成年人腹泻粪便标本中轮状病毒、诺如病毒、肠道腺病毒和星状病毒等,并测序确定病毒的型别。结果120份(84.51%,120/142)粪便标本检出至少1种病毒,其中B组轮状病毒检出率为42.96%(61/142),未检出A组和C组轮状病毒;诺如病毒检出率为0.70%(1/142);肠道腺病毒检出率为4.23%(6/142),其中4型2份,7型2份,40型和41型各1份;星状病毒全部为5型,检出率为34.51%(49/142);猪肠道病毒检出率为1.41%(2/142);柯萨奇病毒检出率为0.70%(1/142);混合感染检出率为24.65%(35/142);脊髓灰质炎病毒未检出。结论本批成年人腹泻标本中以B组轮状病毒为主,与星状病毒混合感染率较高,达21.13%(30/142),与标准成年人腹泻B组轮状病毒株核苷酸序列同源性为94.67%~96.52%;其他几种病毒与现有病毒的相似度较高。从粪便中检出猪肠道病毒,考虑当时的居住环境所致,不能排除标本污染。     

应用双重实时荧光定量反转录-聚合酶链反应方法同时检测A组轮状病毒和星状病毒

目的建立能同时检测轮状病毒A群和星状病毒双重实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)方法。方法根据上述2种病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析多重rRT-PCR的重复性、特异性、敏感性;以所建立方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的双重rRT-PCR检测方法对轮状病毒A群和星状病毒具有很好的特异性和重复性,轮状病毒A群灵敏度达到每个反应101拷贝,星状病毒灵敏度达到每个反应102拷贝。128例粪便标本中,轮状病毒A群和星状病毒的检出率分别为18.0%和3.1%。通过基因测序比对结果相符。结论构建可用于轮状病毒A群及星状病毒的双重rRT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

2011—2012年甘肃省武威市婴幼儿腹泻病毒监测结果分析

目的了解甘肃省武威市婴幼儿腹泻患者中病毒性腹泻病原体的分布状况。方法收集2011年1月至2012年12月武威市凉州医院住院确诊腹泻婴幼儿的基本信息及其粪便标本,采用酶联免疫吸附试验和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒、杯状病毒。结果 630份粪便标本中4种腹泻病毒总的检出率为68.4%(431/630)、女性婴幼儿腹泻病毒检出率75.0%(147/196)显著高于男性婴幼儿65.4%(284/434)。2012年腹泻病毒检出率73.1%(226/309)显著高于2011年检出率63.9%(205/321)。腹泻病毒检测阳性率依次为杯状病毒34.6%(218/630),轮状病毒34.0%(214/630)、星状病毒13.0%(82/630)、肠道腺病毒10.6%(67/630)。431份检出腹泻病毒的样本中有124份为混合感染,占28.8%(124/431),2012年腹泻病毒混合感染所占比例35.0%(79/226)显著高于2011年腹泻病毒所占比例22.0%(45/205)。214份轮状病毒阳性的标本中病毒毒株G分型以G3,G1为主,P分型以P8,P4为主。结论武威市婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体是杯状病毒和轮状病毒。     

2010年乌鲁木齐市住院儿童病毒性腹泻监测结果分析

目的 了解乌鲁木齐市住院儿童病毒性腹泻的流行现状。 方法 2010年1-12月采集乌鲁木齐市379例腹泻住院患儿粪便标本,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和聚合酶链反应(PCR)检测5种常见腹泻病毒。 结果 229份(60.4%)粪便标本检出至少1种病毒。轮状病毒、诺如病毒、星状病毒、肠道腺病毒和札如病毒检出率分别为45.6%、14.2%、4.2%、3.2%和1.1%。混合感染共26例,以轮状病毒和诺如病毒组合占首位(50.0%,13/26)。1-3月和10-12月是轮状病毒流行高峰期;诺如病毒流行主要发生在10月。轮状病毒感染平均年龄小于诺如病毒感染平均年龄(P=0.002),肠道腺病毒和札如病毒感染全部发生于2岁儿童。 结论 轮状病毒仍是2010年乌鲁木齐市儿童病毒性腹泻的最主要的病原体,其次是诺如病毒;混合感染占一定比例,在以后的流行病学及病原学研究中应该更加关注混合感染的出现。     

