解剖、生理和组胚学

021,27胚胎期豚鼠前庭终器细胞凋亡的检测/胡金玮…//第四军医大学学报一2002,23(16)一1514一1517 研究豚鼠胚胎正常发育期前庭终器形态变化及细胞凋亡,探讨细胞凋亡在前庭终器发育中的作用。 ·328.方法:选用胚胎40d和50d正常豚鼠,光镜观察其前庭终器发育形态变化,末端脱氧核昔酸转移酶介导的生物dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)测定毛细胞和支持细胞凋亡,并以电镜观察凋亡细胞核变化。结果:胚胎40d,豚鼠前庭壶腹、椭圆囊斑及球囊斑已分化,前庭上皮出现一层毛细胞及多层支持细胞;胚胎50d,支持细胞层数减少,毛细胞数目增加,伴有神经纤维出…     

碱性成纤维细胞生长因子及成纤维细胞生长因子受体在豚鼠前庭中的定位和表达

目的 :观察碱性成纤维细胞生长因子 ( b FGF)及成纤维细胞生长因子受体 ( FGFR)在豚鼠前庭终器的定位和表达。方法 :免疫组织化学。结果 :b FGF位于支持细胞和毛细胞的胞浆及胞核 ,FGFR位于支持细胞表面。b FGF及 FGFR在成年豚鼠表达较弱 ,新生豚鼠及庆大霉素内耳损伤豚鼠表达较强。结论 :提示 b FGF在豚鼠前庭终器发育、结构功能维持及损害后修复中起重要作用     

碱性成纤维细胞生长因子及成纤维细胞生长因子受体在豚鼠前 …

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）及成纤维细胞生长因子受体（ＦＧＦＲ）在豚鼠前庭终器的定位和表达。方法：免疫组织化学。结果：ｂＦＧＦ位于支持细胞和毛细胞的胞浆及胞核，ＦＧＦＲ位于支持细胞表面。ｂＦＧＦ及ＦＧＦＲ在成年豚鼠表达较弱，新生豚鼠及庆大霉素内耳损伤豚鼠表达较强。结论：提示ｂＦＧＦ在豚鼠前庭终器发育、结构功能维持及损害及修复中起重要作用。     

豚鼠内耳结构的死后变化

应用透射电镜观察了１５只窒息致死豚鼠的内耳各终及血管纹，发现窒息５ｍｉｎ时，仅壶腹嵴毛细胞和血管纹上皮细胞开始发生形态改变，窒息１０ｍｉｎ豚鼠心跳停止时，外毛细胞和椭圆囊斑Ｉ型毛细胞亦开始发生改变，３０ｍｉｎ时内毛细胞和球囊斑毛细胞才开始发生形态变化，提示内耳各终器死后变化开始发生的时间与程度的均有所不同。     

豚鼠内耳前庭感觉毛细胞的分离

用机械分离法从豚鼠前庭感觉上皮中分离出不同种类的前庭感觉毛细胞（ＶＨＣ）。ＶＨＣ主要可分为Ⅰ型和Ⅱ型细胞。两种细胞形态虽有所差异，但一般均有四形或瓶形胞体，胞核位于细胞基部，胞颈和纤毛变化较大。细胞的活性可通过１％中性红染色鉴定，发现在室温下，１ｈ内大约９０％以上的分离ＶＨＣ可维持其正常形态和活性。并参照对外毛细胞形态的研究提出活性ＶＨＣ的鉴别标准。此项工作为进一步研究ＶＨＣ的感觉机制和某些疾病的发生机理打下了基础。     

离体耳蜗毛细胞凋亡形态及凋亡率

目的探讨离体时相对耳蜗毛细胞的凋亡改变。方法采用胶原酶制备离体耳蜗毛细胞，0．01％吖啶橙进行荧光染色，在倒置显微镜、荧光显微镜和电镜下观察凋亡改变。结果凋亡毛细胞的主要形态特征包括：胞膜完整，有皱折扭曲，双折光现象明显减弱或消失；胞核位置基本正常，有时胞核皱缩；纤毛泡状或倒伏；胞质内可见布朗运动。荧光显微镜下凋亡毛细胞呈红色或红黄色荧光，毛细胞形态完整，无胞膜破裂或胞质溢出。随着离体时间延长，毛细胞凋亡数逐步增多，凋亡率增高。结论离体环境下凋亡细胞有其独特的形态特征，跟活性毛细胞和坏死毛细胞有明显差别；随着离体时间的延长，毛细胞凋亡率逐渐增高。     

