血管内皮生长因子小干扰RNA抑制人舌鳞状细胞癌细胞移植瘤生长及血管生成的实验

目的 观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达对人舌癌Tca8113细胞移植瘤的治疗作用.方法 构建Tea8113细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分成4组,A组、B组为实验组,C组:以空载体注射为治疗对照组,D组:未治疗为空白对照组,每组5只.脂质体法将两对VEGF siRNA真核表达载体(PU-VEGF-siRNAl、PU-VEGF-siRNA2)作瘤体内及瘤周注射,1次/3 d,共10次后处死裸鼠;测量瘤体积及瘤重;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting和免疫组化法分别检测瘤组织VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达,并检测瘤内微血管密度;流式细胞仪检测肿瘤细胞悬液的细胞周期比例,Tunel法检测组织细胞凋亡.结果 B组瘤体积(0.402±0.158)cm3、瘤重量(2.12±0.58)g,均低于C、D组,细胞G1期比例为(40.26±1.42)%,较C、D组增加,B组瘤组织VEGF mRNA(0.752±0.048)和蛋白表达(1.12±0.15),组织切片VEGF阳性细胞表达率(12.56±1.30)%、平均灰度值(164.2±15.42)及微血管密度(3.50±1.58)个,均低于C、D组(P<0.05),凋亡细胞增加(P<0.01).结论 siRNA能在体内抑制舌癌VEGF表达,减少肿瘤血管生成,延缓肿瘤生长.不同的干扰片段体内作用效果存在差异.     

VEGFsiRNA对人舌癌Tca8113细胞移植瘤血管生成影响的研究

目的:观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达对裸鼠皮下人舌癌Tca8113细胞移植瘤血管生成的影响.方法:构建人舌癌Tca8113细胞20只裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为4组.将两对针对VEGF的siRNA真核表达载体(Pu-VEGF-siRNA1,Pu-VEGF-siRNA2)脂质体法作瘤体内及瘤周注射;以注射空质粒组作实验对照组;未注射组作空白对照组.注射1次/3 d×10次,末次注射3d后,剥离瘤体,RT-PCR检测瘤组织VEGF-mRNA表达,免疫印迹技术检测瘤组织VEGF蛋白表达.免疫组化染色法观察VEGF阳性染色及微血管参数.结果:Pu-VEGF-siRNA2组移植瘤VEGF-mRNA表达及VEGF蛋白表达、总体微血管密度、有腔微血管密度、有腔血管平均血管周长及管腔面积均较空质粒组及空白对照组低(p＜0.05).而Pu-VEGF-siRNA1组未观察到上述差别(P＞0.05).结论:siRNA能在体内抑制舌癌VEGF表达,有效减少肿瘤血管生成.不同的干扰片段体内作用效果存在差异.     

VEGF靶向RNA干扰质粒构建及其对人舌鳞癌Tca8113细胞的影响

目的：用RNA干扰技术阻断人舌鳞癌系Tca8113细胞中VEGF基因的表达,观察细胞增殖及凋亡特征。方法：检测人舌鳞癌系Tca8113细胞中血管内皮生长因子VEGF表达水平;采用真核转录质粒pRNA-U6.1/Neo构建针对VEGF基因的重组转染质粒。将4种不同序列的VEGF-shRNAV1、VEGF-shRNAV2、VEGF-shRNAV3、VEGF-shRNAV4质粒以及含与VEGF无关序列的VEGF-shRNAVc和空白质粒VEGF-shRNAU6分别转染Tca8113细胞,48h后检测其VEGF表达水平,筛选稳定转染RNAi-VEGF的细胞;CCK8检测其增殖能力;流式细胞仪检测其细胞周期;Anexin-V-PI检测其凋亡特征。结果：RT-PCR和Western blot检测：Tca8113细胞阳性表达VEGF;用Lipofectamine 2000成功将不同VEGF片段的质粒转染入Tca8113细胞;RT-PCR发现,VEGF-shR-NAV2组细胞VEGF表达被显著抑制,用400ng/mLG418压力筛选获得VEGF稳定被抑制的细胞系;CCK8检测各组Tca8113细胞增殖见VEGF-shRNAV2组增殖能力小于VEGF-shRNAVc组和VEGF-shRNAU6组;转染VEGF-shRNAV2的Tca8113细胞G0-G1期细胞较VEGF-shRNAVc组和VEGF-shRNAU6组高,且细胞凋亡多。结论：用RNA靶向干扰能明显降低人舌鳞癌Tca8113细胞内VEGF的表达并抑制肿瘤细胞增殖及促进凋亡。     

