乙型肝炎病毒S基因四环素调控体系的构建及其在真核细胞中的表达

目的:构建乙型肝炎病毒S基因的四环素调控表达载体,并研究在真核细胞中四环素对S基因的调控表达,以期用于基因治疗实验.方法:将乙型肝炎病毒S基因插入启动子内含有2个四环素超纵子(TO)的质粒pcDNA4,并用脂质体将重组质粒pcDNA4-S和含有四环素抑制基因的质粒pcDNA6共转染入真核细胞HepG2中,用Zeocin(400μg/ml)及Blasticidin(10μg/ml)进行抗性筛选,约20天形成抗性克隆,建立在四环素诱导下能稳定表达S基因的细胞系.以不同浓度的四环素(0.5μg/ml,1.0μg/ml,2.0μg/ml,3.0μg/ml)进行诱导,用微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测S抗原的表达,以确定四环素的最佳浓度.结果:转染了重组质粒的HepG2细胞,在无四环素环境下HBsAg表达量很低,当加入不同浓度的四环素诱导后,HBsAg表达量明显增加,但所测HBsAg的S/N值无明显差异.结论:成功构建了乙型肝炎病毒S基因四环素调控表达载体,并在真核细胞中进行了四环素的调控表达.     

四环素双表达调控表达载体的构建、鉴定

目的：构建在同一载体中可用四环素调控表达目的基因的载体。方法：以pcDNA4^TM/TO为模板,用PCR法扩增含四环素调控表达序列的片段TO（位于NdeⅠ和SacⅡ之间）,插入pUC118载体中测序,选择测序正确的序列取代pVITRO3载体中相应的片段,构建成pVITRO3-TO。用相同的方法以pcDNA6/TR为模板扩增四环素阻遏蛋白基因（TR）,经测序证实后插入pVITRO3-TO载体的一个多克隆位点。结果：用PCR成功扩增出四环素调控表达序列片段和四环素阻遏蛋白基因片段,亚克隆后各选2个克隆测序,均找到了序列正确的克隆,经内切酶双切后插入pVITRO3中,完成了目的载体的构建。结论：初步构建了四环素双表达调控表达载体（pVITRO3-TO-TR）。     

细胞分裂调控基因MAD2与GFP融合的真核表达质粒的构建及表达

目的：构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中表达.方法：通过RT-PCR扩增,获得MAD2基因的完整序列.将此片断插入pEGFP-N1载体多克隆位点区,构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒.应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察表达的绿色荧光.结果：成功构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.结论：该载体的成功构建,为研究MAD2基因在细胞分裂中的功能及定位建立了有效的观察体系.     

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

人hepcidin真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建人hepcidin全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达hepcidin的HepG2细胞系,以应用于拮抗hepcidin从而增强铁吸收的活性药物筛选.方法 化学合成结合PCR拼接hepcidin 全长结构基因,插入原核表达载体pMD18-T中,测序正确后再经HindⅢ与EcoRⅠ双酶切,定向插入真核表达载体pcDNA3.0内,酶切鉴定后,采用脂质体转染法将重组质粒转染人HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,ELISA检测转染细胞hepcidin的蛋白表达.结果 经酶切鉴定,成功构建hepcidin真核表达载体pcDNA3-hepcidin;重组质粒转染HepG2,经G418筛选3周获得抗性细胞克隆,其hepcidin蛋白表达量为普通HepG2细胞表达量的3倍.结论 成功构建了稳定高表达hepcidin的HepG2细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究hepcidin降低肠道铁吸收的分子机制以及筛选拮抗hepcidin作用的活性药物奠定了实验基础.     

四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达

目的：构建调控β-半乳糖苷酶（β-gal）基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法：根据2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI 3130 测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2 PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因（TR）的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4 d后,给予强力霉素（4 mg•L^-1）,利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果：构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞 内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞内表达受到抑制。结论：成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。     

HCV 5′UTR调控GFP真核表达质粒的构建及表达

目的构建丙型肝炎病毒5′非翻译区（HCV 5′UTR）调控绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在HepG2细胞中表达。方法通过PCR扩增，获得HCV基因组HCV 5′UTR完整序列及C区序列的部分基因片断。将此片断插入pEGFP-NI载体多克隆位点区，构建受HCV 5′UTR调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒．应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察荧光。结果成功构建受HCV 5′UTR调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达。结论该载体的成功构建，可以用于直观地评价针对HCV 5′UTR的基因药物的效果。     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

