Livin反义寡核苷酸对骨肉瘤MG-63细胞活性的影响

目的 探讨Livin在骨肉瘤细胞中的表达及Livin反义寡核苷酸（ASODN）对骨肉瘤细胞活性及功能的影响。方法 设计针对Livin的ASODN序列,根据转染效率评价结果,选择下调作用最强的ASODN序列制备脂质体-寡核苷酸复合物并转染 MG-63 细胞。采用免疫细胞染色法及Western blotting检测转染24 h后MG-63 细胞中Livin的表达情况,CellTiter-Glo法检测转染72 h后MG-63 细胞的增殖情况,划痕法检测ASODN对MG-63细胞迁移能力的影响,流式细胞仪检测转染24 h后 MG-63 细胞的凋亡情况和细胞周期。结果 Livin蛋白主要表达于MG-63细胞的胞质。选用下调作用最强的ASODN转染MG-63细胞后,Livin蛋白表达显著下降;不同浓度Livin ASODN 对 MG-63细胞的增殖及迁移有剂量依赖抑制作用;而ASODN 组的凋亡率明显高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。结论 靶向Livin的ASODN可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力并促进其凋亡。     

沉默HuR的表达增加人乳腺癌耐药MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性

目的：研究RNA干扰人抗原R（human antigen R,HuR）基因的表达对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr对多柔比星（doxorubicin）敏感性的影响。 方法： 构建靶向 HuR基因 的shRNA表达质粒（pGenesil-siHuR）,稳定转染至MCF-7/Adr细胞,real-time PCR检测细胞中 MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测MCF-7/Adr细胞中由 MDR1 基因编码的P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的表达,MTT法检测pGenesil-siHuR 转染后MCF-7/Adr细胞在多柔比星作用后的存活率和IC50,流式细胞术检测MCF-7/Adr细胞的凋亡率。 结果： 与未转染的MCF-7/Adr细胞比较,pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞中 MDR1 mRNA的表达水平明显减低\[（0184±0.029） vs （1.203±0.026）,P<0.01\],P-gp表达水平明显降低。pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞后,MCF-7/Adr细胞对多柔比星的IC50从未转染的(148.2±2.3）nmol/L降至(42.9±0.4）nmol/L;经多柔比星处理后,pGenesil-siHuR质粒转染组MCF-7/Adr细胞的凋亡率明显上升\[（34.6±1.1）% vs （1.1±0.2）%,P<001\]。 结论： RNA干扰HuR的表达能抑制 MDR1基因 的表达,增加耐药乳腺癌MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性。     

Kv1.3钾通道在骨肉瘤中的表达及作用研究

目的 探讨特异性短发卡RNA（shRNA）抑制Kv1.3钾通道对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应、Western blotting和免疫组化检测骨肉瘤MG-63细胞中Kv1.3钾通道的表达,并分别采用CCK-8法、裸鼠骨肉瘤异种移植模型和流式细胞仪检测MG-63细胞增殖、生长和凋亡的变化,采用Western blotting检测MG-63细胞中多聚ADP核糖聚合酶（PARP）和caspase-3的表达水平。结果Kv1.3钾通道在骨肉瘤细胞中异常高表达。沉默Kv1.3钾通道的Ad5-Kv1.3-shRNA能从体内外有效地抑制MG-63细胞增殖并促进其早期凋亡。沉默Kv1.3钾通道可明显诱导细胞凋亡相关蛋白caspase-3和PARP的裂解。结论Kv1.3钾通道参与骨肉瘤细胞增殖和凋亡的过程,有望成为骨肉瘤治疗及诊断的新靶点基因。     

FOXO3a 在缺氧诱导骨肉瘤U-2OS细胞顺铂耐药中的作用

目的：探讨FOXO3a 在缺氧诱导骨肉瘤细胞顺铂（cisplatin,DDP）耐药中的作用。方法：利用RT-PCR和Western blotting方法检测人骨肉瘤细胞U-2OS在常氧及缺氧条件下FOXO3a 的表达水平,Western blotting 检测转染FOXO3a-siRNA 和HIF-1α-siRNA 对细胞内FOXO3a 和HIF-1α 表达的影响,CCK-8 和Annexin V/PI 染色法检测FOXO3a 在缺氧诱导骨肉瘤细胞DDP耐药中的作用。结果：缺氧可使人骨肉瘤细胞U-2OS中FOXO3a mRNA和蛋白表达升高（均P<0.05）。FOXO3a 的表达受HIF-1α调控,与正常细胞组和转染阴性序列HIF-1α-NC组相比,HIF-1α-siRNA 组FOXO3a 蛋白表达量均显著降低[(0.38±0.03) vs (0.89±0.08),(0.91±0.07),均P<0.01]。在缺氧条件下,FOXO3a-siRNA 可降低U-2OS 细胞对DDP 的耐受性[(38.50±2.83)% vs (61.75±5.73)%,P<0.01],增加DDP诱导的U-2OS细胞凋亡[(73.41±6.13)% vs (32.38±2.23)%, (55.89±4.46)%,均P<0.05]。结论：缺氧通过HIF-1α 依赖的方式诱导骨肉瘤细胞内FOXO3a 表达,从而增强瘤细胞对DPP的耐药性。     