腹泻病病原学研究临床价值

目的:探讨引起腹泻的病原微生物种类和构成特点及其流行情况.方法:采集腹泻患者粪便,进行致泻性大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌和弧菌培养鉴定和血清定型检测;对其中水样便且病原菌检测阴性的标本进行轮状病毒、诺沃克病毒、肠道腺病毒和星状病毒荧光PCR检测.结果:在2 627份粪便标本中,共检出肠道病原菌257株,其中致泻性大肠埃希菌142株(55.3%),副溶血弧菌97株(37.7%),沙门菌17株(6.6%),志贺菌1株(0.4%);未检出霍乱弧菌和空场弯曲菌;5份标本同时检出2种病原菌.在668份病原菌检测阴性的水样便标本中,有274份检出肠道病毒,其中诺沃克病毒180份(65.7%),轮状病毒77份(28.1%),星状病毒15份(5.5%)和肠道腺病毒2份(0.7%);4份同时检出轮状病毒和诺沃克病毒.结论:腹泻病原微生物类型复杂多样,以致泻性大肠埃希菌和诺沃克病毒感染居多,加强腹泻病原微生物的常规检验对腹泻病的病因诊断和治疗有重要临床价值.     

2010年广东省深圳市病毒性腹泻监测结果分析

目的 了解广东省深圳市病毒性腹泻的感染情况。 方法 采用实时荧光定量-聚合酶链反应对2010年1-12月深圳市925例疑似腹泻患者粪便标本同时进行轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和肠道腺病毒核酸检测。 结果 4种常见腹泻病毒的检出率分别为25.30%、20.11%、1.51%和2.27%。轮状病毒和诺如病毒全年各月均维持较高的检出率;轮状病毒感染有明显的季节特征,秋冬季为发病高峰;诺如病毒感染则无特殊的季节特征。0~2岁年龄组患者的感染率显著高于3岁以上年龄组患者。 结论 2010年深圳市病毒性腹泻呈高发状态,其中轮状病毒和诺如病毒是主要的病原之一,星状病毒与肠道腺病毒的检出率较低。应加强对病毒性腹泻,尤其是婴幼儿病毒性腹泻的监测。     

90例非轮状病毒腹泻患儿粪便中诺瓦克样病毒的检测

目的了解90份婴幼儿腹泻病人轮状病毒分子生物学方法检测阴性的粪便标本中诺瓦克样病毒感染状况。方法应用酶联免疫吸附实验方法(ELISA)进行诺瓦克样病毒抗原检测。结果90份粪便标本中诺瓦克样病毒I型(G1)和Ⅱ型(G2)阳性分别检出6例和19例,阳性率分别为6.67%和21.11%,两者差异有显著性。结论诺瓦克样病毒感染可能是武汉地区婴幼儿腹泻的重要病因之一,其中基因Ⅱ型为主要流行株。     

多重RT—PCR技术检测儿童呼吸道标本中的常见病毒

目的 建立多重RT-PCR技术检测儿科呼吸道标本中常见病毒的方法.方法 参照病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物,并检索NCBI数据库初步验证其特异性,以实验室阳性株验证引物特异性,优化多重RT-PCR反应条件.并对2008年61份儿童呼吸道标本进行检测,阳性片段测序验证扩增片段特异性.结果 采用多重RT-PCR引物对流感病毒A型(IVA)、流感病毒B型(IVB)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒3型(PIV3)、呼吸道合胞病毒(RSV)和鼻病毒(RHV)等6种病毒进行扩增,均无非特异性扩增条带,分别获得171,489,307,585,155,501 bp片段,与设计相符;对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果,61份儿童呼吸道标本多重RT-PCR扩增,阳性率为50.82%(31/61),核酸序列与经NCBI数据库Blast比对同源性高.结论 实验证明,所建立的多重RT-PCR技术检测儿童呼吸道标本中常见病毒的方法,敏感度、特异度和可重复性均较好,为常见呼吸道病毒检测提供了一种方便易行的方法.