含绿色荧光蛋白和小鼠T-bet基因双顺反子真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的 构建一种带有绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠T-bet基因双顺反子的新型真核表达载体pCI-mT-bet-IRES-GFP.方法 利用脑炎心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES),将GFP的cDNA与小鼠T-bet基因(mT-bet)连接到真核表达载体pCI中,构建含GFP和mT-bet基因双顺反子的重组质粒.结果 成功构建了含GFP和mT-bet基因双顺反子的真核表达载体.荧光显微镜下可观察到发绿色荧光的转基因细胞.结论 含绿色荧光蛋白和mT-bet基因双顺反子真核表达载体的构建为哮喘基因治疗研究提供了新的生物表达体系.     

含绿色荧光蛋白和小鼠T—bet基因双顺反子真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建一种带有绿色荧光蛋白（GFP）和小鼠T—bet基因双顺反子的新型真核表达载体pCI—mT—bet—IRES—GFP。方法利用脑炎心肌炎病毒（EMCV）的内部核糖体进入位点（IRES），将GFP的cDNA与小鼠T—bet基因（mT—bet）连接到真核表达载体pCI中，构建含GFP和mT—bet基因双顺反子的重组质粒。结果成功构建了含GFP和mT—bet基因双顺反子的真核表达载体。荧光显微镜下可观察到发绿色荧光的转基因细胞。结论含绿色荧光蛋白和mT—bet基因双顺反子真核表达载体的构建为哮喘基因治疗研究提供了新的生物表达体系。     

组织因子途径抑制因子/绿色荧光蛋白双顺反子真核表达载体构建及其在NIH 3T3细胞中表达

目的构建含人组织因子途径抑制因子(TFPI)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双顺反子真核表达载体,并验证其在NIH 3T3细胞中的表达,为血管再狭窄的防治提供一个具有示踪和治疗双重作用的有效载体。方法以含有全长cDNA的pIRES-TFPI为模板,多聚酶链反应(PCR)扩增TFPI全长cDNA,经酶切后插入到pIRES2-AcGFP1-Nuc载体中,构建成双顺反子真核表达载体,重组质粒经酶切图谱分析、PCR扩增及测序鉴定后命名为pIRES2-AcGFP1-Nuc-TFPI。将其转染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达,以RT-PCR检测TFPI在细胞内的表达。结果经酶切图谱分析、PCR扩增及DNA测序证实双顺反子真核表达载体构建正确;荧光显微镜可观察到细胞内GFP的表达;RT-PCR证实经TFPI基因转染的细胞内TFPI mRNA表达增高。结论成功构建了包括TFPI和GFP的真核双表达载体,并使其在NIH3T3细胞中顺利表达。     

结核杆菌Ag85B与ESAT-6双顺反子真核表达质粒的构建及体外表达

目的构建结核杆菌Ag85B与ESAT-6双顺反子真核表达质粒。方法采用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B及ESAT-6基因,将其分别定向克隆入真核双表达载体pIRES,构建同时表达两个目的基因的双顺反子重组质粒。进行酶切分析及序列测定后,用脂质体包裹体外转染A549细胞,RT-PCR检测Ag85B及ESAT-6的表达。结果核酸序列测定证实重组质粒构建正确;该重组质粒能在体外表达Ag85B及ESAT-6mRNA。结论成功构建了结核杆菌Ag85B及ESAT-6双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达,为进一步在整体动物水平的实验研究奠定了基础。     

人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建人Gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-Gax质粒中扩增出人Gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定Gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人Gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人Gax真核表达载体pEGFP-N1-Gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人GaxmRNA表达。结论:成功构建人Gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-Gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP-2的构建及鉴定(英文)