顺式串联双拷贝DuIFN一γ基因的真核表达

目的:以鸭γ-干扰素(DuIFN-γ)基因为目的基因,研究同一启动子调控下,不同拷贝数的目的基因的表达状况.方法:采用基因重组技术构建含DuIFN-γcDNA单拷贝和双拷贝重组质粒并转入真核细胞COS-7中进行表达.DuIFN-γ活性采用Griess试剂检测.结果:双拷贝重组质粒和单拷贝重组质粒50%最大活性稀释度分别为1:320和1:160.双拷贝重组质粒转染上清稀释10240倍后,仍保留DuIFN-γ活性,而单拷贝重组质粒转染上清经1280倍稀释后,即丧失活性.结论:在同一启动子作用下,顺式插入双拷贝目的基因可明显增强目的基因在真核细胞中的表达量.     

广范围高效的植物乙型肝炎病毒表面抗原表达载体构建及鉴定

目的构建含乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因的植物双元表达载体。方法采用高保真PCR方法从T—adr质粒扩出HBsAg基因，定向克隆到中间载体pUC18-DHA，经测序证实核酸序列正确后，再亚克隆到植物双元表达载体pGreen0029-GFP上，采用电击法将含HBsAg的植物表达载体转入根癌农杆菌中，并进行酶切证实。结果扩增的HBsAg片断亚克隆到中间载体，得到pUC18-HBsAg—DHA，测序证实HBsAg核酸序列正确，再与根癌农杆菌双元载体pGreen0029-GFP连接，获得含HBsAg基因的植物双元表达载体pGreen0029-HBsAg—DHA，转入根癌农杆菌，酶切证实正确。结论采用正确技术路线，构建了含HBsAg基因的植物表达载体，为下一步的转基因植物表达研究奠定了基础。     

HBsAg和B19 VP2复合抗原的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的构建乙肝表面抗原(HBsAg)-人微小病毒B19VP2蛋白的原核高效表达系统.方法用PCR扩增HBsAg基因及B19病毒VP2基因,分别与pGEM-T重组,构建出pGEM-T-HBs及pGEM-T-VP2并测序分析;测序证实序列正确后,将pGEM-T-HBs中的HBs基因克隆入pGEX-5X-1表达载体中,得到pGEX-5X-1-HBs;再将pGEM-T-VP2中的VP2基因克隆入pGEX-5X-1-HBs中,得到pGEX-5X-1-HBs-VP2后转化至BL21(DE3)宿主菌中,并以IPTG诱导表达融合蛋白,以Western-blot鉴定.结果pGEX-5X-1-HBs-VP2可在大肠杆菌BL21中高效表达,表达产物经Western-blot鉴定具有HBsAg及B19 VP2的双重抗原性.结论成功构建pGEX-5X-1-HBs-VP2原核表达载体,且其表达的重组蛋白具有良好的抗原性,为HBV和B19病毒重组多价疫苗的研究奠定了基础.     

血管内皮生长因子重组DNA的构建及体外表达

目的:以质粒PCNDA3.0为载体,研究血管内皮生长因子(VEGF)目的基因在体外真核细胞中的表达.方法:将编码人可溶性VEGF165的目的基因克隆于带有CMV启动子/增强子的PCNDA3.0载体上,重组为PCNDA3.0-VEGF165质粒载体.直接以质粒DNA形式应用脂质体介导的方法转染人脐静脉内皮细胞ECV304,收取细胞上清,用ELISA和Western blot方法检测上清中VEGF165可溶性表达产物.结果:VEGF165基因在CMV启动子/增强子的调控下,可在ECV304细胞高效表达,且在转染后72 h表达量明显高于转染后48 h的表达.结论:以质粒PCNDA3.0为载体,VEGF165基因可以在体外真核细胞中表达,为治疗缺血性疾病提供一个新的基因治疗途径.     

