唾液酸修饰绿原酸脂质体制备及其体外抗肿瘤活性研究

目的 响应面设计制备唾液酸（sialic acid,SA）修饰的绿原酸（chlorogenic acid,CA）脂质体（CA-SAL）,考察其体外细胞毒性和摄取。方法 采用改良逆相乙醇注入法制备CA-SAL,以葡聚糖凝胶G-50柱离心法分离脂质体和游离药物,并通过HPLC法测定药物质量浓度,计算包封率。以包封率和载药量为考察指标,通过Box-Behnken响应面设计实验优化CA-SAL的处方和工艺,MTT法评价其对人肺癌A549细胞的细胞毒性,倒置荧光显微镜观察A549细胞对CA-SAL的摄取情况。结果 优化后的CA-SAL制备条件：氢化大豆磷脂与绿原酸的质量比为15∶1,水化温度60℃,超声功率400 W。CA-SAL平均粒径为（90.13±0.51）nm,多分散指数（PDI）为0.16±0.01,Zeta电位为（-25.3±0.5）mV;包封率为57.8%,RSD为0.1%。MTT实验结果显示,CA-SAL对A549细胞的增殖抑制作用显著强于绿原酸脂质体（CA-CL）,细胞摄取实验表明A549细胞对唾液酸修饰脂质体的摄取更高。结论 通过响应面优化制备的CA-SAL粒径小、性质稳定。经唾液酸修饰后的脂质体可以增强人肺癌A549细胞的细胞摄取及体外细胞毒性。     

Angiopep-2修饰白藜芦醇脂质体的处方优化与体外评价

目的 制备Angiopep-2（Ang）修饰的白藜芦醇（resveratrol,Res）脂质体（Ang-Lip/Res）,并对其进行处方优化和体外脑靶向性研究。方法 采用薄膜分散法制备Ang-Lip/Res,利用Box-Benhken响应面法对影响其包封率的3因素（磷脂的质量浓度、磷脂与药物的质量比、磷脂与胆固醇的质量比）进行优化处方最佳制备工艺并验证脂质体的包封率;采用磺酰罗丹明B蛋白法考察脂质体对小鼠神经细胞的毒性;采用流式细胞仪和荧光显微镜探究细胞摄取情况;构建体外血脑屏障模型,比较白藜芦醇脂质体（Res-Lip）跨越血脑屏障的能力。结果 Ang-Lip/Res的最优处方：磷脂的质量浓度为4.4mg/mL,磷脂与白藜芦醇的质量比为11∶1,磷脂与胆固醇的质量比为5.5∶1。按照最佳处方,以磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀及DSPE-PEG₂₀₀₀-Ang为膜材制备的Ang-Lip/Res包封率为（93.28±1.35）%。细胞毒实验结果表明,50μmol/L浓度以内,AngLip/Res对小鼠神经细胞N2a和bEnd.3无明显毒性;体外细胞摄取实验结果表明,与非靶向Res-Lip相比,Ang的修饰明显增加了bEnd.3细胞对脂质体的摄取,提高了脂质体体外BBB渗透率。结论 成功制备Ang-Lip/Res,可进一步应用于防治脑部疾病的研究。     

聚酰胺-胺树枝状大分子包载白藜芦醇的制备及体外研究

目的 制备聚酰胺-胺树枝状大分子包载白藜芦醇纳米载体复合物（Res-PAMAM-Ac）,并考察其稳定性和安全性。方法 采用发散法合成空白载体,并进行乙酰化修饰,核磁共振图谱（¹H-NMR）、红外光谱（IR）对载体进行表征,粒径及Zeta电位检测考察载体性质;逆相蒸发法制备Res-PAMAM-Ac,HPLC检测载药量、包封率以及稳定性;MTT法考察载体和复合物对人肺癌A549细胞的细胞毒性;溶血性试验评价载体和复合物的生物安全性。结果 成功合成Res-PAMAM-Ac,大小均匀,平均粒径（167.30±21.70）nm,PDI为0.115±0.006,电位（19.27±0.35）mV;平均载药量（76.99±1.30）mg/g,包封率（29.63±2.70）%,稳定性参数（K_E）小于0.15,且药物无明显析出;复合物质量浓度在30 μg/mL以下时对人肺癌A549细胞具有较小毒性;载体及复合物溶血率低于5%,视为生物安全。结论 制备的Res-PAMAM-Ac粒径均匀、载药量较好、稳定性高、毒性小。     