背景:骨形态发生蛋白等因子及以其为中心构建的支架或载体已经广泛应用于实验研究中,并逐渐应用于临床,然而,治疗效果的示踪方法为实验提出了挑战。增强型绿色荧光蛋白基因的发现和应用解决了这一难题。目的:构建双顺反子真核表达载体PIRES2-增强型绿色荧光蛋白-人骨形态发生蛋白2,检测其表达情况。方法:利用RT-PCR方法从人骨肉瘤组织中提取人骨形态发生蛋白2基因,使之与PMD18-T载体连接,经酶切回收后,与目的载体pIRES2-增强型绿色荧光蛋白连接。用PCR技术及基因测序鉴定构建结果。然后将构建好的载体转染人胚肾293细胞,通过荧光显微镜及Western blot技术观测其表达。结果与结论:实验成功扩增了人骨形态发生蛋白2基因并构建了pIRES2-增强型绿色荧光蛋白-人骨形态发生蛋白2载体,将pIRES2-EGFP-hBMP-2用脂质体转染入人胚肾293细胞后48h,荧光显微镜观察约30%细胞发出绿色荧光,Western blot结果发现在Mr46×106处有一特异性骨形态发生蛋白条带,表明所构建载体中靶基因能成功表达。     

EBV特异性CTL相关TCR Vα-pIRES-TCR Vβ重组质粒的构建及体外表达

目的 构建EBV特异性细胞毒T细胞(CIL)相关的TCR Vα-pIRFS-TCR Vβ真核双表达质粒.方法 通过RT-PCR和基因扫描技术分析EBV特异性CTL克隆的T细胞受体(TCR)Vα和Vβ谱系表达情况及T细胞克隆性,确定其优势表达的TCR Vα15和TCR Vβ1亚家族基因的核苷酸序列(包括CDR3互补决定区),PCR扩增出TCR Vα15和TCR Vβ1基因后,分别定向克隆入真核双表达载体pIRES,构建双顺反子重组质粒TCR Vα-pIRES-TCR、Vβ,转基因技术将其转染A549细胞和Molt4细胞,通过RT-PCR、实时定量PCR、流式细胞术和蛋白印迹分析检测TCR Vα15和TCR Vβ1基因的表达.结果 酶切分析和核酸序列测定证实重组质粒构建正确,转染重组质粒的细胞能够表达TCR Vα15和TCR Vβ1的mRNA及蛋白.结论 成功构建了EBV特异性的TCR Vα-pIRES-TCR Vβ双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达,为进一步的实验研究奠定了基础.     

EGFP-Sam68融合蛋白在HeLa细胞的表达和定位

目的克隆有丝分裂Src相关蛋白p68(Sam68)基因cDNA全长,构建Sam68真核绿色荧光蛋白表达载体,并确定其在HeLa中的表达和定位。方法提取HeLa细胞总RNA,RT-PCR扩增Sam68基因片段,经酶切鉴定及测序正确后,克隆到真核绿色荧光蛋白表达载体(pcDNA3.0-EGFP)上,并转染HeLa细胞,Western blot法检测Sam68表达,免疫荧光细胞化学染色观察其细胞定位。结果酶切和测序证实Sam68正确插入pcDNA3.0-EGFP载体中,且载体正确表达了EGFP-Sam68融合蛋白,该蛋白定位在HeLa细胞核内。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-EGFP-Sam68。     

SEDL基因及其突变体真核表达载体的构建与鉴定

目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。     

人ING4的基因克隆及真核表达

目的 克隆人生长抑制因子家族(inhibitor of growth famility member4,ING4)基因,构建其真核表达载体pEGFP-ING4.方法 提取人胎盘总RNA,经RT-PCR扩增出ING4 cDNA,克隆至pEGFP-C2载体,构建的真核表达载体pEGFP-ING4用双酶切、基因测序进行序列鉴定;转染MCF-7细胞用荧光显微镜和免疫组化检测重组质粒的表达.结果 RT-PCR产物为750 bp的条带,双酶切和基因测序正确,转染可见目的 蛋白融合表达.结论 从人胎盘组织中成功克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达,为进一步研究ING4基因的作用及抗肿瘤机制奠定了基础.     