人胎内耳中碱性成纤维细胞生长因子的定位表达

目的：研究人胎内耳中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)的定位表达情况。方法：合法水囊引产胎儿10个，制备火棉胶包埋颞骨切片，采用免疫组织化学技术观察bFGF在内耳中表达情况。结果：耳蜗毛细胞，支持细胞，螺旋神经节细胞，神经纤维均有bFGF表达，成熟毛细胞表达很弱；前庭毛细胞，支持细胞，上皮下组织和神经纤维均有bFGF表达。结论：bFGF参与人内耳发育，主要起促分化作用。     

豚鼠内耳增殖期细胞的研究

目的：检测哺乳动物内耳中具有增殖能力的影响。方法：采用增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体，以免疫组化方法检测正常成年豚鼠内耳中能进行细胞再生的位点。结果：正常成年豚鼠内耳中PCNA阳性产的定位于血管纹上皮细胞，螺旋缘齿间细胞，椭圆中分上皮细胞和内淋巴囊上皮细胞的胞核内，而耳蜗内，外毛细胞PCNA免疫反应阴性。结论：上述PCNA免疫反应阳性细胞是内耳中能进行细胞增殖的位点，成年哺乳动物耳蜗毛细胞不能进行细胞再生。     

豚鼠耳蜗外毛细胞凋亡时听力变化的实验研究

目的：观察耳蜗外毛细胞发生凋亡时听力改变情况。方法：对20只豚鼠药物造模,诱发耳蜗外毛细胞发生凋亡。应用TUNEL技术观察凋亡表达,测试ABR阈值观察听力变化。结果：应用丁胺卡那霉素1天即可诱发豚鼠耳蜗外毛细胞发生凋亡,连续应用3d,耳蜗外毛细胞凋亡呈强阳性表达,但ABR阈值无明显改变;随着用药时间延长,凋亡细胞数目增加,甚至出现部分毛细胞缺失现象,此时ABR阈值明显升高。结论：耳蜗外毛细胞发生凋亡早期对豚鼠听力无明显影响,随着耳毒性药物应用时间延长,豚鼠ABR阈值升高可能存在两种原因：毛细胞凋亡或毛细胞坏死。     

在Sox2阳性细胞敲除β-catenin对小鼠内耳发育和极性的影响

 目的 探究经典Wnt/β-catenin信号通路的核心蛋白β-catenin敲除对小鼠内耳发育和极性的影响。方法 在胚胎小鼠内耳感觉上皮的前体细胞(Sox2阳性细胞)条件敲除β-catenin,观察内耳大体结构改变情况。对基底膜和椭圆囊斑、球囊斑行免疫荧光染色,观察毛细胞数量、排列和极性的变化情况。结果 与对照组比较,β-catenin条件敲除后,听泡体积变小,耳蜗和前庭器变小,前庭感觉上皮毛细胞减少(P<0.01)。耳蜗静纤毛方向紊乱,动纤毛在位置和数量上发生变化,前庭毛细胞方向也产生散在性紊乱。结论 β-catenin调控小鼠内耳发育和毛细胞极性,经典Wnt/β-catenin信号通路可能与非经典Wnt/PCP通路共同调控耳蜗伸展和内耳平面细胞极性。     

丁胺卡那霉素对豚鼠耳蜗毛细胞凋亡及听力阈值的影响

目的探讨丁胺卡那霉素作用于耳蜗系统时毛细胞凋亡现象及其在听力损伤中的作用。方法15只豚鼠随机分为3组,各组肌内注射丁胺卡那霉素400mg·kg-1·d-1,分别于用药1d,3d,6d后处死。处死前检测其听脑于反应(auditorybrainstemresponses,ABR)的变化,并利用光镜和TUNEL标记技术检测耳蜗毛细胞发生凋亡的情况。结果①豚鼠肌内注射丁胺卡那霉素1d后耳蜗毛细胞即出现凋亡现象,连续用药3～6d,毛细胞凋亡呈强阳性表达;②耳蜗毛细胞凋亡出现的早期豚鼠听力阈值无明显改变,连续用药6d后听力阈值则明显提高。结论①丁胺卡那霉素作用于耳蜗毛细胞可引起毛细胞凋亡,细胞凋亡是豚鼠耳蜗毛细胞损伤的一条途径;②丁胺卡那霉素耳毒性作用机制可能与其引起耳蜗毛细胞凋亡有关。     