积雪草酸诱导大鼠肝星状细胞凋亡

目的 探讨积雪草酸诱导大鼠肝星状细胞系 HSC-T6 凋亡的作用。方法 用乳酸脱氢酶 (LDH) 法和 MTT 法检测积雪草酸对 HSC-T6 细胞的细胞毒性和增殖的影响。不同浓度积雪草酸作用外源性β-转化生长因子 (TGF-β) 激活的 HSC-T6 细胞,通过 Western blotting 方法检测 HSC-T6 细胞凋亡信号分子 Caspase-3 以及Ⅰ型胶原蛋白表达。结果 积雪草酸 (≤30 μmol/L) 对 HSC-T6 细胞无显著的细胞毒性且对细胞增殖无明显作用。积雪草酸可上调 HSC-T6 细胞 cleaved-caspase-3,同时抑制Ⅰ型胶原蛋白表达。结论 积雪草酸可通过诱导 HSC-T6 细胞凋亡达到抑制肝纤维化的作用。     

姜黄素CTPP-PEG-PCL胶束的制备及体外评价

该研究合成了材料3-羧丙基-三苯基溴化鏻-聚乙二醇-聚己内酯(CTPP-PEG-PCL),并且采用自组装溶剂挥发法制备载姜黄素CTPP-PEG-PCL胶束,芘荧光光谱法测定临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC),考察粒径、包封率、形态、体外释放度;采用MTT实验进行肝星状细胞毒性评价。所得材料CTPP-PEG-PCL经¹H NMR表征确证其结构,CMC为2.252 mg·L^-1,胶束粒径约为190 nm,含药量为(0.66±0.008) g·L^-1,包封率(94±0.6)%,体外释放显示缓释特性,姜黄素胶束对肝星状细胞的生长抑制率显著高于姜黄素原料药(P<0.05)。表明CTPP-PEG-PCL胶束临界胶束浓度小,包封率高,肝星状细胞生长抑制效果显著。     

转铁蛋白修饰的姜黄素脂质体的制备及体外抗肿瘤活性

目的 制备转铁蛋白（transferrin,Tf）修饰的姜黄素（curcumin,Cur）脂质体（Tf-Cur-Lip）,并研究其理化性质和体外抗肿瘤活性。方法 采用薄膜分散法制备Tf-Cur-Lip,对其形态、粒径、多分散性指数、包封率、载药量、体外释放等进行表征;以人前列腺癌DU154细胞为模型进行细胞抑制率实验与细胞摄取实验。结果 所制得的Tf-Cur-Lip呈类球形,大小分布均匀,平均粒径为（68.27±0.36）nm,多分散指数为0.194±0.050,平均包封率与载药量分别为（98.13±0.38）%与（2.94±0.38）%。体外释放研究表明,Tf-Cur-Lip相比游离姜黄素具有一定缓释效果。MTT实验结果表明Tf-Cur-Lip对DU145细胞的抑制作用显著高于游离姜黄素,与非靶向姜黄素脂质体（Cur-Lip）相比,转铁蛋白的修饰明显增加了DU145细胞对脂质体的摄取效率。结论 成功制备了Tf-Cur-Lip,该脂质体能够提高肿瘤靶向性,具有一定的抗肿瘤活性。     

