冠心病患者基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶组织抑制物-1表达的临床意义

1对象和方法 1.1对象 盐城市第一人民医院2006-12／2007-06住院的冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD）患者60（男38,女22）例,年龄为38-75（64.4±9.9）岁,以WHO关于缺血性心脏病的命名和诊断标准为依据,根据病史、临床表现、心电图、心肌酶谱等确诊,经冠状动脉造影证实至少1支动脉直径狭窄≥50％,其中心肌梗死患者（AMI）36例,     

金属蛋白酶组织抑制物-1与慢性肾脏疾病的关系

基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)是一类以Zn2+为活性中心,结构和功能同源的蛋白酶超家族.以无活性的潜酶或酶原形式分泌,其活化需要纤溶酶的参与,能降解多种细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)成分.而金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)是其特异的抑制剂.哺乳动物的TIMPs共有4种,他们已经被克隆、纯化出来,并且它们的特性已经被分辨清楚.其中TIMP-1广泛分布于组织和体液中,其表达异常可能参与多种疾病的发生、发展过程.本文仅就TIMP-1及TIMP-1与肾脏疾病的关系作一文献综述.     

基质金属蛋白酶组织抑制物-1与肾脏疾病

基质金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metallo-proteinases,TIMPs)是一组内源性分泌蛋白,一方面可特异性地与相应基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)催化活性中心的锌离子结合封闭其催化活性,抑制正常细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)改建和降解,在各种病理过程,如肿瘤的侵袭、转移、组织纤维化中发挥重要作用;另一方面TIMPs在细胞的生长、增殖和分化及凋亡中亦发挥作用,这种作用与其对MMPs的抑制作用无关.TIMPs共有4种,其中TIMP-1广泛分布于组织和体液中.在肾脏,TIMP-1由系膜细胞、结缔组织细胞、巨噬细胞等产生,其表达异常可能参与了多种肾脏疾病的发生发展过程.本文就TIMP-1及TIMP-1与肾脏疾病的关系作文献综述.     

TA克隆载体的再生

目的：再生ＴＡ克隆载体。方法：将环化质粒以限制性内切酶消化成线性后,以Ｋｌｅｎｏｗ大片段将末端补平,再用Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶在线性载体的两个５‘末端各加上一个非配对的Ｔ。结果：构建成ＴＡ克隆载体。结论：ＴＡ载体的再生将使克隆ＰＣＲ产物更加方便、价廉。     

胰腺癌基质金属蛋白酶及其组织抑制物的基因表达意义

目的：观察胰腺组织及其癌变标本中基质金属蛋白酶（MMPs)及其金属蛋白酶的组织抑制物（TIMPs)基因表达的变化与胰腺癌临床特征、生物学行为的关系。方法：采用Northern-blot、原位分子杂交ISH的方法,对15例胰腺癌中MMP2、MMP9和TIMP1基因的mRNA水平进行了检测,并就其临床意义进行分析。结果：胰腺癌组织MMP2、MMP9和TIMP1的基因表达水平明显高于正常胰腺组织。它们在胰腺癌组织和同质细胞中均有分布;其表达与肿瘤的大小、CA19－9无关,与包膜侵犯、腹腔淋巴结转移和病理分型等胰腺癌侵袭转移的特征有密切的联系。结论：在胰腺癌组织中MMPs和TIMPs的异常表达,有助于临床医师对患者预后判断。     

基质金属蛋白酶-7及其组织抑制物-1与胎膜早破的相关性研究

目的 研究基质金属蛋白酶-7及其组织抑制物与胎膜早破的关系.方法 将40例孕产妇随机分为胎膜早破组20例（其中未足月PROM产妇10例,足月产PROM10例）与对照组20例（为足月临床胎膜完整产妇）,取上述孕产妇胎膜组织,采用免疫组化的方法检测胎膜中基质金属蛋白酶-7及其组织抑制物-1的浓度.结果 胎膜早破组胎膜中基质金属蛋白酶-7的表达明显高于对照组（P＜0.01）,其组织抑制物-1的表达明显低于对照组（P＜0.05）,基质金属蛋白酶-7与其组织抑制物呈负相关（P＜0.05）.结论 基质金属蛋白酶-7及其组织抑制物可能与胎膜早破有关.     

