携带白蛋白启动子和IDO基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带小鼠白蛋白启动子和IDO基因的重组腺病毒载体,研究肝脏Hepa l石细胞的IDO基因mRNA及蛋白表达情况.方法 酶切含有小鼠全长IDO cDNA的IDO质粒,亚克隆至穿梭载体pAdTrack.ALB上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,生成并筛选阳性克隆,测序、鉴定正确后,转染AD-293细胞进行包装、扩增,检测病毒滴度,RT-PCR和荧光显微镜鉴定重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达.重组腺病毒进一步感染Hepa 1-6细胞,RT-PCR和WesternBlot法分别检测IDO基因在细胞内表达情况.结果 经酶切及测序证实携带白蛋白启动子和IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,病毒感染滴度为2.9×10~6pfu/ml.感染Hepa 1-6细胞后,RT-PCR和Western Blot可以检测到IDO mRNA水平和蛋白水平表达.结论 构建了携带白蛋白启动子和IDO基因的重组腺病毒载体.     

hVEGF165基因转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建携带hVEGF165基因的重组腺病毒载体pAdxsi-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-hVEGF165,体外转染大鼠BMSCs,观察转染后hVEGF165的表达情况以及对BMSCs生长增殖的影响,为进行血管再生的基因治疗奠定实验基础。方法将hVEGF165从原始质粒切下连接到pShuttle-巨细胞病毒-EGFP重组穿梭载体,并转移至pAdxsi载体上,获得重组腺病毒载体质粒pAdxsi-EGFP-hVEGF165,进行酶切鉴定及基因测序。采用PacI限制性内切酶线性化pAdxsi-EGFP-hVEGF165,并转染人胚肾细胞HEK293,收获重组腺病毒,测定病毒滴度。贴壁法培养Wistar大鼠BMSCs,体外转染携带EGFP基因的重组腺病毒(pAdxsi-EGFP),荧光倒置相差显微镜及流式细胞术确定最佳病毒感染复数(multiplicities of infection,MOI)。依据最佳MOI转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165至BMSCs,采用Western blot、RT-PCR及ELISA法检测转染后hVEGF165的表达;MTT法评价转染后BMSCs生长增殖情况。结果酶切鉴定及基因测序提示重组腺病毒载体质粒含有hVEGF165 cDNA;经多轮感染、扩增后,病毒滴度可达1×1010 pfu/mL。荧光倒置相差显微镜观察转染pAdxsi-EGFP后MOI为150 pfu/cell时转染效果最佳,流式细胞仪检测转染效率约88%。Western blot和RT-PCR检测示,pAdxsi-EGFP-hVEGF165转染BMSCs 48 h后在蛋白质和基因水平均可有效表达hVEGF165;ELISA检测示其含量在7 d达高峰,在20 d时仍有表达,1、3、5、7、9、11、13、15、20 d各时间点hVEGF165含量均显著高于EGFP基因转染组及未转染组(P<0.05)。MTT结果显示,各时间点转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165的BMSCs与未转染组细胞的吸光度(A)值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMSCs是一种较理想的基因载体细胞,成功制备的重组腺病毒载体质粒可在MOI值为150时将hVEGF165基因有效转染至BMSCs;转染后hVEGF165表达水平较高、持续时间较长,且对BMSCs的生长增殖无明显影响。     

ADV-tk重组腺病毒的构建及检测

目的应用基因重组技术,构建含胸苷激酶（tk）自杀基因的复制缺陷型腺病毒（ADV-tk）,为进一步研究tk自杀基因对肿瘤的抑制作用奠定基础。方法采用细胞内同源重组法构建携带tk基因的ADV-tk,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定。重组腺病毒ADV-tk体外转染人肝癌SMMC-7721细胞,RT-PCR检测tk基因的整合和表达。建立裸鼠人肝癌动物模型,腹腔注射ADV-tk,荧光显微技术观察ADV-tk基因在肝脏的转染情况和对肿瘤细胞的抑制作用。结果构建的重组腺病毒中带有tk基因,经扩增、纯化后测得重组腺病毒滴度为1.4&#215;10^10pfu/ml。ADV-tk体外转染SMMC-7721细胞后,RT-PCR检测显示tk基因在细胞中整合并且有效表达。体内检测结果发现ADV-tk在肝脏有明显转染,肿瘤组织中凋亡细胞明显增多。结论本研究构建的携带tk基因的复制缺陷型腺病毒获得成功,可用于下一步研究。     