主动载药法制备三氧化二砷脂质体

目的 采用主动载药法制备三氧化二砷（As₂O₃）脂质体,并优化处方组成,考察主动载药法制备As₂O₃脂质体的可行性。方法 采用正交设计法筛选处方,主动载药法制备As₂O₃脂质体;用葡聚糖凝胶G-50柱分离脂质体和游离药物,用原子荧光分光光度法测定包封率;用电镜观察脂质体的外观形态,并用激光粒径分析仪测定脂质体的粒径和Zeta电位;并进一步考察其优势。结果 所得脂质体的包封率为（72.3±0.8）%;形态为粒径均匀的球形或类球形,粒径为（193±12）nm,Zeta电位为（36.1±3.0）mV;脂质体具有良好的安全性与较好的稳定性。结论 优选得到的As₂O₃脂质体处方和制备工艺合理,并且所制备的As₂O₃脂质体具有良好的安全性。     

载As2O3 pH敏感钙砷复合物脂质体的制备及体外评价

目的 制备pH敏感释药的As₂O₃脂质体,并进行体外评价。方法 采用薄膜分散法制备含钙离子脂质体,然后用离子沉淀法孵育制备钙砷复合物脂质体（CaAs-LP）。测定CaAs-LP的粒径、Zeta电位及多分散系数（PDI）;透射电子显微镜观察脂质体的形态;电感耦合等离子体发射光谱仪测定纳米药物的载药量与包封率;透析袋法考察其体外释药特性。噻唑蓝（MTT）法考察未载药脂质体及CaAs-LP对人源性乳腺癌MCF-7细胞、人源性脑胶质瘤U87细胞和人源性肝癌HepG2细胞的毒性;共聚焦显微镜考察U87细胞对CaAs-LP的摄取效率。结果 制备的CaAs-LP呈规整类球型,粒径约为（117.16±1.94）nm,包封率和载药量分别为（74.31±2.11）%、（8.31±0.13）%。体外释放研究表明,CaAs-LP具有明显的缓释以及pH响应释药特征。未载药的脂质体在MCF-7、U87、HepG2和L02细胞中的生物相容性良好;CaAs-LP抑制肿瘤细胞生长的作用较原药有所上升,半数抑制浓度（IC₅₀）值分别为11.91、4.90、19.41、27.59 μmol/L。细胞摄取研究表明肝癌细胞对脂质体具有良好的摄取。结论 CaAs-LP具备显著的缓释以及pH响应释药的特性,在肿瘤治疗方面具有较好的应用前景。     

柠檬苦素脂质体的制备和制剂学评价

目的 针对柠檬苦素（limonin,LM）的成药性问题,开发其脂质体制剂,优化处方和制备工艺,并考察其体外抗肿瘤活性。方法 采用薄膜分散法制备柠檬苦素脂质体（LM@Lip）,通过单因素实验和正交试验筛选LM@Lip的制备工艺和处方,采用Malvern粒度仪检测所制备LM@Lip粒径、PDI及Zeta电位,采用HPLC检测其包封率和载药量,透析法研究LM@Lip体外释放情况,MTT法评价LM@Lip对HepG2及A549细胞的毒性。结果 优化后的脂质体制备条件：药脂比为1：150,胆脂比为1：9,探头超声条件为功率120 W、时间6 min（间隔1 s）。载药脂质体的平均粒径为（119.5±6.2）nm,PDI为0.318±0.124,Zeta电位为（-17.2±1.3）mV,包封率为87.9%,载药量为0.57%,药物质量浓度为63.4 μg/mL。体外释放实验结果显示,12 h累积释放量为58.59%。MTT结果显示,LM@Lip对HepG2和A549细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为20.16、15.39 μg/mL,其肿瘤抑制作用优于LM单药。结论 将LM制备成LM@Lip可以增加药物的稳定性及溶解度,药物表现出一定的缓释现象,并且能明显抑制肿瘤细胞增殖,效果优于LM。     