内部核糖体进入位点控制hytk基因和绿色荧光蛋白的表达

构建一种带有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）和ｈｙｔｋｃＤＮＡ（潮霉素磷酸转移酶和ＨＳＶ－ｔｋ的融合基因）的新型真核表达载体，用于简便、快速地了解自杀基因在恶性肿瘤听转染效率。利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖体进入位点，将ｇｆｐ的ＣＤＮＡ与ｈｙｔｋ真核表达载体重组，构建获得含ｇｆｐ和ｈｙｔｋ基因的重组质粒；Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导下分别转染ＣＯＳ－７细胞及人膀胱癌细胞株ＥＪ，并检测表达情况。结果示该载体在     

人干扰素α高效表达质粒pEE14.1-IFN-α的构建和表达

目的:构建人干扰素α的高效表达质粒pEE14.1-IFN-α,并在真核细胞中验证其表达。方法:通过PCR获得人IFN-α基因,连入过渡载体pCI-GPI,然后克隆入高效表达载体pEE14.1中,构建重组表达质粒pEE14.1-IFN-α。瞬时转染293T细胞后48 h收获上清,采用ELISA,Western blot分别验证目的基因表达。结果:pEE14.1-IFN-α经酶切和测序分析,与预期设计完全一致,表明重组质粒构建成功。ELISA法检测瞬时转染细胞上清中α干扰素含量,浓度约为3.15 ng/mL,说明表达的蛋白有免疫活性,Western blot检测也显示该重组质粒在上清中分泌表达。结论:成功构建高效表达质粒pEE14.1-IFN-α,为慢性乙肝免疫治疗提供新的备选方案。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-Axin的构建及其在神经胶质瘤细胞内的表达

目的:构建真核表达载体pIRES2EGFPAxin,并在神经胶质瘤细胞系C6中进行表达。方法:用PCR的方法扩增Axin基因,构建真核表达载体pIRES2EGFPAxin,经NheI及SalI双酶切鉴定并测序。通过脂质体法转染C6细胞,用荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,用免疫组化染色的方法检测细胞中Axin的表达。结果:构建了真核表达载体pIRES2EGFPAxin,用脂质体法转染神经胶质瘤细胞C6后,经荧光显微镜和免疫组化染色法检测,可见细胞内有EGFP及Axin的表达。结论:成功地构建真核表达载体pIRES2EGFPAxin,并在神经胶质瘤细胞C6中表达,为研究Axin对肿瘤的生物学作用以及Axin在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础。     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景：核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。 目的：克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。 方法：采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经Bam HI、Xho Ⅰ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。 结果与结论：经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

分泌型重组多肽sPD-1-CellⅠ(P/C-1)调节免疫细胞功能活性及抗肿瘤效应的研究

目的构建双结构域重组多肽sPD-1-Cell Ⅰ（P/C-1）分泌型真核表达载体，并研究体内外表达重组多肽在调节免疫细胞功能活性及抗肿瘤方面的作用和机制。方法用PCR方法分别扩增出编码PD-1胞外结构域的cDNA与编码CH50 CellⅠ结构域的cDNA，3片段连接法插入分泌型真核表达载体pSecTagA中，获得真核表达载体pP／C-1；脂质体介导体外转染BHK细胞，G418筛选出阳性克隆，RT-PCR及免疫印迹检测重组多肽P／C-1的表达，MTT法检测表达产物对脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞杀伤活性的影响，建立小鼠H22肝细胞癌移植瘤模型，裸DNA肌肉注射法分别于体内转染sPD-1、CH50和P／C-1基因，观察并比较各处理因素对小鼠的肿瘤生长的抑制作用。结果酶切及测序鉴定结果表明重组多肽P／C-1真核表达载体构建成功，在BHK细胞培养上清中检测到重组多肽P/C-1的表达，后者能显著增强脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞对H22细胞的杀伤作用，体内实验表明，P/C-1转染对肿瘤生长的抑制作用强烈而持久，显著优于sPD-1和CH50治疗组。结论重组多肽P／C-1真核表达载体构建成功，表达产物P／C-1兼有sPD-1和CH50的生物学功能，能够激活巨噬细胞和脾淋巴细胞，发挥二者协同抗肿瘤作用，从而将非特异性和特异性抗肿瘤免疫有机地结合起来，为肿瘤基因治疗提供新的思路。     