转化生长因子β3基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的构建转化生长因子β3（transforming growth factor β3，TGF-β3）的腺病毒载体，并通过腺病毒载体将TGF-β3基因转染骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs），使其在细胞内得到表达。方法将人TGF-β3质粒定向克隆进入穿梭质粒pAdTrack—CMV中，与pAdEasy-1共同转入细菌并重组，获得TGF-β3重组腺病毒质粒，用脂质体法导入包装细胞HEK293中，48～96h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。取1月龄新西兰大白兔5只，取其胫骨骨髓。采用密度梯度离心法分离纯化MSCs，并进行传代。取传至第3代细胞采用TGF-β3腺病毒载体转染，10h后荧光显微镜观察绿色荧光表达，转染TGF-β3重组腺病毒4d后的MSCs用免疫细胞化学方法观察TGF-β3在细胞内的表达。结果pAdEasy—TGF-β3转染HEK293细胞48～96h后，荧光显微镜可见明显的绿色荧光表达。兔骨髓分离培养10d后，培养MSCs融合达70％～80％、贴壁紧密，细胞形态均一，似成纤维细胞；14d完成原代细胞培养。TGF-β3重组腺病毒转染MSCs17h后，荧光显微镜下出现少量绿色荧光，48～72h荧光加强，荧光与MSCs轮廓一致。免疫细胞化学观察，转染TGF-β3重组腺病毒MSCs胞浆内有棕黄色阳性颗粒表达。结论TGF-β3基因重组腺病毒载体的成功构建并在MSCs内的表达，为创伤愈合的基因治疗提供了研究基础。     

大鼠VEGF腺病毒基因转染系统的构建及鉴定

目的:探讨构建携带大鼠血管内皮细胞生长因子(VEGF)的重组腺病毒载体方法，为后续的基因转染研究作准备。方法:采用RT-PCR扩增的方法获取鼠源性的VEGF,并克隆入穿梭质粒pDC316。构建的质粒pDC316-VEGF经酶切及测序鉴定正确后，通过lipofectamine2000的介导与腺病毒包装质粒pBHGE3共转染至人胚肾细胞HEK293，经同源重组后获得携带鼠VEGF的重组腺病毒VDC316-VEGF。应用PCR鉴定重组腺病毒，空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒。以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度。结果:PCR鉴定证实重组腺病毒含有鼠VEGF,病毒滴度为3×109pfu/mL。结论:成功构建的携带大鼠VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,可作为后续基因治疗研究工作中可靠的基因转染工具。     

携带人VEGF_(165)和ANG-1双基因的腺病毒载体的构建及目的基因的表达

[目的]构建并鉴定携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA。[方法]采用基因克隆技术克隆目的基因VEGF165、ANG-1基因,将得到的基因通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pTrack-CMV中,构建携带双基因的腺病毒穿梭载体pTrack-CMV-VIA。进而使用AdEasyTM腺病毒系统重组并包装腺病毒。通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测制备的腺病毒pAd-VIA感染的大鼠骨髓基质干细胞中外源基因VEGF165及Ang-1的表达。[结果]该重组腺病毒质粒经测序、酶切鉴定,证明基因序列正确。转染QBI-293A细胞后,可观察到GFP明显表达。重组合腺病毒载体pAd-VIA获得成功包装,扩增后病毒滴度为2×1010PFU/ml,大鼠骨髓基质干细胞转染48 h后,绿色荧光蛋白表达阳性,ELISA结果显示转染组在感染48 h后,培养细胞上清中的VEGF165浓度为(42.5±2.082)ng/105细胞,ANG-1浓度为(16.67±2.08)ng/105细胞,未转染组几乎未检测到外源基因的表达,有统计学差异(P0.05)。[结论]成功构建携带人VEGF165、ANG-1双基因共表达重组腺病毒载体,为组织工程人工骨血管化的研究奠定基础。     

腺病毒载体介导SCL基因转染Cajal间质细胞及其表达

目的 构建含有人干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因的重组腺病毒载体,并观察其对Cajal间质细胞的转染及其介导的SCL基因的表达.为下一步在体转染Cajal间质细胞,观察其对Cajal间质细胞表型逆转的影响奠定基础.方法 利用Ad-Easy系统、细菌内同源重组法快速构建重组腺病毒Ad-GFP/SCL.通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对培养的Cajal间质细胞的转染效率.通过RT-PCR法分析转染Cajal间质细胞后SCL mRNA的表达.结果 酶切鉴定及PCR结果证明成功构建了含有人SCL基因的重组腺病毒,病毒滴度为1.6×1011 pfu/ml;对Cajal间质细胞的转染率高达100%;RT-PCR法检测转染Cajal间质细胞后SCL mRNA有表达.结论 成功构建的含人SCL基因的重组腺病毒对Cajal间质细胞有很强的转染能力,可介导SCL基因在Cajal间质细胞中表达.     