Angiopep-2修饰载盐酸多柔比星脂质体的制备与评价

 目的 研究用靶向功能基Angiopep-2修饰多柔比星（DOX脂质体,增加药物在脑胶质瘤部位递送。方法 薄膜分散法制备空白脂质体,靶向功能基Angiopep-2通过膜材料中DSPE-PEG-MAL连接对其进行修饰,DOX作为模型药物通过pH梯度法装载,制得Angiopep-2修饰脂质体（Dox-AL。体外实验中,初步考察了大鼠C6细胞对游离DOX、普通DOX脂质体（DOX-NL和DOX-AL的摄取。C6脑胶质瘤模型小鼠尾静脉注射DOX、DOX-NL和DOX-AL,LC-MS/MS检测小鼠血浆、脑和肿瘤组织DOX浓度。结果 DOX脂质体粒径约为100 nm,包封率99%;大鼠C6细胞对DOX-AL的摄取高于DOX-NL;C6脑胶质瘤模型小鼠iv给予剂量为5 mg·kg-1DOX、DOX-NL和DOX-AL后,3组制剂药物在体内快速分布,较缓慢消除,均符合三室模型。与DOX相比,脂质体制剂能显著延长DOX血液循环时间,增加药物入脑机会;DOX-AL在脑和肿瘤中的AUC_0-t分别是DOX-NL的2.92和7.76倍。结论 Angiopep-2修饰的脂质体作为载体可通过受体介导的方式促进药物胶质瘤靶向递送。     

冬凌草甲素/胆固醇甲酰-壳聚糖共聚物纳米胶束的制备及其体外抗肿瘤作用

 目的 制备冬凌草甲素/胆固醇甲酰-壳聚糖共聚物（ORI/CF-CS）纳米胶束并研究其体外抗肿瘤活性。方法 采用酰胺化反应合成胆固醇甲酰-壳聚糖共聚物（CF-CS）;以CF-CS为载体材料制备ORI/CF-CS纳米胶束,并测定其载药量、包封率、形态、粒径和ξ电位;MTT法测定其对宫颈癌Hela肿瘤细胞的细胞毒作用。结果 ORI/CF-CS纳米胶束载药量为9.16%,包封率为48.83%,粒径控制在68.10~113.8 nm内,ξ电位为-34.97~-29.19 mV,体外释药缓慢;ORI/CF-CS纳米胶束对Hela肿瘤细胞的细胞毒作用优于冬凌草甲素溶液,且IC₅₀ 值比冬凌草甲素溶液低约3倍。结论 CF-CS是冬凌草甲素的优良载体,且可提高其抗Hela肿瘤细胞的活性。     

5-氟尿苷棕榈酸酯脂质体的制备及其细胞毒性研究

 目的制备前药5-氟尿苷棕榈酸酯(5-FURP)脂质体,并进行体外细胞毒性实验。方法通过正交实验设计筛选5-FURP脂质体的最佳处方,采用逆向蒸发法制备5-FURP脂质体,测定其包封率及理化性质;以人乳腺癌细胞系MCF-7、人鼻咽癌细胞系CNE-1、人喉癌细胞系HEP-2为模型细胞,考察5-FUR前药脂质体的细胞毒性。结果制备的脂质体平均包封率为94.35%,将脂质体分别在4和25℃下密闭放置1个月,以包封率、脂质体中磷脂含量变化为指标考察其稳定性。结果显示,脂质体于4℃贮存时,上述指标无显著变化,脂质体比较稳定;细胞实验表明,5-FURP经脂质体包裹后,细胞毒性较游离药物增高,对人乳腺癌细胞系MCF-7、人鼻咽癌细胞系CNE-1、人喉癌细胞系HEP-2的IC₅₀分别是游离药物的5.0,3.4,2.6倍。结论实验室制备的5-FURP经脂质体包裹后能增强细胞摄取,具有提高药物疗效的效果。     