HLA-DRα基因片段TA克隆载体的构建

目的应用TA克隆技术构建含HLA-DRα基因的载体，作为实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HLA-DRα基因的标准模板。方法利用RT-PCR法，从提取的外周血单核细胞总RNA中特异地扩增含635bp的HLADRα cDNA片段，并将其克隆到TA载体。结果用限制性内切酶法和测序方法证实扩增片段为目的片段。结论成功地构建了HLA-DK基因片段TA克隆载体。为实时荧光定量RT-PCR法检测HLA-Dα,mRNA表达提供标准模板。     

基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制物与肺癌

目前在所有的肿瘤中，肺癌占死亡率之首，发生率居第二位，对人类健康和生命构成了重大的威胁。虽然近年已采用手术为主的治疗方法，但是全球范围内肺癌死亡率仍在增加，大多数病人都是死于肺癌的局部复发或远处转移，而肺癌的转移是一极其复杂的多步骤过程，包括侵袭，血液和（或）淋巴扩散，远处种植克隆和血管生成。肺癌的侵袭和转移主要涉及肺癌细胞的粘附，基质成分的降解。     

胃癌基质金属蛋白酶—组织抑制物的表达及其意义

应用单抗免疫组化技术检测５０例胃癌手术切除的标本，探讨ＭＭＰ－ＴＩＭＰ在两型胃癌组织中的分布和含量的变化，并分析其表达水平与肿瘤的淋巴结转移、远处转移以及患者生存率之间的关系。结果发现，ＭＭＰ－２在早期肠型胃癌组织另表达量少，进展期阶段明显增高，尤其是弥漫型；ＭＭＰ－９在进展期肠型胃癌组织中表达量较高；ＴＩＭＰ－２则以早期肠型胃癌组织中表达量为高。较早死于肿瘤转移的患者，不论其肿瘤组织学类型和疾病     

基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因重组腺病毒载体的构建

目的 为探讨基因治疗逆转或延缓椎间盘退变的可行性,构建及制备人基质金属蛋白酶组织抑制剂1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1) cDNA重组腺病毒载体.方法 以含TIMP1 cDNA序列的质粒为模板,通过PCR方法扩增TIMP1cDNA片段,将TIMP1 cDNA全长定向克隆到Ad5MaxTM腺病毒系统的穿梭质粒pDC316上,构建pDC316-TIMP1穿梭质粒;使用Ad5MaxTM腺病毒包装系统,脂质体介导的穿梭质粒及骨架质粒pBHGlox-E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组构建含TIMP1 cDNA的重组腺病毒Ad5-TIMP1,通过PCR方法鉴定重组腺病毒Ad5-TIM P1的正确性.通过阴离子柱层析方法纯化重组腺病毒Ad5-TIMP1并测定重组腺病毒感染滴度.结果 经PCR及酶切方法证实pDC316-TIMP1穿梭质粒中存在630 bp大小左右的插入片段,与目的基因TIMP1的cDNA大小一致;经PCR鉴定证实TIMP1 cDNA重组腺病毒载体Ad5-TIMP1构建成功,病毒感染性滴度为1×1010 IU/mL.结论 成功构建TIMP1 cDNA重组腺病毒载体,为应用基因治疗方法逆转或延缓椎间盘退变的研究奠定实验基础.     

TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体.方法:提取胃癌组织总RNA,用TIMP-1基因引物进行RT-PCR,将扩增产物克隆至pGEM-T载体,PCR鉴定及测序证实后,BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pGEM-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C3中,并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析.结果:构建的pEGFP-C3-TIMP-1表达载体分别作PCR及双酶切鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与TIMP-1序列设计完全一致,将其转染人胃癌BGC-823细胞后,TIMP-1的表达定位在细胞胞浆内.结论:成功构建了TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体,为TIMP-1的肿瘤靶向治疗研究奠定了基础.     

Construction of cloning vector of tumor suppressor gene Fhit

Ｉｎ 1996 ,Ｏｈｔａ[1] ａｎｄｈｉｓｃｏｌｌｅａｇｕｅｃｌｏｎｅｄａｎｄｉｄｅｎ ｔｉｆｉｅｄａｎｅｗｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅ ｆｒａｇｉｌｅｈｉｓｔｉｄｉｎｅｔｒｉａｄ(Ｆｈｉｔ) ,ｓｈｏｗｎｔｏｂｅａｌａｒｇｅｇｅｎｅａｔｈｕｍａｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｒｅｇｉｏｎ 3ｐ14 2ｔｈａｔｅｎｃｏｍｐａｓｓｅｄｔｈｅＦＲＡ3Ｂｃｏｍｍｏｎｆｒａｇｉｌｅｓｉｔｅ .Ｆｒｏｍｔｈｅｎｏｎ ,ｍｏｒｅａｎｄｍｏｒｅｓｔｕｄｉｅｓｉｎｄｉ ｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｕｍｅｒｏｕｓｃａｎｃｅｒｃ…     

基质金属蛋白酶组织抑制因子-1,-2在脑膜瘤中的表达及意义

目的研究基质金属蛋白酶组织抑制因子-1,-2(tissue inhibitor ofMMP,TIMP-1,-2)与脑膜瘤的关系.方法采用免疫组化S-P法(Streptavidin-Peroxidase)检测10例正常蛛网膜组织、28例良性脑膜瘤和32例恶性脑膜瘤组织中TIMP-1及TIMP-2的表达水平.结果 TIMP-1在正常蛛网膜组织、良性脑膜瘤和恶性脑膜瘤中的阳性表达率分别为100%(10/10)、89.3%(25/28)和12.5%(4/32),其表达强度经检验显示呈逐次降低趋势,各组间的差异有统计学意义(P＜0.05).TIMP-2在正常蛛网膜组织、良性脑膜瘤和恶性脑膜瘤中的阳性表达率分别为90.0%(9/10)、92.9%(26/28)和18.8%(6/32),其表达强度经检验显示呈逐次降低趋势,其中恶性脑膜瘤与良性脑膜瘤之间的差异有统计学意义(P＜0.01).结论 TIMP-1,TIMP-2在恶性脑膜瘤中的表达强度低于良性脑膜瘤和正常蛛网膜组织,表明TIMP-1和TIMP-2表达水平的下调在脑膜瘤的侵袭、恶变过程中起一定作用.     

