α2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)的表达对结肠癌细胞唾液酸化的影响

目的　研究结肠癌细胞LS174T转染正义和反义的α2 ,6唾液酸转移酶 (ST6GalI)cDNA对结肠癌细胞表面唾液酸化及肿瘤细胞粘附功能的影响 .方法　结肠癌细胞株LS174T转染正义ST6GalIcDNA或反义ST6GalIcDNA的部分序列的表达载体pcDNA3 .1,以RT -PCR检测转染子ST6GalImRNA的表达 ,流式细胞仪检测细胞表面α2 ,6唾液酸含量 .结果　转染正义ST6GalIcDNA的克隆显示ST6GalImRNA的表达增强以及接骨木凝集素 (SNA)与细胞表面成分的结合增加 ;而转染反义ST6GalIcDNA的部分序列的细胞克隆的ST6GalImRNA的表达减少 ,SNA与细胞表面成分的结合力降低 .结论　ST6GalI的表达直接影响细胞表面α2 ,6-连接的唾液酸水平并调节肿瘤细胞的粘附功能 .利用反义核酸技术抑制ST6GalI的表达并降低肿瘤细胞表面α2 ,6-唾液酸水平可能成为减少癌细胞转移的一种手段     

α2，6-唾液酸转移酶（ST6GalⅠ）的表达对结肠癌细胞唾液酸化的影响

目的 研究结肠癌细胞LS174T转染正义和反义的α2，6唾液酸转移酶(ST6GalⅠ)cDNA对结肠癌细胞表面唾液酸化及肿瘤细胞粘附功能的影响．方法 结肠癌细胞株LS174T转染正义ST6GalⅠcDNA或反义ST6GalⅠcDNA的部分序列的表达载体pcDNA3.1，以RT—PCR检测转染子ST6GalⅠmRNA的表达．流式细胞仪检测细胞表面α2，6唾液酸含量．结果 转染正义ST6GalⅠcDNA的克隆显示ST6GalⅠmRNA的表达增强以及接骨木凝集素(SNA)与细胞表面成分的结合增加；而转染反义ST6GalⅠcDNA的部分序列的细胞克隆的ST6GalⅠmRNA的表达减少．SNA与细咆表面成分的结合力降低．结论 ST6GalⅠ的表达直接影响细胞表面α2．6-连接的唾液酸水平并调节肿瘤细胞的粘附功能利用反义核酸技术抑制ST6GalⅠ的表达并降低肿瘤细咆表面α2，6-唾液酸水平可能成为减少癌细胞转移的一种手段．     

ST6Gal I 基因特异性siRNA对SW480细胞黏附和侵袭力的影响

目的:探讨人α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响。方法:设计并合成ST6GalI靶向的siRNA,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验设空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组和ST6GalIsiRNA组,采用RT-PCR测定细胞中ST6GalImRNA表达水平,流式细胞术检测细胞表面α-2,6-唾液酸含量,并分别用CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质(ECM)黏附与侵袭力。结果:与空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组相比,转染48h后,ST6GalIsiRNA组细胞中ST6GalImRNA表达明显下调;转染72h后,ST6GalIsiRNA组细胞表面α-2,6-唾液酸的含量及细胞对ECM的黏附和侵袭力均明显低于其他3个对照组(P<0.05)。结论:化学合成的靶向ST6GalI的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalI基因的表达,降低细胞对ECM的黏附和侵袭力。本实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗奠定基础。     

Taxol对宫颈癌U14细胞增殖、凋亡及α2,6-SA和ST6Gal mRNA表达的影响

目的:研究泰素(Taxol)对小鼠宫颈癌U14细胞株增殖、凋亡以及α2,6-唾液酸(SA)和α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal)mRNA表达的影响,为进一步探讨宫颈癌Taxol化疗机制提供新思路。方法:Taxol处理U14细胞后,MTT检测Taxol对U14细胞的IC_(50)值。流式细胞术检测细胞α2,6-SA、细胞凋亡相关因子(Bcl-2、Bax、caspase8和caspase 3)、凋亡率和细胞周期改变。qPCR检测ST6Gal1和ST6Gal2 mRNA的表达。结果:与对照组相比,Taxol对U14细胞有明显的抑制作用,减弱α2,6-SA荧光强度,上调Bax表达,下调Bcl-2表达,降低Bcl-2/Bax比值,并增强caspase 8和caspase 3活性;Taxol处理显著增加U14细胞凋亡率及S期细胞和G2/M期细胞比率,此外还下调ST6Gal1 mRNA表达。结论:α2,6-SA和ST6Gal可能参与了Taxol对U14细胞细胞周期和凋亡调控的多重作用。     

