肿瘤坏死因子α调控启动子活性促进netrin-1的表达

目的 探讨TNF-α对netrin-1基因表达的影响,并对其调控机制作初步研究。方法 使用RT-PCR和Western blot方法检测TNF-α对netrin-1表达影响。PCR反应克隆出netrin-1启动子序列,构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶报告基因表达载体。转染HEK-293A细胞检测荧光素酶活性。观察细胞因子TNF-α对netrin-1转录水平的表达调控。结果 首先证实了TNF-α能够上调Netrin-1的表达。其次成功构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶表达载体,测序正确,然后利用双荧光素酶报告基因系统证实构建的报告基因载体启动子具有活性。发现肿瘤坏死因子TNF-α可以使netrin-1启动子活性显著增加 (P<0.05),TNF-α以剂量和时间依赖方式调节netrin-1启动子的活性。结论 细胞因子TNF-α可能通过调控启动子的活性而调节netrin-1的表达。     

肠三叶因子启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性分析

目的:克隆肠三叶因子(ITF)启动子序列,构建ITF启动子荧光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法:运用PCR方法从人全血基因组DNA中获得目的基因;双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体上,构建不同长度的ITF启动子报告基因载体(-100--1 826bp);将重组质粒转染至HEK293细胞和LS174细胞48h后,采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果:PCR扩增出不同长度的ITF启动子片段;双酶切及测序鉴定重组体构建正确;转染HEK293细胞和LS174细胞后检测启动子活性,100和200bp启动子活性较低,而300至1 826bp启动子活性较强。结论:成功构建了ITF启动子报告基因载体,具有活性的启动子最小长度为300bp。     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

aP2增强子和启动子荧光素酶基因载体的构建及鉴定

目的构建aP2基因增强子和启动子驱动虫荧光素酶表达的真核表达载体，为进一步研究aP2基因表达调控机制及其信号转导通路等奠定基础。方法提取小鼠肝脏基因组DNA，PCR扩增aP2增强子和启动子，并将其与虫荧光素酶报告质粒PGL3-Basic连接，通过测序鉴定。结果小鼠aP2基因的增强子和启动子正确插入虫荧光素酶真核表达载体，测序结果与GENEBANK报道序列一致。结论aP2基因增强子和启动子驱动虫荧光素酶表达的真核表达载体构建成功。     

含人P21启动子双荧光素酶基因载体的构建

目的构建带有EGFP标记含人P21启动子的双荧光素酶报告基因载体。方法从人血白细胞DNA中克隆P21启动子,用于控制firefly荧光素酶的表达;renilla荧光素酶基因和EGFP基因用IRES连接,在CMV启动子控制下表达;上述元件和基因克隆至载体pLL3.7中,应用酶切和测序的方法进行鉴定正确后转染至293FT细胞观察EGFP表达。结果经酶切、测序证实成功构建了带有EGFP标记的含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体,并成功表达EGFP。结论含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体成功构建,为下一步的药物筛选打下基础。     

大鼠GLUT3基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠葡萄糖转运体3(glucose transporter 3,GLUT3)基因启动子区,并构建其萤火虫荧光素酶报告基因载体。方法:在对大鼠GLUT3基因5′侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从大鼠基因组中扩增出GLUT3基因5′侧翼区-1037～155bp段长为1 292bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1),再用定向克隆的方法将这一启动子区片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic)中,构建出包含大鼠GLUT3基因启动子区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-GLUT3),电泳与测序鉴定,最后再将pGL 3-GLUT3与内参pRL-TK用脂质体转染的方法瞬时共转染PC12和原代培养的神经元中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定pGL 3-GLUT3的启动子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染pGL3-basic与内参pRL-TK。结果:构建出荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。与转染空质粒pGL3-basic组相比,原代神经细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性升高(5.182 9±0.264 8 vs 2.893 1±0.775 4,P=0.008),在PC12细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性也升高(2.797 7±0.512 0 vs 1.179 8±0.312 5,P=0.010)。结论:成功克隆GLUT3基因启动子区,并构建出包含GLUT3基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并且在PC12和原代培养的神经元中pGL 3-GLUT3可以表现出启动子活性。这为后续大鼠GLUT3基因转录调控研究提供研究素材。     