人端粒酶逆转录酶基因启动子调控表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因启动子调控的荧光素酶基因表达载体。方法:用巢式PCR方法克隆hTERT序列长约1100bp的启动子片段,经测序无误后将其插入荧光素酶基因报告载体中,构建pGL3-hTERTp重组质粒,转化JM190细菌得到大量含有hTERT启动子的荧光素酶重组质粒。用双酶切和PCR法鉴定重组质粒,并送测序鉴定。结果:经过酶切和PCR法鉴定成功地构建了携带hTERT启动子的重组荧光素酶基因报告载体。结论:成功获得由hTERT启动子调控的荧光素酶基因表达载体,为研究As₂O₃对HL-60细胞端粒酶作用的分子机制打下基础。     

HCV结构基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-S的构建、鉴定及表达

目的：构建能表达HCV结构基因（C＋E1＋E2）的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCV结构基因的腺病毒载体做准备,方法：用分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的HCV结构基因上、下游引物,以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/BCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV结构基因片段,基因片段回收后,以BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd.CMV-Link.1中CMV启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-S.通过BglⅡ／HindⅢ双酶切、PCV及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定。以抗HCVC单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-S在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd.HCV-S插入片段为HCVCE1＋E2区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论：构建的质粒pAd.HCV-S 可以表达HCV结构基因,为包装表达HCV结构基因的腺病毒载体奠定了基础。     

胰岛素基因在非β细胞中的调节表达

目的　应用四环素 (Tet)可调控性表达系统 ,建立条件控制性人工 β细胞株 ,定量调节胰岛素基因在tet2 93细胞中的表达。方法　构建含四环素反应元件和表达胰岛素原基因的重组载体pTRE2mINS。再将此载体与具有潮霉素抗性的质粒pTK Hyg共转染能稳定表达反义四环素激活因子的细胞株tet2 93,然后用潮霉素筛选表达胰岛素的细胞株 ,通过四环素的衍生物强力霉素 (Dox)调节胰岛素在此细胞株中的表达。采用Northern印迹、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和放射免疫分析法 ,从mRNA和蛋白水平观察细胞培养基中强力霉素浓度的变化对胰岛素基因表达的影响。结果　从2 8个单克隆细胞株中筛选 1株能自主分泌一定量的胰岛素 ,又能受强力霉素调控分泌的细胞株。当细胞培养液中加入或不加强力霉素时 ,培养基中胰岛素的表达量分别为每 2 4h 2 4 1 0U/1 0× 10 6细胞和每 2 4h 9 7U/1 0× 10 6细胞 ,加强力霉素组是不加强力霉素组的 2 5倍。而且随着强力霉素浓度的增加 ,tet2 93细胞内外胰岛素的表达水平逐步增高。结论　人胰岛素基因在tet2 93细胞中的成功转移和高效表达 ,受四环素及其衍生物定时、定量调节 ,从而提高糖尿病基因治疗的精确性 ,安全性和有效性。     

含乙型肝炎表面抗原基因重组腺相关病毒的构建及其基因的表达和功能初步研究

OBJECTIVE: To construct recombinant adeno-associated virus (rAAV) carrying hepatitis B surface antigen (HBsAg) gene and study the function of the expressed HBsAg. METHODS: HBsAg gene (subtype ayw) was amplified from PTHBV-1 by PCR and cloned into the adeno-associated virus vector pSNAV to form the recombinant pSNAV-HBsAg, which was transfected into BHK-21 cells by means of lipofectamine. Using G418 selection, a mixed cell line, BHK-HBsAg, was isolated, which was capable of HBsAg expression and was subsequently infected with HSV-1-HSV1-rc/Delta UL2 that was able to package the rAAV. After purification, rAAV-HBsAg was obtained. The expression of HBsAg in BHK-21 cells and 293 cells infected with rAAV-HBsAg were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the HBsAg antibodies in the sera of rAAV-HBsAg-immunized BalB/C mice were assayed by radio immunoassay. RESULTS: As detected by ELISA, the expressed HBsAg in mixed cell line mounted to 28.6+/-6.72 ng per 5 x 10(6) cells. The BHK-21 cells and 293 cells infected with rAAV-HBsAg were both capable of HBsAg expression, the amount of which augmented with the increase of multiplicity of infection (MOI). BalB/C mice immunized with rAAV-HBsAg produced anti-HBsAg antibodies. CONCLUSIONS: rAAV-HBsAg can induce humoral immune response against HBsAg and therefore can be a promising candidate hepatitis B vaccine, and in addition, it may serve the purpose of exploring possible immunotherapy for chronic HBV infection.     

