人肠系膜小动脉平滑肌细胞急性酶分离法及其在离子通道研究中的应用

目的　建立一种人肠系膜小动脉平滑肌细胞急性酶分离法并在分离的细胞上研究其离子通道特性 .方法　采用木瓜蛋白酶、胶原酶和透明质酸酶分离出人肠系膜小动脉平滑肌细胞 ,用膜片钳全细胞记录法记录通道电流 .结果　该方法分离过程简单 ,所获细胞数量多 ,形态正常 ,在这些细胞上容易记录到正常的外向钾通道电流 .结论　应用本方法易得单个活性正常、形态完整的人肠系膜小动脉平滑肌细胞     

猪冠状动脉平滑肌细胞急性酶分离及在离子通道研究中的应用

目的：建立冠状动脉平滑肌细胞急性酶分离法并检验其在离子通道研究中的可靠性。方法：采用胶原酶分离单个平滑肌细胞和膜片钳单通道记录法记录通道电流。结果：用该急性酶分离方法所获的细胞数量多,形态正常,在这些细胞上容易记录到通道活动。结论：用该方法获得的单个细胞性能好,所记录的细胞膜上的离子通道活性正常。     

动脉粥样硬化血管平滑肌细胞膜离子通道的研究进展

血管平滑肌细胞的凋亡与K通道活动增加有关 ,在动脉粥样硬化 (AS)发生与发展过程中大电导型钙激活钾通道起着重要的作用 ;某些药物影响AS血管平滑肌细胞离子通道而发挥作用。这给AS发病机制及药物开发研究带来了新的亮点     

三种实用而简单的急性酶分离动脉平滑肌细胞的方法

目的:探讨有效而简便的获取单个动脉平滑肌细胞的方法。方法:应用三种急性酶分离细胞的方法分离人体肠系膜动脉平滑肌细胞,采用单通道膜片钳和穿孔膜片钳技术,记录该细胞上的大电导钙激活钾通道(Large-conductance Ca2+-activated potassium channels,BKCa)电流。结果:三种急性酶分离细胞方法均可有效的获取较高质量的单个人体肠系膜动脉平滑肌细胞,并成功应用于电生理膜片钳实验中,且记录的电流稳定,记录时间长。结论:这三种分离单个血管平滑肌细胞的急性酶分离方法简单而实用,为今后的进一步研究提供有效而简便的方法。     

分次胶原酶消化法分离、培养成人肺微小动脉平滑肌细胞

目的：建立一种简便、高效分离和培养成人肺微小动脉平滑肌细胞的方法并鉴定该方法培养的传代细胞生物学特性。方法：分次胶原酶消化法与传统胶原酶消化法进行细胞获得率、细胞存活率及培养成功率比较;绘制生长曲线对原代与传代细胞的生长特性进行分析;细胞形态学观察、平滑肌肌动蛋白（SMα-actin）测定及细胞免疫荧光化学法进行细胞鉴定及纯度计算;比较原代与第10代细胞形态、SMα-actin含量、染色体数量及形态。结果：分次胶原酶消化法优于传统胶原酶消化法,细胞获得率（3.10±0.29 vs 1.20±0.35）×108 cells/L、细胞存活率(69% vs 21%)及培养成功率（61.5% vs 16.7%）（P＜0.01);传代细胞长至融合时间7 d快于原代细胞21 d;细胞显典型的“峰-谷”状生长,胞浆内表达SMα-actin,细胞纯度达98%以上;原代与第10代细胞形态、SMα-actin含量、二倍体数量（78.13% vs 76.47%）及形态无明显差别（P＞0.05）。结论：分次胶原酶消化法是一种简便、可行,获得高纯度、功能良好的成人肺微小动脉平滑肌细胞的方法。经过此方法分离、培养的细胞在10代以内传代培养细胞生物学及遗传学特性稳定,可用于实验。     

