实时荧光定量PCR检测早产孕妇血浆中游离胎儿DNA

近年来研究学者证实孕妇血浆中存在着胎儿DNA,这一发现有极重要的潜在临床应用价值,这为非损伤性的疾病诊断及孕期监测提供了一种新的工具。本研究应用实时荧光定量聚合酶链反应（RQ-PCR）检测出现早产宫缩的孕妇血浆中游离胎儿DNA来确定胎儿DNA在母血浆中的存在,以期为孕期监测和早产的病理生理过程的进一步研究奠定基础。     

实时荧光定量PCR检测早产孕妇血浆中游离胎儿DNA

近年来研究学者证实孕妇血浆中存在着胎儿DNA[1],这一发现有极重要的潜在临床应用价值,这为非损伤性的疾病诊断及孕期监测提供了一种新的工具。本研究应用实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测出现早产宫缩的孕妇血浆中游离胎儿DNA来确定胎儿DNA在母血浆中的存在,以期为孕期监测和早产的病理生理过程的进一步研究奠定基础。一、材料和方法1.对象本院2004年1月~2005年2月收治的自发性规则宫缩的孕妇102例,其中初次妊娠者69例,2次妊娠者31例,多次妊娠者2例。孕妇妊娠孕周为28~37周。孕妇年龄2 l~35岁。取2名健康男性及2名未孕且无妊娠…     

母亲血浆中胎儿RhCcEe基因的检测

目的探讨用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测孕妇血浆中胎儿RhCcEe基因的可行性。方法用QIAamp DNA Kit抽提孕妇血浆DNA,应用9个(D3S1358、VWA、FGA、D5S818、D13S317、D7S820、D8S1179、D21S11、D18S51)具有高度多态性的短串联重复序列(STR)位点,对孕妇血浆样本中DNA进行STR等位基因扩增。同时检测孕妇丈夫外周血来源DNA,通过胎儿父源性等位基因在孕妇血浆中的检出确认胎儿DNA的存在。通过FQ-PCR法检测34例孕妇血浆中胎儿RhCcEe基因,并对出生后婴儿脐带血进行RhCcEe血清学表型分析,回顾性评价胎儿基因分型结果的准确性。结果在10例母亲表型为ee纯合子的样本、11例母亲表型为CC纯合子的样本、5例母亲表型为EE纯合子的样本及8例母亲表型为cc纯合子的样本中均分别检测到了母亲所缺少的E、c、e、C基因,这与出生后婴儿外周血血清学分型相吻合。结论FQ-PCR法是一种灵敏度和准确性高,且特异性强的非创伤性产前诊断胎儿RhCcEe基因型的方法,当母亲为纯合子时,血将中胎儿RhCcEe基因分型具有临床意义,可用于新生儿溶血病的预防和诊断。     

母亲血浆中胎儿RhCcEe基因的检测

目的探讨用实时荧光定量PCR（FQ—PCR）检测孕妇血浆中胎儿RhCcEe基因的可行性。方法用QIAampDNAKit抽提孕妇血浆DNA,应用9个（D3S1358、VWA、FGA、D5S818、D13S317、D7S820、D8S1179、D21S11、D18S51）具有高度多态性的短串联重复序列（STR）位点,对孕妇血浆样本中DNA进行STR等位基因扩增。同时检测孕妇丈夫外周血来源DNA,通过胎儿父源性等位基因在孕妇血浆中的检出确认胎儿DNA的存在。通过FQ—PCR法检测34例孕妇血浆中胎儿RhCcEe基因,并对出生后婴儿脐带血进行RhCcEe血清学表型分析,回顾性评价胎儿基因分型结果的准确性。结果在10例母亲表型为ee纯合子的样本、11例母亲表型为CC纯合子的样本、5例母亲表型为EE纯合子的样本及8例母亲表型为CC纯合子的样本中均分别检测到了母亲所缺少的E、C、e、C基因,这与出生后婴儿外周血血清学分型相吻合。结论FQ—PCR法是一种灵敏度和准确性高,且特异性强的非创伤性产前诊断胎儿RhCcEe基因型的方法,当母亲为纯合子时,血将中胎儿RhCcEe基因分型具有临床意义,可用于新生儿溶血病的预防和诊断。     