短发夹RNA干扰血管内皮生长因子对舌癌耐药细胞移植瘤的影响

目的 研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达对人舌癌耐药细胞Tca-顺铂(Cisplatin,DDP)移植瘤的影响及可能机制.方法 以人舌癌Tca8113细胞系为亲本诱导建立耐药Tca-DDP细胞系,将其接种于裸鼠背侧皮下,建立移植瘤模型.模型动物分为4组,即空白对照组(非转染)、空载体组(转染空质粒载体)、无关片段组(转染无关对照质粒)、干扰质粒组(转染靶向VEGF的shRNA表达载体),每组6只,每3天以脂质体为载体作瘤体内及瘤周多点注射.观测移植瘤生长曲线,转染l0次后取瘤体称重,免疫组化法检测移植瘤微血管密度,原位杂交法检测移植瘤VEGFmRNA,免疫组化技术检测移植瘤VEGF、多药耐药蛋白P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、B细胞淋巴瘤-白血病因子2(B cell lymphoma/leukemia-2,bcl-2)及胞外信号调节激酶2蛋白(extracellular signal-regulated kinase 2,ERK-2).结果 干扰质粒组的瘤体生长明显受到抑制(P＜0.05),移植瘤重量(0.4781±0.0860)g及微血管密度(7.35±1.31)个/视野,低于其他3组(P＜0.05),且VEGF的mRNA及蛋白、P-gp、bcl-2及ERK-2的相对表达量分别为(0.0767±0.0234)、(0.1301±0.0433)、(0.1517±0.0184)、(0.1218±0.0251)及(0.1178±0.0291),表达均显著减少(P＜0.05).结论 RNA干扰抑制VEGF的表达,可抑制人舌癌Tca8113耐药细胞移植瘤的生长及血管生成,下调P-gp、bcl-2及ERK-2表达水平,提示靶向抑制VEGF可能是治疗耐药舌癌途径之一.

Abstract：

Objective To study the in vivo interference effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) short hairpin RNA (shRNA) on xenografts of drug-resistant tongue cancer cells. Methods Drugresistant tongue caner cells Tca/Cisplatin(DDP) were injected subcutaneously into nude mice to establish xenograft models, which were randomly divided into non-transfected group, mock control group, control group transfected with scrambled sequence plasmid, interference group transfected with VEGF-shRNA expression plasmid. Liposome-mediated plasmid transfection was done in the latter three groups every three days. Xenografts were observed and tumor growth curve was measured. After the 10th transfection, tumors were anatomized and weigh. Microvessel density was detected by immunohistochemical staining. In situhybridization assay was used to test VEGF mRNA, and immunohistochemistry to test VEGF, P-glycoprotein ( P-gp), B cell lymphoma/leukemia-2 ( bcl-2 ) and extracellular signal-regultaed kinase 2 (ERK-2) protein. Results Tumor growth in VEGF-shRNA interference group was significantly slow. Tumor weight was (0.4781 ±0.0860) g, microvessel density (7.35 ± 1.31)/view, VEGF mRNA(0.0767 ±0.0234), VEGF protein (0.1301 ± 0.0433 ), P-gp (0.1517 ± 0.0184 ), bcl-2 ( 0.1218 ± 0.0251 ) and ERK-2 protein (0.1178 ±0.0291 ) in VEGF-shRNA interference group; all of them were less than those in the other three groups( P ＜ 0.05 ). Conclusions Inhibition targeting VEGF may become a potential therapy for drugresistant tongue cancer.     