豚鼠耳蜗外毛细胞凋亡时听力变化的实验观察

目的观察耳蜗外毛细胞发生凋亡时听力改变情况.方法对20只豚鼠药物造模,诱发耳蜗外毛细胞发凋亡.应用TUNEL技术观察凋亡表达,测试ABR阈值观察听力变化.结果应用丁胺卡那霉素1天即可诱发豚鼠耳蜗外毛细胞发生凋亡,连续应用3d,耳蜗外毛细胞凋亡呈强阳性表达,但ABR阈值无明显改变;随着用药时间延长,凋亡细胞数目增加,甚至出现部分毛细胞缺失现黎,此时ABR阈值明显升高.结论耳蜗外毛细胞发生凋亡早期对豚鼠听力无明显影响,随着耳毒性药物应用时间延长,豚鼠ABR阈值升高可能存在两种原因毛细胞凋亡或毛细胞坏死.     

庆大霉素对豚鼠前庭上皮IGF-1及其受体表达的影响

目的：研究庆大霉素对豚鼠前庭上皮胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）及其受体（insulin-like growth factor-1 receptor，EGF-1R）表达的影响，并探讨其生物学特性。方法：采用免疫组织细胞化学方法，以抗IGF-1及IGF-1R抗体为标记物，检测庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮自发修复期IGF-1及IGF-1R的表达变化和分布特点；采用Brdu体内标记和抗Brdu抗体免疫组化染色，检测庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮增殖的变化。结果：IGF-1及IGF-1R在正常成年豚鼠前庭上皮细胞中有低水平表达，庆大霉素损伤后，其表达增多。在1d组IGF-1及IGF-1R表达最强，其后逐渐减少。在正常对照组中无Brdu阳性细胞。各实验组均观察到Brdu阳性细胞，7d组最多。结论：庆大霉素损伤后，豚鼠前庭上皮IGF-1及IGF-1R表达增强，其时程变化与细胞增殖活动密切相关。IGF-1在豚鼠前庭上皮损伤后的细胞增殖中可能起重要信号转导作用。     

慢性次声暴露对豚鼠耳蜗毛细胞听毛形态学的影响

目的　观察慢性次声暴露对豚鼠耳蜗 Corti器中重要的神经递质降钙素基因相关蛋白 (CGRP)分布的影响 .方法　豚鼠 (n=2 0 )在接受次声暴露条件为 8Hz,12 0 d BSPL,1次· d- 1 及 2 h·次 - 1 ,共 30 d的暴露后 ,通过免疫组织化学 ABC- GND技术 ,观察豚鼠在经次声致聋前后 CGRP- IR阳性产物在耳蜗 Corti器中分布的变化情况 .结果　 CGRP-IR阳性产物在豚鼠耳蜗 Corti器中较广泛存在 ,慢性次声暴露后豚鼠耳蜗 Corti器 CGRP- IR阳性产物迅速减小 ,在内毛细胞区对照组和暴露组 CGRP- IR阳性结构的光密度值分别为 1.182± 0 .0 4 2和 0 .875± 0 .0 5 2 (P<0 .0 1) ;在外毛细胞区CGRP- IR阳性结构的光密度值分别为 0 .4 16± 0 .16 7和0 .2 4 9± 0 .0 18(P<0 .0 1) ,而外毛细胞区 CGRP- IR阳性反应产物的减少率是内毛细胞区的 3.1倍 ,失去典型的“插码样”结构 ,外毛细胞区阳性的神经纤维及末梢完全消失 .结论　次声可通过对耳蜗神经递质的影响进而使毛细胞的功能发生改变     