荧光定量PCR检测Rh阴性孕妇外周血浆游离DNA中胎儿RhD血型

目的 探讨荧光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)技术对Rh阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行非创性产前诊断胎儿RhD血型的可行性.方法 选取78份妊娠11～40周、B超确诊为单胎的Rh阴性孕妇血浆.采用9个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)多态性位点及Y染色体性别决定区基因(sex-determining region Y chromosome,SRY)确定胎儿DNA的存在;运用FQ-PCR技术对血浆中游离胎儿DNA进行RHD基因外显子5、7、10和内含子4定量分析,以确定胎儿RhD血型的基因型;其基因型结果与产后新生儿脐血血清学检测结果进行对比分析,回顾性评价胎儿基因定型结果的准确性.结果 78份标本中,41份检测到SRY基因,平均浓度为(214.7±120.9)拷贝/ml,产后证实皆为男性.70份FQ-PCR基因定型结果与血清学结果相符,另有5份确定为假阳性,3份基因定型结果不可确定,检测结果总符合率为90%(70/78).5份假阳性标本通过检测RHD1227A等位基因鉴定了4份RhD放散型,FQ-PCR最终结果准确率达到95%(74/78).结论应用FQ-PCR方法进行非创性胎儿RhD血型检测可用于新生儿溶血病的预防和诊断.     

实时定量荧光PCR检测白血病融合基因

本研究旨在建立实时定量荧光PCR的方法并检测CML、ALL、APL患者中融合基因的拷贝数,观察患者体内融合基因转录水平的变化。构建质粒标准品,制作标准曲线。检测49例患者的骨髓及外周血标本130份,对个别患者连续监测融合基因转录表达水平,结果表明：在82．4％（28／34）的CML患者中检测到BCR—ABL^p210阳性（BCR—ABLP210／ABL比值为0．01～3．19）,其中在1例CML急淋变患者检测到BCR—ABL^p210。和BCR—ABL^p190双阳性;在66．7％（4／6）的ALL患者中检测到BCR—ABL阳性,其中2例BCR—ABL^p210阳性,2例BCR—ABL^p190阳性;在77．8％（7／9）的APL患者中检测到PML—RARa融合基因阳性（PML—RARa／ABL比值为0．0014～3．199）,其中3例为长型,3例为短型,1例为变异型,检测结果为阴性的患者处于缓解期;连续监测患者融合基因转录表达水平与临床缓解和复发的变化情况相吻合。结论：实时定量荧光PCR技术成熟、操作简便,检测白血病融合基因结果准确稳定,对于临床明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值,值得推广应用。     

从孕妇血浆中提取胎儿DNA鉴定胎儿RhCcEe血型

目的探讨利用孕妇血浆中游离胎儿DNA进行非创伤性产前诊断胎儿RhCcEe血型的方法。方法采用QIAamp DNA Kit抽提孕妇血浆DNA，利用SRY基因确认胎儿DNA的存在，通过PCR方法扩增30例孕妇血浆中胎儿DNA以检测胎儿RhCcEe基因，并对产前孕妇外周血和产后婴儿外周血进行RhCcEe血清学表型分析，回顾性评价胎儿基因分型结果的准确性。结果30例样本中，13例母子表型完全相同，17例存在区别。当母亲表型为RhCC、cc、EE、ee纯合子时，均成功扩增出母亲所缺少的c、C、e、E基因。结论本研究建立的非创伤性产前诊断胎儿RhCcEe基因型的方法是可行的，当母亲为纯合子时，血浆中胎儿RhCcEe基因分型具有临床意义，可用于新生儿溶血病的预防和诊断。     