骨肉瘤MG-63细胞中Survivin的表达及其反义寡核苷酸对细胞增殖与凋亡的作用

目的 探讨Survivin在骨肉瘤细胞中的表达及Survivin反义寡核苷酸（ASODN）对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响。方法 设计针对Survivin的ASODN和正义核苷酸（SODN）序列,制备脂质体-寡核苷酸复合物并转染MG-63细胞,分为空脂质体（Lip）组、脂质体介导的SODN（Lip-SODN）组和脂质体介导的ASODN（Lip-ASODN）组。采用免疫细胞染色法检测MG-63细胞中Survivin的表达情况,Western blotting检测各组转染48h后的Survivin蛋白水平,MTT法检测转染24、48和72h后MG-63细胞的增殖情况,流式细胞仪检测转染48h后MG-63细胞的凋亡情况。结果 Survivin主要表达于MG-63细胞的胞核。Lip-ASODN组的Survivin蛋白水平均低于Lip-SODN组和Lip组。不同浓度Survivin ASODN对MG-63细胞的增殖抑制程度不同,Lip-ASODN组的细胞增殖抑制率高于Lip组,且呈浓度依赖性;而Lip-SODN组的增殖抑制率与Lip组的差异无统计学意义（P＞0.05）。Lip-ASODN组的凋亡率为（88.47±0.79）％,高于Lip组的（10.01±0.90）％和Lip-SODN组的（4.12±0.25）％,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 靶向Survivin的ASODN可以显著抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖能力,并促进其凋亡。     

沉默CtBP1基因逆转人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)的多药耐药性

目的:探讨短发夹式RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰羧基末端结合蛋白1(C-terminal-binding proteins 1,CtBP1)基因表达是否可以逆转多药耐药基因1(multidrug resistant gene 1,MDR1)介导的人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)的多药耐药性.方法:采用脂质体转染法将特异性的shRNA1和shRNA2及非特异性的shRNAHK质粒转染入人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)中,RT-PCR法检测各组细胞MDR1基因表达水平,Western印迹法检测各组细胞P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的表达,MTT法测定各组细胞对多柔比星的敏感性变化.结果:RT-PCR结果显示,shRNA1组和shRNA2组细胞中MDR1基因被抑制,基因表达抑制率约50%;Western印迹结果显示,shRNA1组和shRNA2组细胞P-gp蛋白的表达水平显著降低;MTT检测发现,shRNA转染48和72 h时shRNA1组和shRNA2组细胞对多柔比星的敏感性增加(P<0.01).结论:沉默CtBP1基因可抑制人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)中MDR1基因和P-gp蛋白的表达,降低细胞的耐药性.     

沉默HOXC10基因促进骨肉瘤MG-63细胞凋亡及其机制

目的:探讨沉默同源框C10（Homeobox C10,HOXC10）基因表达对骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨可能的作用机制。方法:采用脂质体转染法将特异性针对HOXC10基因的shRNA转入骨肉瘤MG-63细胞（HOXC10-shRNA组）,同时以转染Scramble-shRNA作为对照组（Scramble-shRNA组）,分别应用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测HOXC10 mRNA及蛋白的表达水平。转染处理后,分别采用CCK-8法及FCM法检测骨肉瘤MG-63细胞的增殖抑制率及凋亡情况,采用蛋白质印迹法检测HOXC10、ATM和核因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB)及凋亡相关蛋白Survivin和Caspase-3的表达水平。结果:HOXC10-shRNA转入MG-63细胞后,HOXC10 mRNA和蛋白的表达水平均明显下调（P均<0.05）。与Scramble-shRNA组细胞活力（0.95±0.12）%和凋亡率（4.35±0.52）%相比,HOXC10-shRNA组细胞活力（0.38±0.06）%明显下降,细胞凋亡率为（18.19±3.76）%明显升高（P均<0.05）;ATM/NF-κB信号通路中相关蛋白ATM、NF-κB及Survivin的表达水平均明显下调（P均<0.05）,而Caspase-3表达明显上调（P<0.05）。结论:沉默HOXC10基因表达后可抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与调控ATM/NF-κB信号通路的活化相关。     