人TGF-β1基因腺病毒载体的构建及对骨髓基质干细胞的定向诱导分化作用

目的构建人转化生长因子β1(TGF-β1)基因腺病毒真核表达载体,并观察感染骨髓基质干细胞(MSCs)后目的基因的表达和对细胞生物学行为的影响。方法以复制缺陷的腺病毒Adeno-X为基因载体,制备携带TGF-β1基因的高滴度腺病毒液感染人MSCs,通过免疫细胞化学、原位杂交、己糖醛酸水平检测及甲苯胺蓝染色等方法鉴定外源基因的表达,分析TGF-β1基因转染对MSCs定向软骨分化的调控机制。结果腺病毒感染MSCs后免疫细胞化学染色证实外源基因编码蛋白的表达,通过原位杂交检测出Ⅱ型胶原蛋白基因mRNA,细胞培养液中己糖醛酸水平明显升高。结论成功构建人TGF-β1基因腺病毒表达载体,证实其在MSCs中的表达和具有向软骨细胞定向分化的诱导作用,为软骨缺损修复的局部基因治疗奠定实验基础。     

重组小鼠神经生长因子前导肽和人β-内啡肽融合基因非增殖型腺病毒的构建和鉴定

目的 构建并鉴定携带小鼠神经生长因子前导肽(PN)和人β-内啡肽(β-EP)融合基因非增殖型腺病毒(Ad-NEP)。方法 取出生2周、雄性昆明小鼠的颌下腺组织，逆转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增得到 PN 上游部分序列，全基因合成 PN 下游部分和人β-EP 序列并将其与 PN 上游部分连接成融合基因并测序。采用 AdEasyTM System 细菌内重组的方法构建携带小鼠 PN 和人β-EP 融合基因非增殖型腺病毒，PCR 鉴定后扩增不含野毒的阳性克隆并纯化，采用50%组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度；体外转染入皮肤癌上皮(A431)细胞，3d 后 RT-PCR 观察融合基因的转录，免疫组化法检测细胞内β-EP 的表达，放射免疫法检测感染后1、3、7d 时培养基内β-EP 的浓度。结果 融合基因序列正确，PCR 可检测到475bp 的融合基因条带并排除野病毒株，腺病毒 Ad-NEP 滴度为1.5×10~10pfu/ml。A431细胞转染病毒后3d RT-PCR 可以检测到475bp 大小的融合基因片段，免疫组化染色后细胞内出现橙黄色浓染颗粒，Ad-NEP 组感染后1、3、7d 时细胞培养基内人β-EP 浓度高于对照组(P<0.01)，感染后3、7d Ad-NEP 组β-EP 浓度比感染后1d 高(P<0.05或0.01)。结论 成功构建能在体外培养的非神经内分泌细胞内外高效转基因表达人β-EP 的重组腺病毒。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2基因重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2(BMP2)基因重组腺病毒并在293E细胞中扩增制备重组病毒。方法自人骨形成蛋白2真核表达载体pcDNA3-hBMP2中酶切出hBMP2基因，插入pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV—hBMP2，经酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化重组质粒并转染293E细胞包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清感染293细胞，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体，为进一步研究rBMP2基因治疗奠定了基础。     

骨形成蛋白7重组腺病毒的构建及转染骨髓间充质干细胞的研究

目的 构建骨形成蛋白(BMP)7重组腺病毒，使其转染骨髓间充质干细胞并在细胞内得到表达。方法 将BMP7基因克隆到转移载体pAdTrack—CMV中，在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组，得到BMP7重组腺病毒基因组，通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMP7重组腺病毒转染分离纯化后的骨髓间充质干细胞，鉴定BMP7在细胞内的表达。结果 经过多聚酶链反应(PCR)及酶切鉴定证明获得了BMP7转移质粒padTrack—BMP7和BMP7重组腺病毒基因组，并包装出重组腺病毒。逆转录PCR和免疫组织化学证明BMP7在重组腺病毒转染后的骨髓间充质干细胞中得到了表达。结论 BMP7重组腺病毒的构建和在骨髓间充质干细胞中的表达，为BMP7基因治疗的研究奠定了基础。     

猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

大鼠ETFβ基因过表达对NADPH氧化酶基因表达的影响

目的:构建大鼠ETFβ的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达和对NADPH氧化酶的影响。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码ETFβ的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定后测序,测序正确后用磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,使用RT-PCR方法检测空载体组和重组质粒转染组的NADPH氧化酶各亚基mRNA水平的表达变化。结果:(1)测序结果证实PCR扩增得到编码ETFβ的cDNA序列正确;(2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,ETFβ融合蛋白成功表达;(3)RT-PCR结果显示重组质粒转染组的NADPH氧化酶5个亚基中的NOX3,NOX4的mRNA表达降低(P<0.05),空载体组和重组质粒转染组之间比较NOX1,NOX2,NOX5的mRNA表达差异无统计学意义。结论:成功构建大鼠ETFβ的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达,并且降低了NADPH氧化酶NOX3,NOX4的mRNA表达水平。     

人胚肾细胞SGLT2基因异源表达体系的构建

目的 构建钠依赖的葡萄糖转运蛋白2（SGLT2）基因异源表达体系,为探讨突变引起SGLT2蛋白功能及表达异常的分子机制提供实验依据。 方法 利用RT-PCR法从人肾组织中获得SGLT2基因,将该基因克隆到真核表达载体PEXL-GFP（绿色荧光蛋白）中,将携带有SGLT2基因的PEXL载体转染人胚肾细胞系（HEK293细胞）,获得目的蛋白的瞬时表达。应用Western印迹及激光共聚焦显微镜检测融合蛋白在HEK293细胞的表达和分布,并通过摄取实验进一步验证SGLT2蛋白的转运功能。 结果 SGLT2-GFP蛋白可在HEK293细胞表达,激光共聚焦显微镜观察发现,SGLT2-GFP蛋白在细胞膜上呈点状分布,并且与细胞膜标记物（DiI）有良好的共定位,转染SGLT2-GFP质粒的HEK293细胞的转运活性较对照组（未转染及转染空质粒细胞组）强约3.5倍（P < 0.01）。 结论 成功构建了SGLT2真核表达载体,为探讨SGLT2基因表达、功能及SGLT2突变在家族性肾性糖尿发病的遗传机制提供了重要的依据。     

人血管内皮细胞生长因子腺病毒表达系统的构建及体外表达

目的　构建人VEGF12 1腺病毒表达载体 ,探讨应用血管内皮细胞生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因治疗骨科缺血性疾患的可行性。　方法　采用分子克隆技术 ,从pCDI/VEGF12 1质粒获得hVEGF12 1cDNA ,经穿梭质粒pShuttle克隆到腺病毒质粒上 ,构成Adeno VEGF12 1腺病毒重组质粒 ,经酶切及测序鉴定正确后 ,包装成为重组Adeno VEGF12 1腺病毒 ,并进行电镜观察及滴度测定。用病毒感染小鼠骨髓基质细胞 ,用逆转录PCR方法检测VEGF12 1基因在骨髓基质细胞中的转录 ,用免疫印迹及免疫组化方法检测VEGF蛋白的表达。　结果　经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功 ,电镜显示包装细胞中有病毒存在 ,包装的病毒滴度为 8× 10 10 pfu/ml,RT PCR证实有VEGF12 1mRNA的转录 ,免疫印迹及免疫组化检测有VEGF12 1蛋白的表达 ,而对照未见VEGF12 1转录和表达。　结论　构建的VEGF12 1腺病毒表达载体可在体外表达 ,VEGF基因治疗有可能用于骨科缺血性疾患     