血浆microRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立特异、稳定且可靠的血浆microRNA(miRNAs)实时荧光定量PCR技术。方法收集10例健康人血浆标本,采用mirVanaTM PARIS kit试剂盒法提取血浆miRNAs,以miRNA特异的茎环引物引导逆转录,通过SYBR Green实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)对外参照cel-miR-39、cel-miR-238及血浆miR-342-3p进行检测。结果健康人血浆miR-342-3p及外参cel-miR-39、cel-miR-238可以实现特异性扩增及定量。溶解曲线显示10例健康人血浆标本中cel-miR-39、cel-miR-238和miR-342-3p扩增产物分别在81.44、81.62、82.71℃时出现单一峰,无引物二聚体峰和其他非特异峰出现。血浆miR-342-3p批内批间重复性实验的标准差在0.13~0.20、变异系数(CV)在0.42%~0.66%,显示该方法重复性较好。以cel-miR-39、cel-miR-238作为外参照,同一血浆标本miR-342-3p的5次检测结果ΔCt的标准差为0.22、CV为1.68%,说明cel-miR0-39、cel-miR-238可作为血浆miRNAs实时荧光定量PCR检测的稳定外参。结论实时荧光定量PCR技术可作为研究血浆miRNAs较好的技术平台。     

实时荧光定量PCR技术运用于肝癌患者基因检测

目的探讨实时荧光定量PCR SYBR Green I探针技术在研究肝癌患者中基因表达情况的可行性。方法运用实时荧光定量PCR SYBR Green I技术,检测肝癌患者癌组织及癌旁组织RAP1GAP基因表达情况。结果实验组和对照组有明显的统计学差异。结论Real-time PCR技术检测目的基因的表达是非常方便快捷准确的方法。     

实时荧光定量PCR检测血中曲霉菌基因的实验研究

目的：建立并评价从血标本中检测曲霉菌基因的real-time PCR方法。方法：用自行设计的高效率引物探针对标准菌株及临床疑似病人血标本进行检测,对方法的敏感性、特异性进行评价。结果检测出曲霉菌基因敏感性达10拷贝ITS I基因,相当于5～10CFU／ml,与人类基因组、其他真菌及细菌无交叉反应。29例临床疑似标本阳性率为69％,与临床诊断符合率为86％。结论：real-time PCR检测血中曲霉菌基因有较高的敏感性、特异性,有一定的临床应用前景。     

荧光实时定量PCR检测端粒长度

目的 应用定量聚合酶链反应(PCR)方法测量端粒长度.方法 随机选取63例健康人外周血样本,采用定量PCR方法测量端粒长度相对T/S比率、DNA印迹法测定端粒限制性片段(TRF)长度并进行相关性分析.结果 定量PCR测量端粒长度相对T/S比率为0.76±0.27,DNA印迹法测量平均TRF值为9.20±1.12,两种方法测量的结果 相关性分析R2=0.575,P＜0.01.结果 采用定量PCR方法测量端粒长度具有重复性好、省时、简便、可靠,可高通量的处理大量样品的特点,端粒的长短同癌症的发生有密切联系.本方法值得推广应用于癌症的遗传学和分子流行病学研究.     

TaqMan实时荧光定量PCR检测艰难梭菌

目的 建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于艰难梭菌的快速检测;评价基于纯培养艰难梭菌和粪便中艰难梭菌的2种标准曲线;并应用该荧光定量PCR法对急性艰难梭菌感染（CDI）的小鼠进行粪便含菌量检测评价。方法 针对艰难梭菌基因组中16S rRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套快速检测艰难梭菌含量的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、灵敏性;绘制艰难梭菌纯菌浓度梯度稀释标准曲线和粪便中同浓度梯度艰难梭菌的标准曲线,比较两者的差异;用艰难梭菌高毒株NAP1/027感染用抗生素处理的C57BL/6小鼠,建立CDI小鼠模型,同时应用该荧光定量PCR和活菌培养法定量检测小鼠粪便中的艰难梭菌含量变化。结果 建立的TaqMan实时荧光定量PCR具有较高的灵敏性和特异性,生成标准曲线的相关系数为0.999 8,斜率为-3.400 4;用纯培养艰难梭菌和粪便中艰难梭菌分别制备标准曲线,结果表明2种标准曲线定量检测结果差异无统计学意义。建立CDI小鼠模型,应用该荧光PCR能有效、准确的检测出粪便中艰难梭菌的含量,可替代费时费力的活菌培养计数法。结论 用纯培养艰难梭菌来制备标准曲线不影响对含菌粪便标本的准确定量检测,荧光定量PCR能准确快捷地检测CDI小鼠粪便中的艰难梭菌含量,比活菌计数更快速和方便,可用于艰难梭菌感染小鼠模型中小鼠肠道内艰难梭菌定植的定量检测。     