反义Snail转录因子诱导MG-63细胞凋亡增加顺铂化疗敏感性的研究

[目的]探讨反义Snail转录因子对人骨肉瘤细胞株MG-63顺铂化疗敏感性的影响。[方法]用脂质体转染法将高转移性骨肉瘤细胞株MG-63分别转染反义Snail质粒（pGenesil-snailAS）和空载体质粒（pGenesil）。MG-63组（对照组）、MG-63/pGenesil组和MG-63/pGenesil-snailAS组细胞分别与浓度为0、0.5、1、5、10、15、20μg/ml顺铂作用72h。MTT法测定各组细胞的存活率并计算IC50,FCM检测细胞凋亡,Westernblot检测各组细胞Snail蛋白表达。[结果]细胞稳定转染pGenesil-snailAS后,细胞内Snail蛋白表达明显被抑制。MG-63、MG-63/pGenesil和MG-63/pGenesil-snailAS组细胞的顺铂IC50分别为14.0±1.8、12.6±1.6和2.8±0.5μg/ml,MG-63/pGenesil-snailAS组细胞对顺铂作用的敏感性增加了5倍。顺铂对MG-63/pGenesil-snailAS组细胞所诱导的凋亡比MG-63组和MG-63/pGenesil组显著。[结论]反义Snail转录因子能诱导人骨肉瘤细胞株MG-63凋亡并抑制其生长,增加其对顺铂化疗敏感性。     

人骨肉瘤耐药细胞系MG-63/PTX的建立及多药耐药机制研究

目的 建立人骨肉瘤细胞多药耐药亚系,探讨骨肉瘤细胞多药耐药的发生机制.方法 采用紫杉醇大剂量间断冲击培养法,诱导建立紫杉醇耐药骨肉瘤细胞系(MG-63/PTX),并运用MTT法检测6种药物敏感性变化及细胞生长规律变化,流式细胞仪分析亲本细胞系和耐药细胞系的细胞膜表面P-gp蛋白表达率、罗丹明123排出情况,RT-PCR检测细胞内耐药基因的变化,免疫细胞化学法检测细胞内P-gp蛋白的表达,Westernblotting法检测细胞内P-gp蛋白的表达.结果 历时12个月建成人骨肉瘤耐药细胞系MG-63/PTX,能在含PTX1μg/mL的培养基中稳定生长并传代,其对PTX的耐药指数为69.8,并与卡铂、顺铂、表柔比星、甲氨蝶呤、阿霉素等多种化疗药物存在不同程度的交叉耐药性;罗丹明123排出实验显示MG-63/PTX内罗丹明含量明显低于亲本细胞;RT-PCR结果显示在MG-63/PTX细胞系中存在MDR1、MRP1、LRP、ABCG2基因的表达,而在MG-63细胞系中无MDR1基因的表达.免疫细胞化学、流式细胞仪及Western blotting实验均显示在MG-63/PTX中存在P-gp的表达.结论 MDR1/ P-gp在多药耐药的特性上起着至关重要的作用,而且骨肉瘤多药耐药细胞亚系为进一步研究骨肉瘤耐药特征及逆转方法打下基础.     

shRNA靶向沉默Eag 1钾通道对骨肉瘤细胞增殖、细胞周期及cyclin D1／E表达的影响

目的 探讨短发夹RNA（shRNA）靶向沉默Ether-go-go 1（Eag1）钾通道对骨肉瘤MG-63细胞增殖、细胞周期及cyclin D1／E表达的影响。 方法 使用成功构建的Ad5-Eag1-shRNA表达载体转染MG-63细胞（抑制组）,同时设转染无义序列（Ad5-Control-shRNA）的空转染组及不进行任何处理的对照组。采用逆转录聚合酶链式反应和Western blotting检测Ad5-Eag1-shRNA转染骨肉瘤MG-63细胞后的Eag1 mRNA和蛋白水平,分别采用CCK-8法和克隆形成实验检测各组的细胞增殖情况,流式细胞仪和Western blotting分别检测各组的细胞周期变化和细胞周期蛋白（cyclin D1和cyclin E）的蛋白水平。建立裸鼠骨肉瘤异种移植模型并测量各组裸鼠肿瘤体积的变化情况。结果 抑制组的Eag1 mRNA和蛋白水平均低于空转染组和对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;与其余两组相比,抑制组的细胞增殖、克隆形成数、S期细胞比例及细胞周期蛋白水平均降低,而G0／G1期细胞比例升高,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。抑制组裸鼠的瘤体积小于空转染组和对照组（P＜0.05）。结论 通过shRNA抑制Eag1基因表达可抑制MG-63细胞的增殖并诱导G0／G1期阻滞,可能与调控cyclin D1／E通路有关,有望成为骨肉瘤治疗和诊断的新靶点。