食管鳞癌细胞HIF-1α与survivin的关系

目的探讨食管鳞癌细胞Eca-109中缺氧诱导因子-1α基因（HIF-1α）与抗凋亡基因生存素survivin的关系。方法培养食管鳞癌细胞Eca-109,用氯化钴模拟缺氧以促进HIF-1α表达,再以RNA干扰抑制HIF-1α基因表达,Westernblot法检测其中HIF-1α和survivin的表达。结果氯化钴培养后Eca-109细胞的HIF-1α蛋白表达增加,survivin蛋白表达也增加,并与氯化钴浓度有关;以RNA干扰方法抑制了HIF-1α基因的干扰细胞（Eca-109／shRNA）中HIF—1α蛋白表达减少,survivin蛋白表达也减少。结论在食管鳞癌细胞Eca-109中,HIF—1α基因和survivin表达具有高度的相关性,抑制HIF-1α表达可能通过抑制survivin而促进肿瘤细胞的凋亡。     

5-Fu对食管癌细胞株EC9706 凋亡及HIF-1α蛋白表达的影响

目的 探讨5-氟尿嘧啶(5-Fu)对食管癌细胞株EC9706凋亡及HIF-1α蛋白表达的影响.方法 将EC9706细胞随机分为A、B、C、D、E五组,其中A、B、C、D组于培养基内加入浓度分别为12.5、25、50、100 μg/ml的5-Fu 作用72 h, E组不加药.用流式细胞仪及免疫细胞化学染色技术检测各组细胞凋亡率及HIF-1α蛋白表达情况.结果 细胞凋亡率A组和E组均为0,B、C、D组分别为12.0%、23.2%、22.3% ,C组显著高于其他四组,P＜0.05;HIF-1α蛋白表达阳性率A组为66.50%±3.45%、B组为50.58%±4.34%、C组为37.00%±6.15%、D组为34.83%±3.25%、E组为78.58%±5.71%,E组显著高于其他四组(P＜0.05).结论 5-Fu可诱导EC9706细胞凋亡、下调HIF-1α表达,此可能是其治疗食管癌的机制之一.     

RNA干扰体外抑制人食管鳞癌细胞Eca-109缺氧诱导因子-1α的表达

目的:观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人食管鳞癌细胞系Eca-109中 HIF-1α基因的沉默效应,筛选有效干扰靶点．方法:设计合成干扰缺氧诱导因子-1α RNA 寡核苷酸片段,经退火、连接等步骤克隆至线性化的PGCsi真核表达载体上,测序鉴定．应用LipofectamineTM2000将该质粒分别转染Eca-109细胞和293T细胞,其中Eca-109抗性细胞又经2-4 wk的G418筛选．荧光显微镜评估转染效率,荧光定量RT-PCR检测HIF-1α mRNA表达情况,western blot检测HIF-1α蛋白表达情况．结果:成功构建了3个靶点的重组质粒pGCsi- H1-shHIF,293T细胞平均转染效率为约85．4％, Eca-109细胞的平均转染效率约73．2％．荧光定量RT-PCR和Western blot显示瞬时转染这3种重组质粒的293T细胞和筛选2 wk的Eca-109 细胞HIF-1 α mRNA和蛋白表达均较对照组有不同程度的下降,其中2号和3号靶点的干扰效应尤为明显．在瞬时转染72 h后的293T 细胞中,其抑制率分别达到了78．5％、86．9％ (P=0．000,P=0．000 vs 72 h空白对照组),筛选2 wk的Eca-109细胞中,3号靶点对HIF-1α mRNA的抑制率也达到了69．7％(P=0．000 vs 2 wk空白对照组)．结论:重组质粒pGCsi-shHIF能有效抑制食管鳞癌细胞Eca-109中HIF-1α基因的表达,经不同细胞中的瞬时和稳定转染筛选出了有效干扰靶位．     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠人食管鳞癌移植瘤的抑制作用