ST6Gal Ⅰ基因特异性siRNA对SW480细胞黏附和侵袭力的影响

目的：探讨人α-2,6-唾液酸转移酶（ST6GalⅠ）小分子干扰RNA（siRNA）对ST6GalⅠ高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响。方法：设计并合成ST6GalⅠ靶向的siRNA,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验设空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组和ST6GalⅠsiRNA组,采用RT-PCR测定细胞中ST6GalⅠmRNA表达水平,流式细胞术检测细胞表面α-2,6-唾液酸含量,并分别用CytoMatrix^TM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质（ECM）黏附与侵袭力。结果：与空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组相比,转染48h后,ST6GalⅠ siRNA组细胞中ST6GalⅠ mRNA表达明显下调;转染72h后,ST6GalⅠ siRNA组细胞表面α-2,6-唾液酸的含量及细胞对ECM的黏附和侵袭力均明显低于其他3个对照组（P〈0.05）。结论：化学合成的靶向ST6GalⅠ的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalⅠ基因的表达,降低细胞对ECM的黏附和侵袭力。本实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗奠定基础。     

构建hTNF-α/293基因细胞对人结肠癌细胞增殖影响的实验研究

目的通过体外实验研究观察稳定转染hTNF—α／293基因细胞对人结肠癌（LOVO）细胞生长增殖影响。方法采用RT—PCR和ELISA检测稳定转染hTNF-α／293基因细胞和Hek-293细胞mRNA和蛋白表达水平。观察体外培养中,hTNF—α／293基因细胞与LOVO细胞共同培养,于不同的时间点,采用噻唑蓝MTF法检测LOVO肿瘤细胞增殖的活性。结果重组质粒转染Hek。293细胞后,Western blot检测到了hTNF-α蛋白体外表达,检测表明hTNFα／293细胞组和hTNFα阳性组对共培养的LOVO细胞的增殖具有明显的抑制作用,且具有良好的量效关系。结论提示稳定转染hTNF—α/293对LOVO细胞增殖有明显抑制效应,且呈现出良好的数量依赖关系。由于TNF—α／293基因细胞可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外。     

Smad4对结肠癌细胞P16的表达及增殖的影响

目的探讨Smad4对HCT-116结肠癌细胞增殖及P16表达的影响,为结肠癌治疗提供理论依据。方法采用噻唑盐(MTT)比色法观察HCT-116细胞在转染Smad4前后细胞增殖情况,利用Western blot检测转染前后细胞克隆P16蛋白表达的改变。结果 HCT-116组和转染空载体HCT-116组细胞增殖和P16蛋白的表达无明显差异(P>0.05)。过表达Smad4的阳性克隆组与未转染组相比细胞克隆增殖明显降低,P16蛋白的表达上调。结论 HCT-116细胞中过表达Smad4可抑制细胞增殖并提高P16蛋白的表达。     

结肠癌组织微环境对树突状细胞的影响

目的 探讨结肠癌组织匀浆上清液模拟肿瘤微环境对人树突状细胞(DC)分化发育的影响,以及血管内皮生长因子A(VEGF-A)在其中所起的作用.方法 制备新鲜结肠癌及癌旁组织匀浆上清液.分离人外周血单个核细胞,含重组人粒细胞.巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和rhIL-4的1640培养液诱导DC,第2天在此基础上设结肠癌匀浆上清组、癌旁组织匀浆上清组、VEGF-A组及正常DC组,第4天加入结肠癌细胞株SW620抗原,第6天加入脂多糖,第8天收集各组细胞.ELISA检测肿瘤组织匀浆上清液中VEGF-A含量.观察DC形态,流式细胞术检测其免疫表型,RT-PCR检测CD1a表达,CCK-8检测T细胞增殖率及杀伤率.结果 结肠癌组织匀浆上清VEGF-A含量明显高于癌旁组织(P＜0.05);与正常DC组相比,结肠癌匀浆上清组细胞形态明显受到抑制,数目减少,表面抗原表达率明显下降(P＜0.01),混合淋巴细胞反应能力及杀伤力也明显下降(P＜0.01);而VEGF-A组细胞数目及形态与正常DC组相比无明显改变,对所检测的Dc表面抗原并无明显抑制(P＞0.05),但在功能实验中它却起到了明显抑制T细胞增殖及杀伤功能的作用.结论 结肠癌组织匀浆上清液所模拟的微环境对DC的诱导分化及功能有明显的抑制作用,在该过程中VEGF-A起到抑制T细胞免疫功能的作用,但该作用并非通过抑制DC共刺激分子表达而实现.     