人SMYD3基因启动子荧光素酶报告载体的构建与分析

目的:克隆5′长度不同的SMYD3基因启动子序列并进行活性鉴定。方法:采用PCR方法克隆出SMYD3基因转录起始位点上游不同长度的基因片段,构建T载体并利用酶切与测序进行鉴定;将该基因亚克隆至pGL3-Basic荧光报告基因载体上;瞬时转染Hep3B细胞后用双荧光报告检测系统检测不同片段的荧光活性。结果:T载体酶切与测序结果正确,成功构建了pGL3-Basic+370～1400bp荧光报告载体并利用双荧光素酶报告基因检测系统分析了重组质粒的荧光活性。结论:pGL3-Basic+370～1400bp重组质粒转染组与阳性对照组相比并未表现出显著的荧光活性,本研究认为SMYD3基因的启动子核心区域位于-1334bp的上游。     

人源DNMT1基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其活性检测

目的:利用PCR扩增人源DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体并对其活性进行检测。方法:运用PCR技术以人非小细胞肺癌细胞A549基因组DNA为模版扩增出目的片段,将PCR产物用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上,然后进行转化、菌落PCR及测序验证等。将构建成功的pGL3-proDNMT1-luc重组质粒和内参质粒pRL-CMV-luc共转入H1299细胞中检测DNMT1启动子活性。结果:成功扩增出长度为1634 bp的目的片段,并成功构建出DNMT1启动子荧光素酶报告基因载体,启动子具有活性。结论:DNMT1启动子的成功克隆为进一步研究其分子调控机制和生物学意义奠定了基础。     

人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1启动子荧光素酶报告基因重组体的构建

目的构建内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)基因启动子的报告基因重组质粒,为EOLA1启动子的分析鉴定奠定基础。方法提取人内皮细胞基因组DNA,设计引物克隆EOLA1基因上游不同长度的基因片段,插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,经限制性内切酶酶切鉴定、测序。结果成功构建了3种含有不同长度EOLA1上游基因的pGL3-EOLA1-Luc荧光素表达质粒,形成了系列的EOLA1启动子重组体。结论建立的不同长度EOLA1上游基因的报告基因系统为EOLA1启动子的活性分析奠定了基础。     

小鼠巨噬细胞活化标志物IL-12/IL-10启动子荧光素酶报告基因模型的构建及鉴定

目的:构建pGL3-IL-12p40promoter和pGL3-IL-10promoter两个荧光素酶报告基因载体,并对其进行生物活性鉴定。方法:通过提取小鼠T细胞基因组DNA,分别PCR扩增IL-12p40和IL-10基因的启动子序列,与pGL3-Basic连接成重组体pGL3-IL-12p40promoter和pGL3-IL-10promoter,通过转化扩增,筛选出阳性克隆,并通过酶切、测序及生物学活性检测鉴定构建好的荧光素酶报告基因载体。结果:成功构建了pGL3-IL-12p40promoter和pGL3-IL-10promoter两个荧光素酶报告基因载体,分别在IFN-γ或IL-4的诱导下,能启动细胞内荧光素酶的表达。结论:pGL3-IL-12p40promoter和pGL3-IL-10promoter的荧光素酶报告基因载体的成功构建为研究IL-12和IL-10蛋白的表达调控机制和以IL-12/IL-10为检测指标的巨噬细胞活化状态的判断,以其为靶标的抗肿瘤药物的快速高通量筛选提供了重要的研究工具。     

肿瘤坏死因子-α与结核病关系的研究进展

肿瘤坏死因子-ɑ(Tumour necrosis factor-alpha,TNF-ɑ)是一种具有广泛生物学效应的多功能细胞因子,它与结核的发生、病程、转归、复燃及治疗都有密切的关系。近年来TNF-ɑ在结核发病中的免疫机制日益受到重视,现对TNF-ɑ在控制结核感染中的枢纽作用,尤其是TNF-ɑ对结核肉芽肿形成的影响,并探讨TNF-ɑ拮抗剂应用于炎性疾病治疗时所存在的结核病风险做一综述。     

含mdr1启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建

目的克隆编码mdr1基因的启动子并插入荧光素酶报告基因载体.方法用PCR技术扩增出人类mdr1基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pGEM-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-enhancer载体中,并确定扩增DNA的序列.结果测序结果显示扩增mdr1启动子序列正确.结论成功克隆了mdr1启动子,为下一步对多耐药性卵巢癌进行靶向基因治疗提供了重要基础.     