苦参素对肝星状细胞HSC-T6增殖及端粒酶的影响

目的 探讨苦参素在诱导肝星状细胞HSC-T6凋亡过程中的作用,以及对端粒酶及其亚单位端粒酶逆转录酶（rTERT）mRNA表达的影响。方法 将不同质量浓度的苦参素与HSC-T6细胞共培养不同时间后,MTT法检测苦参素对HSC-T6细胞的生长抑制作用;流式细胞术检测苦参素对HSC-T6细胞凋亡的影响;TRAP-PAGE-银染法检测苦参素作用后HSC-T6细胞中端粒酶活性的改变;RT-PCR检测苦参素对HSC-T6细胞rTERT mRNA表达的影响。结果 苦参素能显著抑制HSC-T6细胞生长、诱导细胞凋亡、降低端粒酶活性,并抑制rTERT mRNA表达。结论 苦参素对HSC-T6细胞增殖具有抑制作用,可能与抑制细胞端粒酶及其亚单位rTERT的活性有关。     

溴化双十二烷基二甲基铵修饰的载汉防己甲素聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒制备及体外评价

目的 制备溴化双十二烷基二甲基铵(DMAB)修饰的载汉防己甲素(Tet)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒(DMAB-Tet-PLGA-NPs),考察其制备的影响因素,优化制备工艺,并对其理化性质、细胞毒性及细胞摄取进行研究。方法 采用乳化分散溶剂挥发法制备DMAB-Tet-PLGA-NPs,运用均匀设计试验优化制备工艺,通过包封率、载药量、累积释药量等指标考察其载药特性;采用MTT比色法考察DMAB-Tet-PLGA-NPs对人肺腺癌细胞株A549的细胞毒性;采用定量定性法评价DMAB-Tet-PLGA-NPs细胞摄取率。结果 制备的DMAB-Tet-PLGA-NPs平均粒径为(205.40±2.66)nm,表面带正电,呈规则的球形及椭圆形。药物包封率和载药量分别为(50.780±3.253)%和(2.130±0.035)%。体外释放实验显示DMAB-Tet-PLGA-NPs缓慢释药,48 h累积释药量64.56%。MTT实验表明DMAB-Tet-PLGA-NPs细胞毒性呈剂量及时间依赖性。定性定量细胞摄取实验证实DMAB-Tet-PLGA-NPs能较好地被细胞摄取。结论 DMAB-Tet-PLGA-NPs粒径大小均一,包封率高,体外释药表现出较好的缓释效果,易被细胞摄取,对A549细胞的活性有明显的抑制作用。     

垂盆草总黄酮影响肝星状细胞凋亡的作用机制研究

目的:研究垂盆草总黄酮(SSTF)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)凋亡的影响及其作用机制。方法:将不同质量浓度的SSTF与HSC-T6细胞共培养不同时间后,MTT法检测SSTF对HSC-T6细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪Annexin-V/PI双染方法检测SSTF对HSC-T6细胞凋亡的影响;应用Western blotting和Real-time PCR方法观察药物对凋亡相关细胞因子Bcl-2,Bax和Caspase-3蛋白及mRNA表达的影响。结果:SSTF能显著抑制HSC-T6细胞增殖、诱导细胞凋亡,且呈剂量和时间依赖;Western blotting结果显示,SSTF通过抑制Bcl-2,促进Bax和Caspase-3蛋白表达促进细胞凋亡;进一步采用Real-time PCR研究发现,Bcl-2能够从mRNA水平抑制Bcl-2、促进Bax和Caspase-3表达。结论:SSTF具有促进HSC-T6凋亡的作用,这种作用的发挥主要是通过抑制Bcl-2、促进Bax和Caspase-3蛋白和mRNA的表达实现的。     

靶向熊果酸脂质体的制备及其体外靶向性研究

目的制备靶向熊果酸脂质体,并评价其对宫颈癌He La细胞的体外靶向性。方法采用化学合成方法制备新型的靶向性功能材料叶酸-CONH-聚乙二醇-NH-胆固醇,以薄膜分散法制备靶向熊果酸脂质体;构建以钙黄绿素为荧光探针标记物的脂质体,用荧光共聚焦倒置显微镜观察靶向脂质体对He La细胞的穿透能力;以流式细胞术考察靶向脂质体的摄取效率。同时,考察靶向熊果酸脂质体对He La细胞的生长抑制作用。结果薄膜分散法制备的靶向熊果酸脂质体对He La细胞具有明显的靶向作用,并且具有显著的细胞增殖抑制作用。结论靶向熊果酸脂质体可有效穿透He La细胞,且具有较强的杀伤宫颈癌细胞活性的作用。     