TaqMan实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌

目的利用实时荧光定量聚合酶链反应（实时PCR）方法进行肺炎链球茵的检测和流行病学调查。方法用实时PCR技术扩增并检测400例临床标本的肺炎链球菌的自溶素（1yt）基因,并将其与传统的培养法进行对比。结果400例,临床标本中,实时PCR检测肺炎链球菌为阳性的有78例（阳性率为18％）,传统培养法结果为阳性的有29例（阳性率为7．25％）。结论实时PCR是一种灵敏、特异、快速的检测肺炎链球菌方法,其可用于肺炎链球菌的诊断和流行病学调查。     

实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化

目的 建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法.方法 以肺癌细胞株NCI-H460作为RAssF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200 μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆.用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测.以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量.结果 实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测最低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆).15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%).5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml.结论 实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强.     

实时荧光定量PCR直接检测粪便标本艰难梭菌tcdB基因

目的建立艰难梭菌实时荧光定量PCR检测方法,直接检测粪便标本艰难梭菌tcd B基因,并探讨其应用价值。方法根据艰难梭菌基因组设计tcd B基因特异性引物及探针,用ATCC 43255标准株评价其敏感性,选取艰难梭菌生物学特征相近的临床菌株验证其特异性;收集2015年10-12月临床腹泻患者稀便标本115份,提取基因组总DNA后进行tcd B基因检测,并以产毒培养法为参考方法,探讨该方法的临床诊断价值。结果荧光定量PCR法最低检测限为1×10-3ng,并且仅特异性地扩增产毒艰难梭菌;临床样本评价荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.0%、99.1%、85.7%和98.1%。结论实时荧光定量PCR直接检测稀便标本中的艰难梭菌tcd B基因可用于艰难梭菌相关腹泻的快速诊断。     

用实时荧光定量PCR检测NAT2基因型及其意义

目的 探讨深圳地区汉族人中NAT2基因分布特征,为开展NAT2基因与肿瘤相关性研究和药物代谢性疾病诊治提供依据。方法将DNA浓度为40 ng/μl的标本进行1×100、1×101、1×102、1 ×103、1 ×104倍比梯度稀释,以验证实时荧光定量PCR检测NAT2基因的灵敏度。采用实时荧光定量PCR结合TaqMan探针技术检测554名深圳汉族健康人NAT2基因282、341、481、590和857突变位点,并进行基因分型。同时用直接测序法对47名健康人标本进行平行检测,以验证和评价荧光定量PCR检测NAT2基因的敏感度、特异度和准确性。结果 经倍比梯度稀释试验验证实时荧光定量PCR检测NAT2基因的灵敏度可精确至10-4ng/μl。采用实时荧光定量PCR从554名深圳汉族人中检出NAT2*4、*5、*6、*7、*11等位基因频率分别为64.6％( 358/554)、6.3％( 35/554)、25.3％ (140/554)、30.0％( 166/554)、0.6％( 3/554)。主要基因型NAT2* 4/*6、*6/*7、*13/*13或*12/*12或*4/*4、*4/*7、*7/*13、*12、*6/*13(*12)频率依次为12.3％(68/554)、8.3％ (46/554)、7.6％(42/554)、40.5％(224/554)、8.1％ (45/554)、7.2％ (40/554)、5.6％(31/554),7种基因型约占总基因型的89.6％ (496/554)。深圳地区汉族人中NAT2基因主要等位基因为*4、*6、*7、*13,表型以快乙酰化型和中间型为主,分别占40.5％( 224/554)、46.7％(259/554),慢乙酰化型仅占12.8％(71/554)。用荧光定量PCR和直接测序法平行检测47名健康人NAT2基因,与直接测序法比较,检测282、341、481、590、857位点的敏感度分别为88.2％ (30/34)、87.5％( 7/8)、80.0％ (4/5)、100.0％ (22/22)、93.8％ (15/16),特异度分别为100.0％ (13/13)、94.9％ (37/39)、100.0％ (42/42)、96.0％( 24/25)、96.8％( 30/31),准确性分别为91.5％(43/47)、93.6％( 44/47)、97.6％( 46/47)、97.9％ (46/47)、95.7％ (45/47)。结论实时荧光定量PCR检测NAT2基因的灵敏度、敏感度、特异度高,适用于临床及科学研究,深圳地区汉族人主要NAT2等位基因是*4、*6、*7,最常见慢乙酰化表型为*6/*7,这为与NAT2基因相关的代谢性疾病及肿瘤研究提供了数据。     