小鼠肺细小动脉平滑肌细胞原代培养和鉴定以及低氧对其增殖与凋亡的影响

 目的：建立一种方法简单、重复性好、培养周期短的小鼠肺细小动脉平滑肌细胞（PASMCs）原代培养及传代方法,并初步探索低氧下小鼠PASMCs的增殖与凋亡情况。方法：无菌条件显微镜下分离小鼠肺细小动脉,经胶原酶I消化结合血清铺底法培养PASMCs。传代过程中弃除对细胞损伤大的离心步骤。倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学法和免疫荧光染色法进行α-平滑肌肌动蛋白鉴定,CCK-8显法及TUNEL法测定低氧下PASMCs的增殖与凋亡情况。结果：形态学观察、免疫细胞化学法和免疫荧光染色法鉴定均表明培养的细胞为PASMCs。与大鼠传代后的PASMCs典型的“峰-谷”样生长相比,传代后的小鼠PASMCs形态各异,没有此典型“峰-谷”规律。原代培养后5~7 d即传代,依据细胞活性可传3~5代。CCK-8法显示,与常氧组24 h比较,低氧组A值升高（P＜0.05）。TUNEL法结果显示低氧24 h后凋亡率较常氧组下降（P＜0.05）。结论：胶原酶I消化结合血清铺底法培养小鼠PASMCs,方法简单,培养周期短,重复性好,是一种值得推广的小鼠PASMCs体外培养方法。低氧可以促进小鼠PASMCs的增殖,抑制小鼠PASMCs的凋亡。     

雌激素受体在大鼠血管平滑肌细胞中的表达及其调控

目的：观察血管平滑肌细胞(VSMC)中雌激素受体(ER)的表达,研究雌激素和血清(含多种生长因子)对细胞中：ER表达的影响。方法：原位杂交和RT-PCR检测大鼠主动脉中层VSMC中的ERmRNA。分别在有或无他莫昔芬(TAM)(ER拮抗剂)预处理的情况下,免疫细胞化学观察VSMC中的ER蛋白,比较雌二醇(E2)以及新生小牛血清(NCS)对VSMC中ER表达的影响。结果：VSMC中存在ERmRNA和蛋白,E2以及NCS均能上调细胞中ER的表达,TAM能阻断其效应。结论：ER是雌激素作用于VSMC的靶基因之一。     

蛋白激酶C在血管平滑肌细胞中的调控作用及其检测

蛋白激酶Ｃ是细胞内诸多信息传递系统相互影响的中心环节。它受胞内钙离子、磷酸肌醇代物产物。ＣＡＭＰ、ＣＡＮＰ等的影响．对血管平滑肌等有调节作用。目前已有５种较稳定的ＰＫＣ检测方法。     

人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒（Ad-hKLK1-IRES-EGFP）,并观察在自发性高血压大鼠（SHR）血管平滑肌细胞（VSMCs）中的表达变化。方法:通过双酶切质粒pBluescritII KS-hKLK1，将hKLK1基因定向克隆至带有IRES-EGFP的腺病毒穿梭质粒pDC316中，构建成重组穿梭质粒 ，将其与腺病毒骨架质粒BHGloxE1，3Cre共转染293A细胞，经包装并获得重组腺病毒，用PCR、酶切及测序方法对其进行鉴定，测定病毒滴度；用重组腺病毒感染VSMCs，用荧光显微镜下观察到的绿色荧光来测定感染率，用RT－PCR和Western blotting法测定hKLK1基因在VSMCs中的表达。结果:PCR、酶切和测序表明携EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确，并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP，其滴度为4.5×10¹¹/L。重组腺病毒感染VSMCs后，在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光蛋白表达，感染率高达90％以上，可检测到hKLK1基因的mRNA及蛋白表达，并与感染时间(1 d-7 d) 有显著依赖关系，峰值感染复数为100 MOI。结论:成功构建并包装了携EGFP和hKLK1基因的双顺反子重组腺病毒载体系统Ad-hKLK1-IRES-EGFP；感染VSMCs可检测到基因hKLK1和EGFP的独立共同高表达，该系统为一直观、安全、高效的基因转移系统。     