Schwann细胞表达β1,4半乳糖基转移酶-Ⅰ对神经元轴突生长的影响

为了探讨周围神经Schwann细胞中不同β1,4半乳糖基转移酶-1(β-1,4-GalT-I)表达水平对神经元轴突生长的影响,本实验首先构建了正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒,然后将构建的不同浓度的正、反义表达质粒超表达于分离、纯化的大鼠Schwann细胞,最后将转染的Schwann细胞与分离的大鼠背根神经节共培养;根据共培养神经元轴突延伸的数目和面积,分析Schwann细胞中不同β-1,4-GalT-I表达水平对神经元轴突生长的影响。结果发现:转染正义β-1,4-GalT-I的Schwann细胞能促进共培养神经节神经元轴突的长出和延伸。在一定的转染浓度内,这种促神经生长作用随转染浓度增大而增强,而转染反义β-1,4-GalT-I却有相反的作用。提示周围神经Schwann细胞中表达β-1,4-GalT-I可能在维持正常神经的功能和促进损伤神经的修复发挥重要作用。     

酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1反义寡核苷酸对泡沫细胞形成的影响

目的：观察酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）反义寡核苷酸对泡沫细胞（FC）形成的影响。 方法： 体外培养人THP-1单核细胞系，由佛波酯（PMA）作用使其分化为巨噬细胞；并建立过表达ACAT1基因的THP-1单核细胞系。在脂质体的介导下将针对ACAT1基因序列的反义和错义寡核苷酸分别作用于上述细胞6 h后加入Ac-LDL进行脂质负荷，以Western blotting法检测ACAT1蛋白表达，放射性同位素标记底物法检测ACAT酶活性的变化，油红O染色法观察泡沫细胞的形成情况。 结果： ACAT1反义寡核苷酸可明显抑制巨噬细胞和过表达ACAT1基因的THP-1单核细胞内的ACAT酶活性，而且可明显抑制Ac-LDL负荷后泡沫细胞的形成；错义寡核苷酸则无此作用。 结论： ACAT1反义寡核苷酸可抑制ACAT的生物学活性及泡沫细胞的形成。     

RNA沉默G6PD对人结肠癌细胞HIF-1α表达的影响

目的:研究siRNA干扰葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因表达的LoVo细胞在低氧环境中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平的变化及其对低氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的影响.方法:构建靶向G6PD基因的siRNA干扰质粒载体,并转染人结肠癌细胞株(LoVo),用限制性内切酶法结合DNA测序鉴定特异重组子,RT-PCR检测G6PD mRNA表达,结合G6PD活性测定判断其干扰效率;以未转染LoVo细胞为对照,进一步观察G6PD沉默的瘤细胞在低氧环境下NADPH水平的变化,RT-PCR检测HIF-1α mRNA表达水平,Western blotting检测HIF-1α蛋白水平.结果:成功构建靶向G6PD的siRNA重组质粒载体并稳定转染LoVo细胞.与未转染组细胞相比,RNA干扰G6PD使mRNA表达下降43%,酶活性下降63.5%,细胞内NADPH水平显著下降(41% vs 100%,P<0.05),但HIF-1α mRNA表达水平无明显变化,而HIF-1α蛋白显著降低.结论:低氧环境下,G6PD基因可能通过下调NADPH水平从而降低HIF-1α的稳定性,导致其水平下降,进而影响肿瘤细胞的低氧反应.     