PLUNC基因启动子区荧光素酶报告载体的构建与鉴定

目的构建人PLUNC(palate,lung and nasal epithelium clone)基因启动子区C-1888T SNP位点不同单倍型荧光素酶报告基因表达载体。方法利用PCR技术得到1888位点不同基因型的PLUNC基因启动子区目的片段,将其分别插入到pMD18-T载体和pGL3-enhancer荧光素酶报告基因载体中并测序。结果成功构建了人类PLUNC基因C-1888T SNP位点上的2种不同纯合子基因型(CC型和TT型)的荧光素酶报告载体(pGL3-enhancer-T型和pGL3-enhancer-C型),且测序得以证实。结论成功构建出的荧光素酶报告载体,为研究PLUNC基因不同的1888SNP位点能否调控不同的PLUNC基因表达提供了基本实验条件。     

抑癌基因BRCA1启动子荧光素酶报告基因的构建及活性测定

目的:克隆人BRCA1基因的启动子,构建荧光素酶报告基因载体,并在细胞内检其活性,为其后续基因凋控研究提供依据。方法:采用PCR技术,从人正常宫颈组织细胞中扩增出BRCA1启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,测序所扩增的DNA序列,将其转染入HCT 116细胞中并检测其活性。结果:酶切及基因测序方法证实所构建质粒含有pGL3-basic全序列及BRCA1启动子上游调控序列,扩增的BRCA1启动子序列正确;双报告基因实验检测荧光素酶活力表明,p53缺失的HCT116细胞中BRCA1启动子明显增加（P<0.05）,构建的报告基因具有启动子活性。结论:克隆BRCA1启动子及成功构建人BRCA1启动子报告基因,可实现快速、经济和准确地克隆已知基因启动子分子和构建启动子载体的目的。     

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子调控表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因启动子调控的荧光素酶基因表达载体。方法:用巢式PCR方法克隆hTERT序列长约1100bp的启动子片段,经测序无误后将其插入荧光素酶基因报告载体中,构建pGL3-hTERTp重组质粒,转化JM190细菌得到大量含有hTERT启动子的荧光素酶重组质粒。用双酶切和PCR法鉴定重组质粒,并送测序鉴定。结果:经过酶切和PCR法鉴定成功地构建了携带hTERT启动子的重组荧光素酶基因报告载体。结论:成功获得由hTERT启动子调控的荧光素酶基因表达载体,为研究As₂O₃对HL-60细胞端粒酶作用的分子机制打下基础。     

全身炎症反应综合征患者血清抗凝血酶及血浆肿瘤坏死因子-α的变化

目的探讨全身炎症反应综合征(SIRS)患者血清抗凝血酶(AT)及血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的变化及两者之间的关系.方法用全自动免疫比浊定量分析法和酶联免疫吸附法(ELISA)对35例SIRS患者及30例健康体检者在入院后第一天的血清AT及血浆TNF-α含量进行测定.结果与正常对照组相比,SIRS组患者血清AT水平明显下降,而血浆TNF-α含量显著升高,具有统计学差异(P<0.05),且两指标具有明显的相关性.结论SIRS患者血清AT含量下降,而血浆TNF-α含量升高,两者具有相关性,从而提示炎症细胞因子与凝血系统之间可能存在相互作用的关系.     

肿瘤坏死因子-α在急性胰腺炎中的作用

细胞因子在急性胰腺炎发病机制的作用日益被重视,其中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为急性胰腺炎发病过程中极其重要的因子及其在疾病中的作用也同样被重视。TNF-α不仅通过对胰腺、肠道、肝脏等多器官的损伤,导致机体出现严重的炎症反应,还介导其他炎症因子的释放,加重对机体的损伤。