血管内皮生长因子-C基因转染对Tca8113细胞转移能力影响的研究

目的　研究血管内皮生长因子-C(VEGF-C)对鳞癌细胞淋巴道转移能力的影响 ,以探讨其在口腔黏膜鳞癌淋巴道转移机制中的作用。方法　用本课题组前期建立的 VEGF-C高表达舌癌细胞株 ,以裸小鼠皮下接种构建动物肿瘤模型 ,观察VEGF-C高表达对移植瘤的生长和颈淋巴转移的影响。结果　VEGF-C高表达移植瘤实验组的颈淋巴结转移率高于对照 组 ,但实验组与对照组的移植瘤原发灶生长速度没有明显差异。结论　VEGF-C对舌鳞癌的淋巴道转移有相对特异的作用 ,可作为口腔癌颈淋巴转移预防和治疗的新靶位     

RNA干扰TEAD基因对舌癌细胞系Tca8113增殖和侵袭的影响

目的：应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113中内源TEAD基因的水平,观察TEAD基因对舌癌细胞生物学行为的影响。方法：构建针对TEAD基因特异性siRNA真核表达载体,将其转染至Tea8113,采用RT—PCR法检测转染后的Tca8113细胞中TEAD基因的表达。采用CCK8技术检测细胞的增殖情况,采用Transwell法检测细胞的迁移情况。实验数据采用SPSSl3．0软件包进行单因素方差分析。结果：siRNA干扰Tea8113细胞后,TEAD基因的表达水平显著下降（P〈0．05）,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降。结论：通过RNA干扰技术阻断TEAD的表达,可抑制,rca8113细胞的生长、增殖、迁移,提示TEAD基因在舌癌的发生、发展过程中起着重要作用。     

乳铁蛋白抑制舌癌细胞血管内皮生长因子表达的研究

目的探讨乳铁蛋白(lactoferrin)对舌癌细胞株Tca8113细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达调控的情况。方法采用四甲基氮唑蓝实验(MTT)、RT-PCR法检测乳铁蛋白对Tca8113细胞的增殖作用及VEGFmRNA表达改变的情况。结果乳铁蛋白显著抑制Tca8113细胞的增殖,呈剂量依赖性,乳铁蛋白对Tca8113细胞VEGF的RT-PCR产物试验组(2和3)与对照组之间比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论乳铁蛋白对Tca8113细胞的增殖有抑制作用,可以降低细胞中VEGFmRNA的表达水平,为乳铁蛋白用于肿瘤的预防及治疗提供实验基础。     

RNA干扰FAT10基因对舌癌细胞系Tca8113增殖和侵袭的影响

目的:应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113中FAT10基因的表达,探讨FAT10基因表达下调对舌癌细胞生物学行为的影响。方法:构建针对FAT10基因特异性siRNA真核表达载体pU-FAT10-siRNA,将其转染至舌癌细胞株Tca8113,采用RT-PCR、Western印迹等方法检测转染后的Tca8113细胞中FAT10的表达。通过流式细胞仪分析siRNA对舌癌细胞周期的影响,并通过细胞侵袭能力实验观察siRNA对Tca8113细胞恶性生物学行为的影响。结果:siRNA干扰Tca8113细胞后,FAT10的表达无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平均显著下降(P<0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降。结论:通过RNAi技术阻断FAT10的表达,可抑制Tca8113细胞的生长、增殖、迁徙,提示FAT10基因在舌癌的发生发展过程中起重要作用。     

siRNA抑制人Tca8113/CDDP细胞多药耐药相关蛋白表达的研究

目的:利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制人舌癌耐药细胞多药耐药相关蛋白(muhidrugresistance associated protein,MRP)的表达,观察其对培养细胞耐药性的干扰情况。方法:设计针对MRP基因的siRNA,转染人舌癌多药耐药细胞Tca8113/CDDP,用RT-PCR分析MRP mRNA的表达;免疫细胞化学技术检测MRP蛋白表达量;MTT法检测MRP siRNA的细胞毒作用。结果:Tca8113/CDDP细胞转染MRP siRNA后,MRPmRNA表达较对照组明显降低,降低率为61.3%;转染36 h后MRP siRNA组的MRP蛋白表达阳性率较对照组明显减低;MRP siRNA组中顺铂对Tca8113/CDDP细胞生长的抑制作用明显强于对照组,且抑制作用随时间的延长而增强。结论:MRP siRNA可以明显抑制口腔癌耐药细胞的多药耐药。     