siRNA沉默G6PD对人结肠癌细胞HIF-1α表达的影响

目的:研究siRNA干扰葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因表达的LoVo细胞在低氧环境中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平的变化及其对低氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的影响。方法:构建靶向G6PD基因的siRNA干扰质粒载体,并转染人结肠癌细胞株(LoVo),用限制性内切酶法结合DNA测序鉴定特异重组子,RT-PCR检测G6PD mRNA表达,结合G6PD活性测定判断其干扰效率;以未转染LoVo细胞为对照,进一步观察G6PD沉默的瘤细胞在低氧环境下NADPH水平的变化,RT-PCR检测HIF-1αmRNA表达水平,West-ern blotting检测HIF-1α蛋白水平。结果:成功构建靶向G6PD的siRNA重组质粒载体并稳定转染LoVo细胞。与未转染组细胞相比,RNA干扰G6PD使mRNA表达下降43%,酶活性下降63.5%,细胞内NADPH水平显著下降(41%vs 100%,P<0.05),但HIF-1αmRNA表达水平无明显变化,而HIF-1α蛋白显著降低。结论:低氧环境下,G6PD基因可能通过下调NADPH水平从而降低HIF-1α的稳定性,导致其水平下降,进而影响肿瘤细胞的低氧...     

TGF-β1对SW620结肠癌细胞PD-L1表达的影响

目的 研究TGF-β1对SW620结肠癌细胞体外增殖、迁移和PD-L1表达的影响,探讨ERK、AKT在TGF-β1调节PD-L1表达中的作用.方法 MTT法检测TGF-β 1对SW620细胞增殖能力的影响;细胞划痕方法检测TGF-β1对SW620细胞迁移能力的影响;Real-time PCR、Western blot和...     

5-氮杂胞苷对结肠癌细胞CHD5基因表达及细胞增殖活性的影响

目的研究甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-氮杂胞苷,AZA)对人肿瘤相关基因CHD5(染色质解旋酶DNA结合蛋白5)在结肠癌细胞中的基因转录的诱导作用以及其对细胞增殖的影响。方法 5μmol/L 5-氮杂胞苷分别作用于Lovo和SW480细胞,连续作用72 h后,用荧光定量PCR(qPCR)检测两种结肠癌细胞系中CHD5mRNA的表达,重亚硫酸盐测序(BSP)法分析启动子区的甲基化状况,MTT法分析5-氮杂胞苷对Lovo和SW480细胞增殖的影响。结果 5μmol/L 5-氮杂胞苷处理Lovo和SW480细胞72 h后,Lovo和SW480细胞中CHD5基因的发生了去甲基化,其mRNA重新表达,细胞生长受到抑制。结论 5-氮杂胞苷能够反转CHD5基因的甲基化状态,调控CHD5 mRNA表达,并能有效地抑制结肠癌细胞的增殖。     

奥沙利铂对结肠癌SW480细胞迁移侵袭及细胞凋亡的影响

目的探讨奥沙利铂对结肠癌细胞SW480细胞的增殖、凋亡及迁移作用的影响。。方法体外培养结肠癌SW480细胞,加入不同浓度的奥沙利铂(5, 10, 20, 40μg/mL),分别培养0,24,48,72h后,平板克隆形成实验检测奥沙利铂对结肠癌SW480细胞生长能力的影响;细胞划痕实验观察实验处理前后SW480细胞的迁移能力的变化;Matrigel细胞侵袭实验检测奥沙利铂对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响;Real-time PCR和Western blot验证Bcl2、Bax、Bcl-Xl、E-Cadherin等基因的表达水平。结果奥沙利铂降低结肠癌SW480细胞的克隆形成率,显著抑制细胞的迁移能力,但奥沙利铂对结肠癌SW480细胞的侵袭能力无抑制作用;下调原癌基因Bcl2和Bcl-Xl的表达水平、上调抑癌基因Bax的表达水平。结论奥沙利铂抑制SW480细胞增殖、促进凋亡与下调Bcl2/Bax比值相关。     