重组腺相关病毒介导的TIMP-1载体的构建及鉴定

目的：构建及鉴定载入金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)的重组腺相关病毒载体。方法：应用基因重组的方法构建含全长TIMP-1的重组腺相关病毒骨架质粒(pAAV—TIMP-1)，利用磷酸钙沉淀法将腺相关病毒载体质粒共转染入HEK293细胞中，分别装配成rAAV—TIMP-1和rAAV—hrGFP，将rAAV-hrGFP转导HT1080细胞测定重组病毒的滴度，Westernblot方法检测rAAV—TIMP-1在HT1080细胞中的表达情况。结果：成功构建rAAV—TIMP-1，病毒滴度达到10^9 TU／ml，转导细胞后，转导组TIMP-1的表达水平高于对照组。结论：构建的rAAV—TIMP-1，为基因修饰胰岛移植提供了新的手段。     

Islet-1基因逆转录病毒表达载体的构建

目的：分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1（Islet-1）基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法：利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1 TA 中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其导入包装细胞PA317中,经G418筛选后,获得阳性克隆。结果：RT-PCR产物为1 050 bp条带,经测序鉴定与GenBank中Islet-1基因的序列相同;构建的plEGFP-C1-Islet-1载体经酶切鉴定,证实Islet-1基因片段正确插入逆转录表达载体中。用共聚焦激光扫描显微镜观察导入Islet-1基因的PA317细胞,可见细胞发出绿色荧光。结论：分离得到了大鼠Islet-1基因并成功构建了plEGFP-C1-Islet-1表达载体。     

人NHE-1基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的构建人Na -H 交换蛋白-1(Na -H exchanger-1,NHE-1)基因反义真核表达载体.方法采用分子克隆技术,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶从NHE-1cDNA pEAP切下所需目的片段,然后将该片段反向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)/Zeo的多克隆位点,最后对产生重组子进行琼脂糖凝胶电泳鉴定.结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,将目的片段成功的连接到pcDNA3.1(-)/Zeo载体上.结论成功地将NHE-1目的片段反向插入到pcDNA3.1(-)/Zeo中,构建了人NHE-1反义表达真核载体hNHE-1.     

TIMP-3基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌MDA-MB-453细胞生长及侵袭的抑制作用

目的: 构建组织基质金属蛋白酶抑制剂3(TIMP-3)真核表达载体并转染乳腺癌MDA-MB-453细胞,探讨TIMP-3对MDA-MB-453细胞生长及侵袭的抑制作用。 方法: 采用RT-PCR法从人新鲜胎盘组织中获得TIMP-3 cDNA,连接至pMD18-T载体,EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切pMD18-T-TIMP3重组质粒及pcDNA3.1载体并连接,构建pcDNA-TIMP-3真核载体,酶切鉴定、测序。将乳腺癌MDA-MB-453细胞分为正常对照组、pcDNA空载体组(只转染pcDNA空载体)和pcDNA-TIMP-3组(转染pcDNA-TIMP-3)。Western blotting法测定蛋白表达,采用MTT法和Boyden小室侵袭实验测定各组细胞的增殖活性及侵袭能力。 结果: 重组载体经过EcoRⅠ 和XbaⅠ酶切后,产生633bp的TIMP-3目的片段和pcDNA3.1线性化载体,经自动测序仪测定TIMP-3序列完全正确。转染重组载体后MDA-MB-453细胞稳定表达了TIMP-3,与正常对照组和pcDNA空载体组比较,pcDNA-TIMP-3组细胞增殖活性明显降低(P<0.05),穿透以Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、层黏连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)和玻璃连接蛋白(VN)包被的Matrigel膜的侵袭细胞数明显减少(P<0.05)。 结论: 成功构建pcDNA3.1-TIMP-3真核表达载体,可在MDA-MB-453细胞中高表达TIMP-3蛋白,并对MDA-MB-453细胞生长及侵袭性有抑制作用。     

人KiSS-1基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆转移抑制基因KiSS-1的不含信号肽的表达序列,构建人KiSS-1基因的真核表达载体.方法:从人正常胰腺组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达质粒pcDNA3/KiSS-1.结果:经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组入载体pcDNA3的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pcDNA3/KiSS-1的成功构建,为该基因相应蛋白质的表达和其抗体的制备研究提供基础.