血管内皮生长因子-C表达载体的构建和原核表达

目的　探讨从人舌癌组织中克隆到的血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor,VEGF-C) 片段cDNA表达载体在原核细胞中的功能表达,为进一步研究VEGF-C在口腔鳞癌中表达的意义及与淋巴转移的关系打下基础。方法　以RT-PCR法从舌鳞癌组织中克隆的VEGF-C基因功能片段cDNA与表达载体pBK-CMV构建表达质粒,转化并诱导其在大肠杆菌中的表达,并通过SDS-PAGE及Western-blotting进行检测。结果　从人舌癌组织总RNA中克隆到约1·1 kb大小的VEGF-C基因cDNA,与Genbank公布的人VEGF-C基因cDNA序列有99·6% 同源性,以之构建出的重组质粒pBK-VEGF-C转染大肠杆菌经IPTG诱导后,检测到稳定表达的相对分子质量约 56 000的融合蛋白,该融合蛋白与VEGF-C多抗具有强阳性免疫印迹反应。结论　证实克隆得到VEGF-C基因功能片段cDNA可在原核细胞中成功表达,为进一步研究VEGF-C在口腔癌颈淋巴结转移中的功能效应提供了物质基础。     

血管内皮生长因子C 对舌鳞癌癌周淋巴管的促增殖作用

目的研究血管内皮生长因子C(VEGF-C)对舌鳞癌癌周淋巴管的促增殖作用.方法将VEGF-C高表达的舌鳞癌细胞株(A组)接种于发育至第6～8天的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM),设立空白质粒转染组(B组)和空白对照组(C组),5′-核苷酸酶(5′-Nase)染色观察瘤周淋巴管,淋巴管形态学测量统计分析淋巴管数密度(LVD)、截面面积以及周长的变化.结果 3组在CAM上均能成瘤,肿瘤组织对周围CAM的侵袭较弱,瘤体组织内未见淋巴管的生成;瘤周淋巴管形态学测量分析发现A组癌周淋巴管的LVD、截面面积和周长均高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.01);B、C组之间差异无统计学意义(P>0.05).结论 CAM是研究淋巴管的较理想的模型;VEGF-C能够诱导癌周淋巴管扩张,这可能是VEGF-C增加舌鳞癌颈淋巴转移的机制之一.     

血管内皮生长因子和地塞米松对舌鳞状细胞癌细胞株基质金属蛋白酶-9表达的影响

目的探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)和地塞米松(dexamethasone,DEX)对舌鳞状细胞癌(鳞癌)细胞株基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9表达的影响。方法对体外培养的舌鳞癌细胞株分别用VEGF和DEX作为刺激因子,采用免疫组化SP法测定癌细胞中MMP-9蛋白含量的变化。结果与对照组相比不同浓度的VEGF(1、5、10 ng/ml)作用于舌鳞癌细胞24 h后,MMP-9的活性差异有显著性(P<0.01),其与VEGF有剂量依赖关系;加入DEX(0.05%)后,MMP-9表达降低,与未加入DEX的VEGF组相比差异有显著性(P<0.01)。结论VEGF可以诱导舌鳞癌细胞MMP-9的表达;DEX可以抑制舌鳞癌细胞MMP-9的表达。     

NS-398对人舌鳞癌细胞系Tca8113 表达VEGF的影响

目的:研究COX-2抑制剂NS-398对Tca8113细胞系表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Westernblot方法,在环氧合酶-2抑制剂NS-398作用的基础上,观察NS398对Tca8113细胞系表达VEGF的影响。结果:NS-398可下调Tca8113细胞内VEGF的表达,且表现出一定的时间依赖性关系。结论:NS-398可能在COX-2参与口腔鳞癌新生血管生成的过程中起重要作用。     

乳铁蛋白对口腔癌细胞血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的 观察乳铁蛋白对口腔癌细胞株Tca8113细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)表达的影响.方法 实验分0.006、0.013、0.025、0.050 g/L乳铁蛋白实验组和空白对照组.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法分别检测VEGF、bFGFmRNA和蛋白表达的改变.结果 0.050 g/L乳铁蛋白实验组VEGFmRNA的表达(0.31±0.08)和蛋白的表达(0.68±0.11)均显著低于空白对照组[分别为(1.07±0.13)、(0.97±0.07)],P<0.05;0.050 g/L乳铁蛋白实验组bFGFmRNA的表达(0.27±0.10)和蛋白的表达(0.68±0.07)均显著低于空白对照组[分别为(0.91±0.12)、(1.01±0.09)],P<0.05.结论 乳铁蛋白能抑制口腔癌细胞株Tca8113细胞中VEGF、bFGF的转录和表达,抑制肿瘤的血管发生可能是乳铁蛋白抗口腔癌的机制之一.     