目的 研究乙酰肝素酶(Hpa)抑制剂反义脱氧寡核苷酸(ASODN)对食管癌裸鼠移植瘤的体内抑瘤作用.方法采用低分化食管鳞癌细胞TE-13接种裸鼠,构建食管癌皮下侵袭模型,随机分为1mg/kg ASODN组(A组)、2mg/kg ASODN组(B组)和生理盐水(NS,2ml/kg)对照组(C组),每组5只,分别在肿瘤接种区皮下注射相应剂量的ASODN和NS.观察肿瘤体积和肿瘤微血管密度(MVD),采用RT-PCR和免疫组化染色检测移植瘤中Hpa的表达.结果接种后第6天,所有裸鼠在接种部位均长出肿瘤.接种后第21天,A、B组肿瘤体积较C组明显缩小(P<0.01),A、B组抑瘤率分别为50.27%和49.67%.A、B组MVD较c组明显降低(P<0.01).A、B、C组Hpa mRNA阳性表达分别为0.43±0.01、0.45±0.12、1.33±0.05,Hpa蛋白阳性表达分别为45.60±4.57、43.40±7.80、121.20±11.90.A、B组Hpa mRNA、蛋白表达均较C组降低(P<0.01).结论应用ASODN可以抑制肿瘤生长,其作用机制可能在于抑制肿瘤Hpa mRNA、蛋白合成,从而抑制肿瘤血管新生.2mg/kg与1mg/kg Hpa ASODN比较,未能显示更强的抑瘤效果.     

沉默HIF-1α调控MAPK/ERK信号通路抑制NSCLC转移的分析

目的探讨HIF-1α在体内及体外对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞转移的影响及其作用机制。 方法采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测HIF-1α在癌旁正常组织、肺鳞癌组织(LUSC)、肺腺癌组织(LUAD)、A549细胞和HEB细胞中的表达量。上调HIF-1α表达后,通过MTT、细胞侵袭和Western blot实验检测过表达HIF-1α对A549细胞增殖、侵袭和EMT的影响。下调HIF-1α表达后,Western blot检测A549细胞ERK和p-ERK蛋白的表达量。THBQ激活MAPK/ERK通路后,分析A549细胞增殖、侵袭和EMT能力。将细胞株植入裸鼠体内,构建移植瘤模型,最后测量裸鼠移植瘤的体积和重量。 结果HIF-1α在NSCLC组织的表达水平明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。A549细胞中HIF-1α表达水平明显高于HEB细胞(P<0.01),过能够促进A549细胞的增殖和侵袭,N-cadherin蛋白表达量明显上升,E-cadherin蛋白表达量明显下降。下调HIF-1α能够抑制A549细胞内MAPK/ERK通路,且抑制了A549细胞的增殖、侵袭和EMT。下调HIF-1α使裸鼠移植瘤的重量和体积明显减小。 结论沉默HIF-1α通过MAPK/ERK信号通路在体内及体外抑制NSCLC转移。     

反义缺氧诱导因子-1α联合丝裂霉素C治疗裸鼠原位膀胱癌的疗效

目的探素构建和治疗裸鼠原位膀胱移植瘤模型中反义缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)制剂+化疗药物丝裂霉素C(MMC)对裸鼠膀胱癌生长转移的影响。方法经尿道分别灌注反义HIF-1α基因制剂+MMC和单独灌注反义HIF-1α基因制剂或MMC。观察灌注后成瘤裸鼠肿瘤生长和膀胱外淋巴转移情况,同时采用免疫组织化学噻唑蓝(MTT)比色法和原位末端标记(TUNEL)法分别检测瘤细胞增殖率和凋亡指数。结果 MTT法检测结果:联合用药组,反义HIF-1α组和MMC组瘤细胞的增殖率分别是(19.8±3.7)%,(48.6±5.9)%,(35.8±7.4)%;TUNEL检测结果:联合用药组,反义HIF-1α组和MMC组瘤细胞的凋亡指数依次是(82.6±5.7)%,(43.7±8.4)%,(57.9±4.8)%;联合用药组,反义HIF-1α组和MMC组肿瘤大小分别为〔(15.28±6.37)%〕mm2,〔(31.94±5.72)%〕mm2,〔(27.85±3.81)%〕mm2。上述三组细胞增殖率、凋亡指数和肿瘤大小间相互比较,单独用药组虽无统计学意义(P>0.05),但单独用药两组分别和联合用药组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。成瘤裸鼠膀胱外盆腔淋巴转移情况:联合用药组转移率10%(1/10),单独用药的两组转移率40%(4/10),组间转移率差异显著(P<0.01)。结论靶向基因制剂和细胞毒药物化疗联合治疗裸鼠原位膀胱移植瘤的抗肿瘤治疗策略明显优于单一的基因治疗或化疗。     