人抗HBsAg单链抗体-Tat融合基因的构建、表达及表达产物的活性鉴定

目的: 构建人抗HBsAg单链抗体-Tat蛋白转导结构域(ScFv-Tat)融合基因,在大肠杆菌中进行表达,并分析ScFv-Tat融合蛋白的活性及内化情况. 方法: 设计引物扩增人抗HBsAg单链抗体基因,克隆入含有蛋白转导结构域Tat序列的原核表达载体pTAT-HA,在大肠杆菌BL2l(DE3)LysS内诱导融合蛋白表达. 表达产物用SDS-PAGE及Western blot鉴定,用亲和层析柱纯化. 间接ELISA和ELISA竞争抑制实验分析ScFv-Tat融合蛋白的亲和活性,将纯化蛋白与HBsAg阳性或阴性肝癌细胞共孵育后,免疫细胞化学染色分析ScFv-Tat融合蛋白的结合及内化情况. 结果: 成功地构建了人抗HBsAg单链抗体-Tat融合蛋白的原核表达载体,在IPTG诱导下获得了表达,表达的ScFv-Tat融合蛋白具有与HBsAg结合的活性,并且能够特异性内化入HBsAg阳性肝癌细胞. 结论: 单链抗体与Tat蛋白转导结构域融合后,实现了ScFv-Tat融合蛋白的特异性内化,为该单链抗体的进一步应用奠定了基础.     

端粒酶逆转录酶基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体的构建和鉴定

目的 利用端粒酶逆转录酶基因启动子,构建能在人肿瘤细胞中特异表达目的基因的表达载体。方法 通过PCR方法从pEGFP-N1质粒中扩增出绿色荧光蛋白基因并克隆到逆转录病毒载体pLNCX的多克隆位点上,命名为pLNCX-EGFP。设计含有特定酶切位点的引物,从人基因组中扩增出端粒酶逆转录酶基因启动子序列,将该序列片段定向克隆到已用限制性内切酶切除巨细胞病毒启动子的pLNCX-EGFP载体上,构建成端粒酶逆转录酶基因启动子调控的含有绿色荧光蛋白报告基因的表达载体pLNT-EGFP。将该表达载体pLNT-EGFP瞬时转染高表达端粒酶活性的HLF细胞株和不表达端粒酶活性的WI38细胞株,以检测端粒酶逆转录酶基因启动子的转录活性。结果 表达载体pLNT-EGFP经酶切、测序分析证实与设计的完全一致。细胞瞬时转染结果表明,pLNT-EGFP能特异地在端粒酶阳性细胞中高效表达绿色荧光蛋白报告基因,而在端粒酶阴性细胞中不表达报告基因。结论 成功构建了由端粒酶逆转录酶基因启动子调控的肿瘤细胞靶向表达载体。     

异种移植转基因用含粘附分子-2启动子的人CD59 重组基因的构建

目的：构建含人粘附分子－2（ICAM－2）启动子的人补体调节蛋白CD59重组基因,并钭其用于异种器官移植转基因。方法：利用PCR方法从人血基因组扩增得到ICAM－2启动子、CD59基因的第一内含子片段,经电泳分离、切胶回收纯化得到上述片段,分别双酶、单酶切这两条片段,纯化回收备用;双酶切pcDNA3-CD59真核表达载体,经电泳分离,切胶回收纯化得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段pcDNA3-CD59cDNA作为载体序列;ICAM－2启动子片段先与载体进行定向克隆连接反应后转化细菌,阳性转化蓖质粒抽提及酶切鉴定,得到pcDNA3-ICAM2-CD59质粒;再单酶切此质粒,纯化该载体与CD59第一内含子片段连接,转化细菌、抽提质粒,用脂质体将该质粒转染猪血管内皮细菌,流式细胞仪检测CD59蛋白表达。结果：得到pcDNA3-Enhancer-ICAM2-CD59质粒,以EcoR I消化此重组质粒,产生5．5及0．5kb两片段,以Hind Ⅲ消化重组质粒,得到5．45及0．55kb两片段,以Kpn I/Hind Ⅲ双酶切质粒时,出现5．0、0．55、0．4kb 3条片段,对插入子分别进行测序,上述结果完全符合设计要求及正确序列。流式细胞仪检测重组基因表达阳性。结论：含人ICAM－2启动子的CD59重组基因表达载体获得成功,该重组基因构建成功为转基因应用奠定了基础。