转染人β干扰素基因的骨髓间充质干细胞治疗大鼠颅内胶质瘤

目的 观察转染人β干扰素基因(hIFN-β)的骨髓间充质干细胞(MSCs-hIFN-β)治疗大鼠颅内恶性胶质瘤的作用.方法 重组腺病毒介导hIFN-β基因转染的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs-hIFN-β)和C6胶质瘤细胞体外共培养,噻唑蓝(MTT)比色法检测C6细胞活力,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养液上清hIFN-β含量;制作SD大鼠颅内胶质瘤模型,并用MRI和组织病理学检查予以证实;MSCs-hIFN-β瘤内注射观察荷瘤鼠的临床表现和生存时间,MRI检查肿瘤的大小,并行大鼠C6胶质瘤组织病理学检查和肿瘤组织hIFN-β免疫组织化学染色.结果 体外共培养发现C6细胞的生长被不同程度地抑制,C6细胞培养上清hIFN-β的含量随着MSCs-hIFN-β的密度增加,其含量也增加;体内实验发现MSCs-hIFN-β、MSCs、生理盐水瘤内注射治疗10 d后肿瘤平均体积分别为(8.43±1.32)、(35.84±2.36)、(37.26±2.91)mm3,治疗组和对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);治疗组较对照组生存期明显延长(P＜0.01).结论 MSCs-hIFN-β能抑制胶质瘤细胞的增殖,延长颅内荷瘤鼠的生存期.     

抑瘤细胞运动和侵袭的鼠FRNK重组腺病毒的构建

目的应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建小鼠FRNK基因重组腺病毒，并在293HEK细胞中扩增制备重组病毒。方法把小鼠FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack—CMV中，构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV-FRNK，经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后，采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中，通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到293HEK细胞进行包装，获得FRNK重组腺病毒pAdFRNK。荧光显微镜下观察绿荧光的表达。结果经酶切和绿荧光表达证明了小鼠FRNK基因的重组腺病毒载体pAdFRNK构建成功，并制备出高滴度的重组病毒。结论成功构建携带小鼠FRNK基因的重组腺病毒pAdFRNK，为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

神经生长因子基因转染间充质干细胞移植对损伤脊髓保护的实验研究

目的 探讨神经生长因子(NGF)基因转染间充质干细胞(MSCs)移植对损伤脊髓的保护作用.方法 近交系Wistar大鼠(n=56),随机分为治疗组、空白组、对照组,采用改良的Allen打击法造成脊髓损伤(SCI)的模型;分离培养同种异体MSCs,纯化、扩增后,MSCs经绿色荧光蛋白(GFP)标记并被NGF基因转染后重新悬垂(1×108/ml)于SCI 7 d后移植入受损硬脊膜下.对照组注射等量的磷酸盐缓冲液(PBS),分别在MSCs移植后24 h和1、2周后取损伤脊髓段冰冻切片,.在荧光显微镜下观测移植细胞的分布情况;观测MSCs移植后胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和NGF表达的变化;进行神经功能(BBB)评价. 结果 MSCs移植后可向损伤脊髓中心聚集,SCI后.治疗组GFAP和NGF的表达明显高于对照组(P<0.05);BBB评分显示治疗组和对照组神经功能差异有统计学意义. 结论 NGF基因转染的MSCs移植促进了脊髓神经功能的恢复,移植后具有一定的分布规律.     

rAAV2-hTGF-β1转染犬MSCs诱导分化为软骨细胞的研究

目的 探讨rAAV2-hTGF-β1体外转染犬MSCs定向分化为软骨细胞的可行性.方法 应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬MSCs,倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态,流式细胞技术鉴定其表面标记物.取第三代MSCs,分别以感染复数(MOI)为1×105病毒基因数/细胞v.g./cell)、5×105v.g./cell的rAAV2-hTGF-β1进行转染.培养后定期取各组细胞进行相关检测.Western blot检测hTGF-β1的表达,ELISA法测定hTGF-β1的含量,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA的表达,免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达.结果 原代及传代培养的MSCs呈梭形外观,具有较强的增殖能力.细胞表面抗原CD29、CD44、CD105表达阳性,CD34、CD45表达阴性.rAAV2-hTGF-β1转染MSCs后,Western blot法检测到目的 蛋白hTGF-β1稳定表达:ELISA法检测转染组MSCs培养上清液中的hTGF-β1表达,且随时间的延长,各组hTGF-β1浓度逐渐增加,MOI 5×105组表达量明显高于MOI 1×105组(P<0.01);RT-PCR检测到各转染组Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA表达,免疫细胞化学法检测转染组细胞Ⅱ型胶原呈阳性表达,且高MOI值组表达强度明显高于低MOI值组.结论 rAAV2-hTGF-β1转染犬MSCs后可定向分化为软骨细胞,作为软骨组织工程的种子细胞是可行的.