RNA干扰HIF-1α对血管生成拟态相关基因表达的影响

目的: 探讨常氧及缺氧培养条件下RNA干扰沉默人食管鳞癌细胞Ec a-109缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对血管生成拟态相关基因表达的影响.方法: 选择未转染处理的食管鳞癌Eca-109细胞和3株稳定转染HIF-1α SiRNA的Eca-109细胞, 分别予以常氧和缺氧培养, 缺氧培养12、24、36、48、60、72、96 h, 采用Western blot法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HIF-1α蛋白及mRNA表达, 同时Western blot法检测上皮细胞激酶(EphA2)、血管上皮钙黏附素(VE-cadherin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、层粘连蛋白5γ2链(LN-5γ2)等血管生成拟态相关基因的表达.结果: 缺氧条件下培养Eca-109细胞HIF-1α蛋白表达较常氧时增高, 以24-48 h为明显, 72-96h开始减弱, 而HIF-1α mRNA检测差异无统计学意义( F = 0.70, P = 0.67);RNA干扰后细胞在常氧下HIF-1α、EphA2、LN-5γ2蛋白几乎无表达, 缺氧后亦无增强现象, VE-cadherin、MMP-2蛋白表达较未干扰细胞稍有减弱, 缺氧后表达稍增强, 但差异无显著性(均P>0.05).结论: RNA干扰能抑制Eca-109细胞的HIF-1α基因表达, HIF-1α基因沉默后可以不同程度减少EphA2、LN-5γ2等血管生成拟态相关基因的表达.     

缺氧诱导因子-1α和己糖激酶-Ⅱ在食管鳞状细胞癌中的表达及对糖酵解的影响

目的 探讨人食管鳞状细胞癌中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和己糖激酶-Ⅱ(HK-Ⅱ)的表达变化及对糖酵解的影响.方法 缺氧条件(1％氧浓度)下培养TE13及Eca109细胞,设置不同缺氧时间(分别为6、12、24、48 h),并以常氧培养(20％氧浓度)为对照.Western印迹检测HIF-1α及HK-Ⅱ的蛋白表达变化;经RNA干扰技术特异性静默HIF-1α,利用实时定量PCR及Western印迹检测HIF-1α和HK-Ⅱ的表达变化;分光光度法检测常氧和缺氧条件下细胞培养液中细胞的乳酸浓度变化.结果 ①缺氧条件下,TE13及Eca109细胞中HIF-1α表达均随缺氧时间延长而逐渐升高(P＜0.05),在缺氧12 h表达达到高峰,后表达又随时间延长而下降.TE13及Eca109细胞缺氧12 h后HK-Ⅱ表达均较常氧培养明显增强(P＜0.05).②实时定量PCR法检测显示,常氧条件下被干扰的TE13/shRNA和Eca109/shRNA细胞中HIF-1α RNA表达量较未干扰的TE13、Eca109细胞明显减弱(P＜0.05).HK-ⅡRNA表达结果与HIF-1 RNA一致.③常氧及缺氧培养时,HK-Ⅱ蛋白在TE13/shRNA和Eca109/shRNA细胞的表达均较未干扰的TE13、Eca109细胞明显减弱,差异有统计学意义(P＜0.05).④缺氧时TE13和Eca109细胞乳酸分泌量为14.707±3.594和15.062±3.901,较常氧时增多(6.070±1.839和6.891±1.592,P＜0.05).TE13/shRNA、Eca109/shRNA乳酸分泌量较未静默TE13、Eca109细胞显著减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 食管鳞癌中HIF-1α及HK-Ⅱ在缺氧条件下表达明显增强,HK-Ⅱ表达及乳酸浓度与HIF-1α表达密切相关,HIF-1α可能通过HK-Ⅱ影响细胞的糖酵解水平.     