肥大细胞在平滑肌细胞源性泡沫细胞形成中的作用

目的 研究肥大细胞(或肥大细胞裂解上清液)、平滑肌细胞与氧化低密度脂蛋白(ox LDL)共孵育时,肥大细胞对平滑肌细胞源性泡沫细胞形成的影响.方法 用ox LDL处理大鼠腹腔肥大细胞后,采用荧光分光光度仪检测组胺释放率,通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色、透射电镜观察肥大细胞脱颗粒状态.将肥大细胞(或肥大细胞裂解上清液)、平滑肌细胞与60 mg/L ox LDL 共育48 h,以油红O染色观测细胞内中性脂质,高效液相色谱法检测细胞内胆固醇和胆同醇酯含量.结果 肥大细胞被ox LDL 激活脱颗粒,肥大细胞脱颗粒度与ox LDL呈剂鼍依赖性关系,以60 mg/L ox LDL处理肥大细胞时,肥大细胞脱颗粒度达71.70%±3.02%;甲苯胺蓝染色和透射电镜均显示,ox LDL处理后肥大细胞明显脱颗粒.在60 mg/L ox LDL存在时,以肥大细胞(或肥大细胞裂解上清液)处理平滑肌细胞48 h后,油红O染色显示,处理组胞浆内脂滴明显多于未处理组;高效液相色谱分析结果 显示,肥大细胞裂解上清液处理组细胞内总胆固醇和胆固醇酯含量明显高于未处理组,总胆固醇增高了 0.57倍,胆固醇酯增高了0.83倍.结论 ox LDL 以剂量依赖性方式诱导肥大细胞脱颗粒;肥大细胞脱颗粒后促进ox LDL诱导的平滑肌细胞源性泡沫细胞形成.     

虎杖甙对大鼠细动脉平滑肌细胞ATP敏感钾通道的影响

目的 :探讨中药虎杖提取物 -虎杖甙扩张休克动物细动脉、改善微循环灌流的作用机制。方法 :应用膜片钳技术的细胞贴附式观察虎杖甙对大鼠肠系膜细动脉平滑肌细胞 ATP敏感钾通道 ( KATP)的影响。结果 :细胞外液加入 0 .2 m mol/L虎杖甙后 ,通道电流幅度无明显改变 ,说明虎杖甙不影响 KATP通道电导 ;但加入虎杖甙后KATP通道动力学发生了明显变化 ,通道开放时间短成分 τ0 1 和长成分τ0 2 增大 ,通道开放时间 Tom延长 ,通道开放概率 Po提高 ,提示KATP通道激活。结论 :虎杖甙具有激活 KATP通道的作用 ,它可能通过使细动脉平滑肌超极化而扩张细动脉 ,从而改善休克动物微循环。     

大鼠肺动脉平滑肌细胞的分离及电压门控性钾电流的记录方法

目的介绍一种大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的急性分离方法并观察电压门控性钾电流电生理特性。方法应用胶原酶和木瓜蛋白酶联合消化法获得大鼠PASMCs,利用全细胞膜片钳技术记录PASMCs膜上的电压门控性钾通道(Kv)电流。结果在相差显微镜下观察大鼠PASMCs呈舒展梭形,边界清晰,有完整的细胞膜,胞浆均匀,数量多,活性好。结论用酶急性分离的大鼠PASMCs,容易进行全细胞膜片钳记录,方法简单、稳定、可靠。     

Adhesion and Function of Human Endothelial Cells Co-cultured on Smooth Muscle Cells