Angiopoietin-2 inhibits the growth of tongue carcinoma without affecting expression of vascular endothelial growth factor

Angiopoietin-2 (Ang-2) has been identified as an important factor in tumour angiogenesis through its action in blocking the stabilizing actions of Ang-2 and leading to new tumour vessel growth in the presence of vascular endothelial growth factor (VEGF). In the authors’ previous study, over-expression of Ang-2 in Tca8113 tongue tumour cells inhibited growth. The current study aims to clarify the mechanisms of Ang-2-mediated tumour growth inhibition and its role in the regulation of VEGF expression. These studies used tumours derived from Ang-2-transfected Tca8113 cells injected into nude mice. The results showed that Ang-2-transfected tumours displayed aberrant angiogenic vessels with few associated smooth muscle cells. No detectable differences in VEGF expression were observed between Ang-2-transfected and parental tumours. Tumours produced by the Ang-2 transfection also had a higher apoptosis index and lower tumour cell proliferative index than tumours in the control groups. These observations suggest that enhanced expression of Ang-2 has no effect on VEGF expression and results in tumour vessel regression and inhibition of tumour growth.     

Transfection of hypoxia-inducible factor-1 decoy oligodeoxynucleotides suppresses expression of vascular endothelial growth factor in oral squamous cell carcinoma cells

J Oral Pathol Med (2012) Vasculature development is thought to be an important aspect in the growth and metastasis of solid tumors. Among the many angiogenic factors produced by tumor cells, vascular endothelial growth factor (VEGF) is considered to play a key role in angiogenic processes. VEGF synthesis is modulated by hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) function within the hypoxic microenvironment of growing cancer tissue. To inhibit HIF-1 activation, oligodeoxynucleotides (ODNs) were synthesized and transferred with either the consensus sequence for HIF-1 binding or a mutated form of this sequence. If we could transfer a large number of ODNs into the cancer cell nucleus, activated HIF-1 might bind to the ODNs, resulting in inhibition of hypoxia-induced VEGF synthesis. We transferred these ODNs into cultured oral squamous cell carcinoma cells (SAS cells) using the hemagglutinating virus of Japan (HVJ)-liposome method. Hypoxia-mediated expression of VEGF by cancer cells was suppressed by transfection of HIF-1 decoy ODNs, but not by mutated HIF-1 decoy ODNs. HIF-1 decoy ODN transfection also inhibited VEGF protein synthesis. These results suggest that transfection with HIF-1 decoy ODNs is effective for regulating tumor growth by reducing VEGF.     

siRNA抑制人舌癌细胞VEGF表达对MMP-2、-9及TIMP-1、-2蛋白表达的影响

【摘要】目的利用小干扰RNA （ small interfering RNA ,siRNA） 抑制人舌癌TcaSll3细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF ）表达,观察其对培养细胞和移植瘤基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs ）2、-9及基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinases ,T IMPs）-1、-2蛋白表达的影响。方法以稳定转染携带VEGF．siRNA真核表达载体的Tca8113细胞（VEGF—siRNAl、VEGF—siRNA2）为实验组,以转染空载体的及未转染的Tca8113细胞为实验对照组和空白对照组。将细胞分别接种于裸鼠皮下,用免疫组化法分别测定各组培养细胞和移植瘤VEGF、MMP-2、-9及TIMP．1、-2的蛋白表达。结果各组培养细胞及移植瘤VEGF免疫组化染色：VEGF．siRNAl组、VEGF—siRNA2组与实验和空白对照组相比,平均阳性率降低,平均灰度值增高（P〈0．05）;各组培养细胞均未检测出MMP-2、-9及TIMP-1、-2蛋白的阳性表达。各组移植瘤MMP-9、TIMP-1、-2可见阳性表达,但各组染色平均阳性率及平均灰度值之间的差异无统计学意义（P〉0．05）,而MMP-2未见明显阳性表达。结论以siRNA干扰沉默人舌癌Tca8113细胞VEGF基因,可明显抑制细胞及移植瘤内VEGF蛋白表达,但是对MMP-2、-9及TIMP-1、-2蛋白的表达无明显影响。