低氧诱导因子-1α对老年骨关节炎软骨细胞活性的影响

目的探讨低氧诱导因子(HIF)-1α与老年骨关节炎(OA)软骨细胞增殖和凋亡的关系。方法选择老年OA患者84例,另选健康人群80例作为对照。免疫组织化学方法检测HIF-1α、bcl-2蛋白和增殖细胞核抗原(PCNA)在OA和正常软骨细胞中的表达,分析其对OA软骨细胞增殖和凋亡的影响。结果 OA组HIF-1α阳性表达率为83.9%,明显高于正常对照组(χ2=30.312,P=0.000)。正常软骨细胞中bcl-2蛋白表达量明显高于OA软骨细胞。TUNEL法检测细胞凋亡结果显示,OA软骨组中细胞凋亡碎片明显多于正常软骨细胞,正常组软骨细胞凋亡指数为7.16±9.01,而OA组软骨细胞凋亡指数为39.7±7.23,两者差异显著(P0.05)。PCNA计数,OA组中软骨细胞增殖活性明显低于正常组。结论 HIF-1α表达与OA软骨细胞活性密切相关,可能通过调控bcl-2蛋白及PCNA影响软骨细胞的增殖与凋亡。     

5-LOX基因沉默对人胰腺癌细胞SW1990裸鼠移植瘤生长的影响

目的 观察裸鼠的人胰腺癌细胞SW1990移植瘤内注射靶向5-脂氧合酶(5-LOX)的短发夹RNA(shRNA)对移植瘤以及瘤组织5-LOX和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨其临床应用价值.方法 将胰腺癌细胞SW1990接种至裸鼠背部皮下,待移植瘤生长至100 mm3左右后随机分为shRNA1组、shRNA2组、阴性对照shNC组和脂质体组.每组6只,雌雄各半.实验组瘤内注射相应shRNA 50μg/次,1次/3 d,共7次.对照组瘤内注射脂质体液100 μl/只.每3 d测体重及移植瘤长、短径一次.第29天处死动物,取肿瘤组织,称瘤重.应用免疫组化和RT-PCR法检测移植瘤组织5-LOX、VEGF的mRNA和蛋白的表达.结果 shRNA1组、shRNA2组、shNC组和脂质体组的瘤重分别为(32.5±19.0)mg、(30.1±14.1)mg、(50.5±15.6)mg和(71.7±25.4)mg,shRNA1组、shRNA2组、shNC组抑瘤率分别为54.7%、58.0%和29.5%,shRNA1组、shRNA2组较shNC组和脂质体组相差显著(P值均＜0.05).shRNA1组和shRNA2组移植瘤的5-LOX、VEGF mRNA和蛋白的表达较shNC组和脂质体组均显著减少,但两治疗组之间未见明显差异,shNC组和脂质体组之间也无明显差异.结论 靶向5-LOX的RNA干扰治疗通过直接抑制5-LOX的表达、间接抑制VEGF的表达而抑制SW1990裸鼠移植瘤的生长.     

COPADG对食管癌裸鼠肿瘤增殖与细胞凋亡的影响及机制探讨

目的观察COPADG对食管癌裸鼠肿瘤增殖与细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法建立人食管癌Eca-109裸鼠移植瘤模型并随机分为A、B、C、D四组,分别给予生理盐水、COPADG、5-FU、COPADG＋5-FU灌胃0.2ml,1次/d,连用28 d。测量动物体质量、肿瘤质量计算抑瘤率,采用免疫细胞化学法检测肿瘤组织中的Bcl-2、Caspase-3、PCNA。结果A、B、C、D组抑瘤率分别为0、54.16%、38.78%、73.91%,早期细胞凋亡率分别为6.02%、11.47%、13.05%、21.56%,晚期细胞凋亡率分别为12.65%、20.99%、13.23%、21.6%,B、C、D组与A组比较,P均〈0.01;D组抑瘤率与B、C组比较,P均〈0.01。与A组比较,B、C、D组Bcl-2、PCNA表达明显降低,Caspase-3表达明显增加（P均〈0.01）。结论COPADG可抑制食管癌裸鼠肿瘤增殖、诱导癌细胞凋亡,该作用可能与降低Bcl-2、PCNA表达以及增加Caspase-3表达有关。     

靶向survivin基因siRNA在食管癌细胞增殖和凋亡中作用的研究

目的 研究survivin基因特异性RNA干扰对食管癌Eca-109细胞株体外增殖能力和凋亡的影响. 方法 构建靶向survivin的小干扰RNA(siRNA)表达载体,用脂质体法转染Eca-109细胞后,采用半定量RT-PCR、Western Blot检测转染前后survivin mRNA及蛋白表达水平的改变,采用噻唑兰(MTT)法检测细胞的生长增殖情况,采用流式细胞术测定细胞的凋亡情况. 结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以有效地抑制Eca-109细胞survivin基因的表达.转染靶向survivin的siRNA表达质粒可以显著抑制Eca-109细胞的增殖(细胞接种24 h、48 h后增殖抑制率分别为21.05%和33.96%),诱导明显的细胞凋亡[转染24 h、48 h后的凋亡率分别为(8.03±1.05)%和(6.22±1.06)%]. 结论 survivin基因特异性RNA干扰可以显著抑制食管癌Eca-109细胞的体外增殖并诱导明显的细胞凋亡.     