实时荧光定量PCR检测血浆结核分枝杆菌DNA的初步临床应用

目的 评价实时荧光定量PCR技术检测血浆（或血清）结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）DNA的技术。方法 建立实时荧光定期量PCR方法测定血浆MTB DNA,分别检测临床确诊的55例结核病患者血清43份,血浆25份以及非结核肺部疾病患者血清18份,健康体检血清18份和健康体检者血浆11份的MTB DNA含量。结果 18例非结板肺疾病患者血清、18例健康体检者血清以及11例健康体检者血浆MTB DNA全部阴性。55例初诊结核患者中10例（18．2％）治疗前血浆（或血清）MTB DNA阳性。在痰涂片阴性的18例结核患者中,血浆（或血清）MTB DNA阳性检出率为27．8％（5／18）,其特异性达100％。结论 本研究证实了结核患者血浆（或血清）循环MTB DNA的存在,其定量检测对痰涂片阴性及无痰患者的结核病诊断有重要参考价值。     

实时荧光定量PCR技术检测患儿手足口病病原体

目的采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术检测患儿手足口病原体,以了解本地该病病毒流行特征,为防治手足口病提供病原学诊断依据。方法收集手足口病疑似病例65例（按年龄组分为小于3岁组39例,3~6岁组26例）患儿的咽拭子、疱疹液,用FQ-PCR技术检测标本中肠道病毒通用型（EV）、肠道病毒71型（EV71）及柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）,并与ELISA法进行比较。结果 65例手足口病患儿疑似组FQ-PCR检出EV阳性51例,阳性率为78.5%,其中小于3岁34例,3~6岁阳性17例,小于3岁组EV检出率明显高于3~6岁组（P〈0.05）;EV71阳性45例,COXA16阳性16例;咽拭子标本阳性率为72.3%（47/65）;疱疹液标本阳性率为81.25%（13/16）;ELISA法检测EV阳性29例,阳性率为44.6%（29/65）,CoxA16阳性22例,阳性率为33.8%（22/65）。结论采用FQ-PCR技术进行手足口病病原体检测有助于早期、快速的对手足口病做出病原学诊断。2012年安康地区手足口病病原体以EV71为主,CoxA16次之。     

实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的分析

目的对实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的效果进行分析。方法选取我院拟诊为泌尿生殖道感染患者作为研究样本,对所有患者的分泌物进行分析,分别通过金免疫层析CT抗原检测法实施检验,以及通过RT-PCR对CT的核酸进行检测,对比最终的两组检测结果。结果应用RT-PCR检测检测方法阳性检出效果明显高于对照组的阳性检出效果,对比呈现显著差异,有统计学分析价值(P<0.05)。结论在对沙眼衣原体感染患者进行诊断检查时,应用RT-PCR检测准确率相对较高,能够成为常规方法的补充,值得在临床上广泛应用普及。