谷胱甘肽S-转移酶π对维吾尔族非小细胞肺癌化疗耐药性的影响

目的 探讨维吾尔族非小细胞肺癌（NSCLC）患者肿瘤组织中谷胱甘肽S-转移酶π（GST-π）的表达对铂类为基础的标准化疗方案化疗耐药性的影响.方法 收集2009年1月至2012年6月新疆医科大学附属肿瘤医院就诊的维吾尔族Ⅲ、Ⅳ期NSCLC患者94例,免疫组化检测化疗前肿瘤组织标本GST-π的表达.患者给予2～4周期铂类为基础的标准方案化疗,然后对化疗后患者的反应率（RR）、总生存期（OS）及肿瘤进展时间（TTP）进行评价.结果 免疫组化显示维吾尔族NSCLC患者肿瘤组织GST-π的阳性率为57.4％（54/94）.GST-π阳性患者与GST-π阴性患者比较,吸烟史与病理类型的差异有统计学意义（均P＜0.05）.GST-π阳性患者化疗后RR、OS及TTP分别为3.7％（2/54）、（203.25±103.65）d、（112.86±67.35）d,GST-π阴性患者分别为12.5％（5/40）、（463.23±204.25）d、（197.56±103.25）d,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.结论 GST-π表达差异可能是维吾尔族NSCLC患者对铂类为基础的标准化疗方案化疗耐药性差别的重要因素.     

ανβ6整合素对氟尿嘧啶诱导的结肠癌细胞凋亡的影响冰

目的：探讨仪ανβ6整合素介导的细胞与细胞外基质的黏附,及其对氟尿嘧啶诱导的结肠癌细胞凋亡的影响。方法：采用流式细胞仪测定结肠癌细胞株HT-29和WiDr细胞ανβ6整合素的表达,并应用酶联免疫吸附实验（ELISA）及丫啶橙（AO）-溴化乙啶（EB）双荧光染色方法检测细胞凋亡。结果：HT-29细胞、WiDr细胞均表达ανβ6整合素,表达率分别为80．82％及82．96％。氟尿嘧啶诱导结肠癌HT-29和WiDr细胞凋亡。经氟尿嘧啶（20mg／L）作用48h后,酶联免疫吸附实验结果显示,生长于ανβ6整合素配体-纤黏连蛋白（FN）上的HT-29细胞、WiDr细胞的富集系数（EF）分别为1．11&#177;0．04、1．09&#177;0．02,明显低于生长于非整合素配体-多聚赖氨酸（polylisin）上的细胞分别为3．68&#177;0．03、3．72&#177;0．02,P＜0．01;用ανβ6整合素的特异性单抗封闭后再生长于FN上时,HT-29、WiDr细胞的EF分别为2．12&#177;0．04、2．14&#177;0．03,明显高于直接生长于FN上（P＜0．01）。AO—EB双荧光染色法结果显示,生长于FN上的HT-29和WiDr细胞凋亡率分别为（5．6&#177;1．1）％、（5．3&#177;0．7）％,明显低于生长于polylisin上的细胞的凋亡率（37．0&#177;1．4）％、（38．5&#177;0．9）％,P＜0．01;用ανβ6整合素的特异性单抗封闭后再生长于FN上,细胞凋亡率分别为（19．5&#177;1．2）％、（20．0&#177;0．7）％,又有明显提高（P＜0．01）。结论：结肠癌细胞株HT-29和WiDr细胞表达ανβ6整合素,ανβ6整合素介导的细胞与FN的黏附抑制氟尿嘧啶诱导的结肠癌细胞凋亡。提示细胞黏附可能通过抑制细胞凋亡而促使细胞产生耐药性。     

β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅱ、Ⅴ表达的亚细胞结构定位研究

为了研究β-1,4-半乳糖基转移酶 和 (β-1,4-Gal T- and )蛋白表达的亚细胞结构定位 ,本实验构建了β-1,4-Gal T- 和 融合绿色荧光蛋白 (GFP)表达质粒 ,分别将构建的质粒转染到 PC12细胞和肝癌 772 1细胞中 ,在荧光显微镜下观察β-1,4-Gal T- 和 在其中表达的亚细胞结构定位。发现 ,β-1,4-Gal T- 和 主要表达在这两种细胞的细胞核旁的 Golgi复合体 ,说明它们主要分布在 Golgi复合体上。提示它们可能是在 Golgi复合体参与蛋白质的糖链修饰