SIRT6-shRNA预处理对缺氧/复氧诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响及其机制

目的 探讨通过RNA干扰技术抑制H9C2心肌细胞内的SIRT6基因表达对缺氧/复氧(A/R)诱导的细胞损伤的影响和机制。方法 将H9C2心肌细胞随机分为正常对照组(Con组)、A/R组、阴性对照SIRT6-shRNA质粒处理组(NC组)和SIRT6-shRNA质粒处理组(shRNA组)。检测4组H9C2心肌细胞的存活率、凋亡率、Caspase-3活性及SIRT6、核因子(NF)-κBp65、I-κBα表达水平及细胞培养液中白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平并进行比较。结果 与Con组相比,A/R组H9C2心肌细胞存活率和细胞浆中I-κBα蛋白表达水平明显降低,凋亡率、细胞SIRT6-mRNA和蛋白、细胞核中NF-κBp65蛋白表达水平、细胞培养液中IL-6和TNF-α水平及Caspase-3活性明显升高（P<0.05）。与A/R组比较,shRNA组H9C2心肌细胞存活率、细胞SIRT6-mRNA和蛋白及细胞浆中I-κBα蛋白表达水平明显降低,细胞凋亡率、细胞核中NF-κBp65蛋白、细胞培养液中IL-6和TNF-α水平及Caspase-3活性明显升高(P<0.05)。结论 抑制H9C2心肌细胞内SIRT6基因表达能促进炎症因子的分泌,激活NF-κB信号通路,诱导细胞凋亡,加重A/R诱导的心肌细胞损伤。     

短发夹RNA对胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因表达的影响

目的:研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人胰腺癌细胞PANC-1中突变型K-ras基因表达的抑制作用.方法:构建特异性针对胰腺癌PANC-1细胞突变型K-ras基因的重组质粒pGensil-1-P1,阴性对照质粒pGensil-1-HK并采用脂质体介导的方法转染胰腺癌细胞.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测K-ras基因mRNA和蛋白的表达,CCK-8方法测量细胞生长曲线.并建立人胰腺癌细胞PANC-1裸鼠皮下移植瘤模型,分别注射Pgenesil-1-P1、Pgenesil-1-HK质粒,动态观察并处死裸鼠计算肿瘤体积.结果:测序证实质粒表达载体构建成功,短发夹RNA(shRNA)使胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因的mRNA较未治疗组、阴性对照组相比明显减少(P=0.01);未治疗组、阴性对照组及治疗组的K-ras蛋白表达率分别为100%,99.0%±0.73%,39.9%±2.1%,前两组K-ras蛋白表达差异无统计学意义,治疗组较未治疗组K-ras蛋白表达下调了约60.1%;细胞生长受到明显抑制(P=0.02);经重组质粒治疗14 d后,裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,相较于对照组瘤体明显缩小(P=0.03).结论:shRNA对特异性转染组的胰腺癌细胞的突变K-ras基因表达有抑制作用,使细胞以及裸鼠移植瘤的生长受到抑制.     

ALA-PDT对人食管癌Eca-109细胞相关凋亡蛋白表达的影响

目的 探讨5-氨基乙酰丙酸—光动力疗法(ALA-PDT)对人食管癌Eca-109细胞相关凋亡蛋白表达的影响.方法 将人食管癌Eca-109细胞经过培养、处理后分为两组,ALA-PDT组(PDT组)细胞用ALA孵育6h后在光动力治疗系统下进行光照,光照后24h提取细胞总蛋白和胞质蛋白;对照组细胞不进行光动力治疗.采用Western blot法检测两组细胞中的Bcl-2、Cytc蛋白表达.结果 ALA-PDT作用于人食管癌Eca-109细胞后,与对照组比较,PDT组胞质中的Bcl-2蛋白表达量明显降低,Cytc蛋白表达量明显升高(P均＜0.05).结论 线粒体凋亡通路可能是ALA-PDT诱导Eca-109细胞凋亡的主要通路,Bcl-2可能为该凋亡通路的靶基因之一,释放Cytc进而诱导细胞凋亡可能为ALA-PDT诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡的线粒体通路终末效应之一.     