转染PF4 cDNA的GRC-1细胞培养液对于ECV-304细胞生长及VEGF表达的影响

目的：构建真核表达载体pcDNA3-PF4-SS，检测稳定转染后的GRC-1细胞的培养上清对于血管内皮细胞ECV304的生长以及转染细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法：构建真核表达载体pcDNA3-PF4-SS，并经Bgl Ⅱ／Bam HI双酶切鉴定.通过脂质体介导，以该载体稳定转染GRC-1细胞，转染细胞中VEGF因子的表达情况用免疫组化染色法检测，转染细胞的培养上清对于ECV304细胞生长的影响用MTT法检测。结果：经Bgl Ⅱ／BamH I双酶切证实，hPF4 cD—NA已成功地克隆到真核表达载体pcDNA3-CD34-SS中。RT—PCR法检测证实，hPF4 cDNA已成功地转染GRC-1细胞。免疫组化染色检测显示，转染PF4基因的GRC—1细胞的胞浆及胞膜均有VEGF表达，但较转染前明显减弱。细胞计数及MTT法显示，转染后GRC-1细胞的培养上清对ECV304细胞的生长具有抑制作用，吸光度值(A)明显降低。结论：构建了真核表达载体pcDNA3-PF4-SS，并稳定转染GRC-1细胞。转染细胞的培养上清对ECV304细胞的生长及VEGF的表达，均具有明显的抑制作用，为探讨抗肿瘤生长机制和肿瘤疫苗的研制奠定了一定的基础。     

人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165)的真核表达载体，并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法：利用基因克隆技术，将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用BamHI和XhoI双酶切后，再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞，然后以G418筛选阳性克隆。用免疫细胞化学鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组体中已插入目的基因片段VEGF165，免疫细胞化学证实，重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达。结论：成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165。并在骨髓基质细胞中得到表达，为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据。     

VEGF_(165)真核表达载体的构建及其对白血病细胞增殖和化疗药物敏感性的影响

目的:构建血管内皮细胞生长因子的真核表达载体,探讨其对白血病细胞的增殖以及化疗药物敏感性的影响。方法:应用常规基因克隆方法构建pEGFP-C1-hVEGF165真核表达载体,转染白血病细胞K562,采用CCK8法检测重组质粒对细胞增殖的影响,RT-PCR方法检测细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA的表达水平,ELISA方法定量检测细胞培养液和细胞内VEGF蛋白的表达水平,用流式细胞仪检测细胞周期。结果:经酶切鉴定和基因测序证实成功构建了VEGF165真核表达载体。稳定转染pEGFP-C1-hVEGF165的K562细胞较转染pEGFP-C1空质粒的K562细胞增殖加快,VEGF165 mRNA表达明显增加,细胞分泌VEGF蛋白水平上调。转染pEGFP-C1-hVEGF165还可以提高白血病细胞在化疗药物高三尖杉酯碱和氟尿嘧啶作用时的细胞存活率。结论:VEGF165真核表达载体可以上调白血病细胞K562的VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达水平,从而促进白血病细胞的增殖,同时可以降低白血病细胞对化疗药物高三尖杉酯碱和氟尿嘧啶的敏感性。     

共刺激分子配体B7-DC基因真核表达载体和转基因细胞的构建

目的：克隆小鼠B7-DC基因，并构建含该基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-V5His，证明该基因在CHO细胞中的表达方式，为建立B7-DC的转基因小鼠打下基础。方法：从小鼠胸腺中抽提总RNA为模板，通过RT—PCR技术，扩增出B7-DC编码区片段。按常规方法克隆进pEF6V5His载体中，重组质粒经鉴定后采用脂质体法转染CHO细胞，48小时后进行间接免疫荧光实验，72小时后用blasticidin进行筛选，挑选出能稳定表达B7-DC的细胞株。结果：已成功克隆小鼠B7-DC基因并构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体，经间接免疫荧光实验（IFA）证明，该基因在CHO细胞中得到表达。经Western blot检测表明筛选出的转基因细胞稳定表达了B7-DC基因。结论：构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-VSHis，并能在CHO细胞中稳定表达目的基因，为该基因功能的后续研究奠定了基础。