强次声对豚鼠耳蜗毛细胞超微结构的影响

目的:观察强次声对豚鼠耳蜗毛细胞超微结构的影响。 方法:将30只豚鼠分5组,1组作对照, 其余4组分别暴露于8和12 Hz, 声压极为120及130 dB SPL的次声声场中, 每日持续5 h,连续给声4 d。 应用透射电镜观察次声对豚鼠耳蜗毛细胞超微结构的损伤。 结果:强次声暴露后的4组动物耳蜗毛细胞出现一些损伤变化:表现为线粒体空泡样变性,线粒体嵴紊乱,细胞核膨胀或固缩等。 损伤特点为外毛细胞损伤, 而内毛细胞正常;130 dB SPL组比120 dB SPL组损伤明显;12 Hz组与8 Hz组损伤无明显差别。结论:强次声波对豚鼠耳蜗毛细胞造成不同程度的损伤。     

OBSERVATION ON CORTI''S ORGAN OF ENTIRE COCHLEA IN THE GUINEA PIG BY SCANNING ELECTRON MICROSCOPY

The entire organ of Corti on guinea pigs were observed by SEM, which has a high resolving power and can be used for a three dimensional study on the fine structure of the cochlea. After the animals were sacrificed, primary perfusion with 3% glutaraldehyde through the oval and round windows was completed in 5 minutes and with 1% OsO4 for the next fixation. After microdissection, the entire organ of Corti was exposed and remained on the modiolus. The OTO technique and critical point drying were used to prepare SEM specimens. The organ of Corti of guinea pig was found to be very similar to that of human being. The basilar membrane widened from the base to the apex of the cochlea. The sensory hair cells, inner and outer, had different appearances marked by shallow U-shaped IHC and W-shaped OHC cilia. The longest layer of OHC cilia left imprints on the undersurface of the tectorial membrane. The relationship between the hair cells and supporting were cells shown. We conclude that the whole specimen of the organ of Corti is more advantageous than piece specimens in acoustic physiological and pathological research by integrated anatomical pattern.     

庆大霉素耳蜗毒性早期诊断和治疗的实验研究

目的 比较畸变产物耳声发射(DPOAE)和听性脑干反应(ABR)对庆大霉素(GM)致聋早期诊断中的作用。一旦发现致聋后立即给予肌注谷胱苷肽(GSH),观察其听力能否改善。方法选听力正常豚鼠40只,随机分DPOAE组10只,ABR Ⅰ、Ⅱ组各12只(Ⅰ组为ABR出现变化后停药,Ⅱ组为停药后再注射GSH 5d),对照组6只。实验组每日肌注GM 100mg／kg,对照组注射等量盐水。用药前后采用DPOAE和ABR监测其振幅和IV波反应阈。停药2周后行耳蜗铺片,观察毛细胞形态学变化。结果DPOAE组在用GM后平均7d出现变化,而ABR组平均10d出现阈移。ABR Ⅰ组用GM 10d停药2周后复查阈移呈进一步增大(P<0．01),而ABRⅡ组(停药后用GSH)2周后复查阈移无明显增大(P>0．05)。毛细胞形态学与功能变化基本一致。结论DPOAE较ABR能更早地发现GM耳毒性,及时停药听力有望不受损害,而ABR出现变化后,即使停药听力损害仍将继续加重。GSH能阻止GM对耳蜗的继续损害。     

应用胰蛋白酶分离豚鼠耳蜗内毛细胞

目的：采用胰蛋白酶孵育后机械分离法以获得单离的豚鼠耳蜗内毛细胞。方法：豚鼠被迅速断头处死，暴露耳蜗，在解剖显微镜下去除耳蜗侧壁，经胰蛋白酶消化并轻轻吹打，以获得单离的豚鼠耳蜗内毛细胞。静置后在倒置相差显微镜下观察。结果：本法每侧耳分离出活性好的内毛细胞约5～20个，多数分离的内毛细胞能存活5h左右。结论：此技术能提供足量的单离内毛细胞，用于内毛细胞的电生理性质等研究。     

呼吸道合胞病毒所致豚鼠中耳内耳病变的光镜观察

将呼吸道合胞病毒注入豚鼠中耳腔内,于接种后不同时间取材进行病毒分离,血清学检查及光镜观察。中耳粘膜病毒培养阳性率一周内为50％。血清特异性抗体IgG滴度呈逐渐增高的趋势。光镜观察中耳粘膜以变性坏死性炎症为主。伴有以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润,三周后基本恢复。耳蜗毛细胞部分变性,少数坏死。前庭终器感觉毛细胞亦出现变性。结果表明:呼吸道合胞病毒能致豚鼠急性中耳炎症,并使内耳感觉毛细胞变性。