静默人类真核延伸因子1A2对胰腺癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的 探讨静默人类真核延伸因子1A2(EEF1A2)对胰腺癌细胞体内生长的影响及其可能的机制.方法 建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,均分为空白组、阴性对照组、EEF1A2组,移植瘤内分别注射PBS、阴性对照siRNA和特异性EEF1A2 siRNA.测定各组移植瘤的体积和质量;应用免疫组织化学的方法检测各组移植瘤组织中EEF1A2和抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)的表达;应用TUNEL法检测各组移植瘤组织中细胞凋亡率.结果 在裸鼠移植瘤模型中,从给药后第17天开始,EEF1A2组移植瘤体积增长明显滞后于阴性对照组和空白组(P值均＜0.05).治疗结束后切取肿瘤称重,EEF1A2组肿瘤质量为(0.27±0.06)g,显著低于阴性对照组和空白组[(0.39±0.08)g和(0.43±0.07)g,P＜0.05].EEF1A2主要表达于胰腺癌细胞胞质,其中在阴性对照组和空白组中,阳性细胞分布比较密集,阳性率分别为(72.58±25.47)％和(76.75±23.19)％,而EEF1A2组阳性细胞分布较稀疏,阳性率为(34.78±21.36)％,差异有统计学意义(P＜0.01).EEF1A2组的PCNA蛋白表达也显著低于空白组和阴性对照组(P＜0.01),而原位末端转移酶标记技术(TUNEL)的结果显示EEF1A2组中细胞凋亡率高于空白组和阴性对照组(P＜0.01).结论 EEF1A2在体内能被有效静默,EEF1A2静默后能明显抑制胰腺癌细胞的生长,可能与其抑制细胞增殖和促进细胞凋亡有关.     

氯化钴对RNA干扰食管鳞癌细胞HIF-1α基因表达及功能的影响

目的研究氯化钴模拟缺氧对RNA干扰的缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因表达及功能的影响，观察在人食管鳞癌细胞系Eca-109中RNA干扰抑制HIF-1α的效果。方法选择4组细胞分别为食管癌Eca-109细胞和3株稳定转染HIF-1αSiRNA的Eca-109细胞（本实验室编号分别为H2／14号、H3／15号、H2／20号细胞），分别用200、400、600、800μmol／L氯化钴模拟缺氧，缺氧培养时间分别为12、24．48、72h，采用Western印迹和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HIF—1α蛋白及mRNA表达，同时Western印迹检测血红素加氧酶（HO-1）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、葡萄糖转运体-1（Glut-1）、P53等相关基因的表达。结果4组细胞HIF-1α蛋白表达均随氯化钴浓度加大而增加，常氧与400μmol／L氯化钴处理24h后筛选出H3／15号细胞HIF-1α蛋白表达最少，与其它3组相比差异有统计学意义（P〈0．05），mRNA检测差异无统计学意义；干扰细胞常氧下HO-1、MMP-2、Glut-1、P53表达不同程度减少，缺氧后HO-1、P53表达增加，MMP-2、Glut-1表达无明显变化。结论RNA干扰能抑制Eca-109细胞的HIF-1α基因表达，从而不同程度减少HO-1、MMP-2、Glut-1、P53等相关基因表达；经氯化钴模拟缺氧筛选出干扰效果较好的一株细胞，为进一步研究HIF-1α的功能奠定了基础。     