熊果酸脂质体的制备及体外释放特性考察

目的:制备熊果酸脂质体,优化熊果酸脂质体的处方工艺,并研究其理化性质及体外释放特性。方法:采用摇瓶法考察熊果酸在不同pH介质中的油水分配系数;采用薄膜-超声法制备熊果酸脂质体,以包封率为指标,通过正交试验优选熊果酸脂质体的处方工艺。采用透射电镜观察其形态,激光粒度测定仪测定其粒径和zeta电位,动态透析法考察其体外释放的特性。结果:熊果酸油水分配系数lgPo/w随pH增大而降低,且均>0.5,说明熊果酸具有较好的亲脂性。优选的处方工艺为载药量6 mg,磷脂-胆固醇2∶1,PBS摩尔浓度0.01 mol.L-1,超声时间3 min。制备的熊果酸脂质体透射电镜下呈球形或椭圆球形,平均粒径(223.7±68.4)nm,zeta电位-20.63 mv,包封率(89.85±1.66)%,48 h体外累计释放率>80%,体外释放符合一级动力学模型。结论:制备的熊果酸脂质体包封率高,体外释放性能良好,具有缓释特性。     

消岩汤含药血清介导下Survivin siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

[目的]分析消岩汤含药血清介导下Survivin siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响,探究其抑瘤机制。[方法]在Invitrogen公司的网上设计系统中设计靶向Survivin基因的siRNA序列,并将其转染A549细胞,应用噻唑蓝(MTT)法检测消岩汤以及转染组对A549细胞生长抑制的情况,免疫组化法观察A549细胞Survivin蛋白的表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。[结果]MTT法显示消岩汤具有抑制A549细胞生长的作用,其作用具有一定的时间依赖性,转染中药组的抑制率显著高于转染对照组及非转染中药组。经免疫组化法检测,转染对照组对Survivin蛋白表达的抑制率明显高于非转染中药组,但显著低于转染中药组。流式细胞术检测结果显示消岩汤及重组质粒以诱导细胞晚期凋亡为主,转染中药组A549细胞凋亡率显著高于其他各组。[结论]消岩汤可诱导A549细胞的凋亡,联合应用转染靶向Survivin基因的重组质粒可增强其体外诱导A549细胞凋亡的作用。     

荷包牡丹碱诱导人肺腺癌细胞A549凋亡及其机制初探

 目的 探讨荷包牡丹碱对人肺腺癌细胞A549的增殖抑制作用并对其作用机制进行研究。方法 MTT比色法检测荷包牡丹碱在不同浓度及不同时间对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用。利用TUNEL法探讨荷包牡丹碱诱导人肺腺癌细胞A549的凋亡效果;流式细胞术（FMC）测定荷包牡丹碱对A549肿瘤细胞周期的分布;比色法测定荷包牡丹碱对半胱天冬酶（caspase）-3蛋白活性的影响。结果 荷包牡丹碱对人肺腺癌细胞A549增殖抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强;荷包牡丹碱对A549肿瘤细胞具有明显的凋亡效应;荷包牡丹碱与A549肿瘤细胞作用后,发生S期阻滞（P<0.05);荷包牡丹碱促使caspase-3蛋白活化(P<0.05)。结论 荷包牡丹碱能有效抑制人肺腺癌细胞A549的生长,使细胞周期阻滞在S期,进一步诱导其凋亡,并使caspase-3蛋白活化。caspase-3蛋白的激活可能在荷包牡丹碱诱导A549细胞凋亡过程中起重要作用。