To evaluate interactions between human endothelial cells (ECs) and smooth muscle cells (SMCs) for the development of tissue-engineered vessels, we examined the adhesion and key cell properties of human ECs grown on quiescent human aortic SMCs. ECs attached to SMCs spread more slowly than ECs attached to fibronectin surfaces, and ECs aligned along the direction of the SMCs. ECs attached firmly and less than 5% of the cells were removed by shear stresses as high as 300 dyn cm⁻². Unlike porcine SMCs and co-cultures, human SMCs or co-cultures do not contract under flow, and the human ECs and SMCs in co-culture align toward the direction of flow. A confluent endothelium could be maintained in co-culture for over 30 days, and some of the ECs reoriented perpendicular to the SMCs after 9 days in static culture. Surface tissue factor levels in ECs and SMCs were less in co-culture than in monoculture. Co-culture induced an increase in calponin expression in SMCs. These findings show that human co-cultures can be maintained for long culture periods, where the endothelium remains confluent and responds to long-term exposure to flow, and EC–SMC interactions lead to an increase in SMC differentiation and an EC surface that is less thrombotic.     

Strain Rate Mechanotransduction in Aligned Human Vascular Smooth Muscle Cells

Vascular smooth muscle cells (VSMCs) exist in a dynamic mechanical environment and can sense and respond to mechanical stimuli in vivo. Stretch is known to stimulate intracellular biochemical events, but the influence of the rate at which stretch is applied has not been extensively investigated. Also, most studies of VSMC mechanotransduction use cell culture models not aligned in the direction of stretch. We aligned human VSMC in the direction of uniaxial stretch to examine the importance of strain rate and cell orientation. We demonstrate strain rate profoundly affects stretch-induced phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK)1/2. Low strain rate induced dephosphorylation while physiologic and high rates increased phosphorylation. Dephosphorylation at low strain rate was dependent on cell orientation matching the strain field. Pretreatment with GDPS indicated G proteins are required for ERK1/2 phosphorylation at physiologic strain rate. Apyrase addition to scavenge extracellular ATP inhibited ERK1/2 regulation at low and physiologic strain rates. These results indicate strain rate and cell orientation are important components of mechanotransduction. © 2003 Biomedical Engineering Society. PAC2003: 8719Rr, 8719Ff, 8717-d     

Anatomy of Smooth Muscle Cells in Nonmalignant and Malignant Human Prostate Tissue

Differently graded areas of human prostate adenocarcinoma were examined after Masson's trichrome staining or immunohistochemistry for smooth muscle alpha‐actin, type IV collagen and laminin. In addition, the ultrastructure of the prostatic smooth muscle cells (SMC) during glandular proliferation and epithelial invasion in selected tumors was studied. The SMC formed a thick layer below the epithelial structures in unaffected areas and were closely associated with each other in homotypic interactions. As the tumor grade increased, the SMC gradually lost interactions with each other and became atrophic. With the growth of the epithelial compartment, the SMC initially segregated to the tumor periphery and the intercellular spaces increased. In high grade tumors, the epithelial cancer cells invaded the spaces between the SMC. Immunohistochemical analysis of the basal membrane revealed increased disruption of the usually thick basal membrane, which became thinner and faintly stained with each of the antibodies used. We conclude that most SMC become atrophic following epithelial invasion in human tumors and that degradation of the basal membrane is an important factor in this process. At the ultrastructural level, different SMC phenotypes occur in prostatic tissues during epithelial invasion. Interconversion between these phenotypes is suggested and a probable relationship among them is proposed. Anat Rec, 291:1115–1123, 2008. © 2008 Wiley‐Liss, Inc.     

淋巴细胞对人主动脉平滑肌细胞迁移的影响

用微孔滤膜法分别检测淋巴细胞条件培养液（ＬＣＭ）和γ－ＩＦＮ对培养的人主动脉平滑肌细胞（ＳＭＣ）的趋化活性。结果表明，ＬＣＭ对ＳＭＣ有明显的趋化活性和较弱的化学促动作用；γ－ＩＦＮ对ＳＭＣ有明显的趋化作用和化学促动作用，在５００Ｕ／ｍｌ浓度时其活性最强。提示动脉粥样硬化早期病灶中激活的Ｔ淋巴细胞可通过分泌γ－ＩＦＮ（或伴有其它因子），吸引中膜的ＳＭＣ迁入内膜。