应用氟尿嘧啶口服新剂型S-1节拍性化学治疗抑制裸鼠LCI-D20原位移植瘤的血管形成

目的 探讨应用氟尿嘧啶口服新剂型S-1(替加氟、吉美嘧啶.奥替拉西按物质的量1.0:0.4:1.0构成)节拍性化学治疗抑制人高转移肝癌LCI-D20模型血管形成的作用. 方法采用治疗剂量及节拍性剂量的氟尿嘧啶口服新剂型S-1治疗30只LCI-D20模型裸鼠,分为对照组及实验A、B、C、D组.用药28 d后处死裸鼠,收集并记录肝脏、腹腔及肺的肉眼可见瘤灶,称取瘤总质量即为该裸鼠的肿瘤负荷;以鼠抗-CD34(1:50)为第一抗体,EnVision(rat)为第二抗体进行免疫组织化学染色,以肿瘤区内染成棕褐色单个内皮细胞或内皮细胞簇作为一个微血管计算,在高倍显微镜下(×400)随机计数5个视野,取平均数作为其微血管密度值-流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡.逆转录聚合酶链反应检测肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板反应蛋白-1(TSP-1)的表达.实验数据比较采用完全随机方差分析.结果 对照组及实验A、B、C、D组裸鼠瘤质量分别为(2.01±0.29)g、(0.38±0.19)g、(1.12±0.27)g、(1.38±0.33)g、(2.27±0.58)g,差异有统计学意义(F=26.36,P＜0.01);微血管密度分别为39.57±2.50、19.90±2.59、5.93±3.33,17.10±2.32、29.53±2.91,差异有统计学意义(F=43.61,P＜0.01);肿瘤组织细胞凋亡率分别为4.08%±3.20%、44.37%±2.34%、31.73%±2.52%、19.83%±0.33%、8.25%±0.57%,差异有统计学意义(F=76.76,P＜0.01).VEGFmRNA和bFGF mRNA的表达,对照组最高,A组略低,C、D组次之,B组最低;TSP-1 mRNA的表达,B组最高,C、D组略低,A组次之,对照组最低.结论 氟尿嘧啶口服新剂型S-1对肝癌LCI-D20模型有明显抑制作用;节拍性应用氟尿嘧啶口服新剂型S-1抑制肿瘤血管形成的作用明显,对肿瘤细胞的凋亡有明显促进作用,对肿瘤组织VEGF、bFGF,TSP-1的表达有调节作用.     

雌激素对肿瘤坏死因子诱导的内皮细胞凋亡的影响

目的 观察17β-雌二醇(E2)及肿瘤坏死因子(TNFα)对培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响.方法 将HUVEC分为4组,空白对照组、TNFα(40 μg/L)组、TNFα(40 μg/L)加E2(1 μmol/L)和E2(10 μmol/L)组,各组细胞经维持液培养48 h使细胞生长同步,加入相应药物培养24 h后收获细胞.采用免疫组化方法测定bcl-2蛋白表达及流式细胞仪测定细胞凋亡发生百分率.结果 TNFα诱导的细胞凋亡发生率较正常对照组明显增多(P＜0.001),bcl-2蛋白表达少,DNA直方图上可见高大的凋亡峰,而雌激素干预后凋亡发生率明显降低(P＜0.001),bcl-2蛋白表达增加.结论 E2可增加bcl-2蛋白的表达,抑制TNFα诱导的人内皮细胞细胞凋亡的发生率,维持内皮细胞结构和功能的完整,可能为其抗动脉粥样硬化的机制之一.     

缺氧诱导因子-1α对SD大鼠心室肌细胞缺血再灌注损伤的短暂保护作用

目的探讨缺氧诱导因子(HIF)-1α在SD大鼠心室肌细胞在缺血再灌注损伤(IRI)过程中的作用。方法原代培养心室肌细胞,继而用脂质体转染pc DNA3.1-full length HIF-1α和空载至心室肌细胞;建立体外心肌细胞IRI模型;分成处理后培养6 h和5 d两个检测体系;MTT法检测细胞活性,Western印迹和免疫细胞化学法检测相关蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果心室肌细胞缺血再灌注(IR)后细胞活性下降,凋亡率上调。在转染pc DNA3.1-full length HIF-1α质粒后,细胞活性明显增加,bcl-2和血管内皮生长因子(VEGF)表达上调,凋亡受到抑制;转染pc DNA3.1-full length HIF-1α组培养5 d后虽然HIF-1α仍高表达,但VEGF和bcl-2表达量下降,细胞活性下降,凋亡率升高。结论大鼠心室肌细胞IR后活性下降,凋亡增加;短时间内HIF-1α可在一定程度上保护细胞,增强细胞活性,抑制凋亡;但长期作用后,HIF-1α对IRI的心肌细胞并未起到保护作用。