温度和时间对Ⅴ、Ⅷ凝血因子活性的影响

目的探讨温度、时间对Ⅴ、Ⅷ凝血因子活性的影响。方法对同份血浆留多个样本,每种标本留2份(其中1份离心处理),分别置于4℃24 h、72 h,室温24 h,测其Ⅴ、Ⅷ凝血因子活性。结果①Ⅴ、Ⅷ凝血因子标本在4℃、室温放置24h、4℃放置72 h,标本间离心前与离心后,其活性Ⅷ因子平均下降1.1%(IU/m l),Ⅴ因子平均下降1.9%。②Ⅷ因子4℃24 h后与新鲜相比活性下降7.8%,72 h后下降11.2%,Ⅴ因子24 h后下降了3.3%,72 h后下降18.2%。③置4℃24 h与72 h,Ⅷ因子平均下降3.4%,Ⅴ因子下降14.8%。④4℃与室温24 h比较,Ⅷ因子活性平均下降了0.73%,Ⅴ因子活性平均下降了1%。⑤血型之间差异,4℃24 h后Ⅷ和Ⅴ因子活性分别为:A型下降了8%和2%,B型下降了8%和5%,O型下降了7%和3%,AB型下降了8%和3%;4℃72 h后Ⅷ和Ⅴ因子活性分别为:A型下降10.5%和19.5%,B型下降11%和20.1%,O型下降11.3%和20.3%,AB型下降12%和11.8%。结论①血浆在4℃放置24 h与在室温放置24 h相比较,对Ⅴ、Ⅷ凝血因子活性影响差异很小。②4℃和室温下,同份标本在放置同样的时间离心前后Ⅴ、Ⅷ凝血因子活性下降很小。③Ⅷ因子活性在标本置24 h检测时下降相对较大,Ⅴ因子活性在72 h检测时下降相对较大。④Ⅷ因子活性在4℃24 h和72 h后下降程度,ABO血型间相差很小;Ⅴ因子活性在4℃24 h后下降程度,ABO血型间相差相对较大,72 h后A、B、O下降在20%左右,而AB型下降相对较少,为12%左右。     

血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ及蛋白C活性与下肢深静脉血栓形成的相关性

目的通过检测下肢深静脉血栓患者血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ(简称FⅤ、FⅧ或Ⅴ因子、Ⅷ因子)及蛋白C活性,探讨其与患者下肢深静脉血栓形成的相关性及其早期诊断价值。方法随机选取在本院住院的下肢深静脉血栓患者70例,以同期健康体检者70例作为对照组,测定其血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ及蛋白C活性。结果采用Logistic回归分析结果表明,凝血因子Ⅴ、Ⅷ及蛋白C活性是患者发生下肢深静脉血栓的危险性因素。下肢深静脉血栓患者的血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ活性与健康对照组相比均明显增高,蛋白C活性与健康对照组相比均明显减低,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ活性与患者下肢深静脉血栓形成有显著相关性,而且血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ、蛋白C活性水平与下肢深静脉血栓形成危险性呈正相关,凝血因子Ⅷ活性异常增高、蛋白C活性降低是下肢深静脉血栓形成的独立危险因素。     

抗凝血因子ⅧC2区单克隆抗体的制备及功能研究

目的 制备并鉴定抗凝血因子Ⅷ(FⅧ)c2区单克隆抗体(单抗),研究其对FⅧ活性的影响.方法 体外表达rFⅧ C2区蛋白,免疫BALB/c小鼠制备鼠源性单抗.不同剂量的单抗与正常人新鲜混合血浆孵育后测定FⅧ活性及活化部分凝血活酶时间(APTT)等;ELISA法测定该单抗对rhFⅧ与血管性血友病因子(vWF)、磷脂酰丝氨酸(PS)及血小板结合实验的影响.结果 获得一株抗FⅧC2区单抗,命名为SZ-132.与血浆孵育后呈剂量依赖方式抑制FⅧ活性,APTT明显延长;抗体浓度超过25μg/ml时,FⅧ活性为0;该抗体能够抑制rhFⅧ-vWF、rhFⅧ-PS及rhFⅧ与血小板的结合.结论 SZ-132是一株特异性针对FⅧ C2区的抑制性单抗.     

遗传性凝血因子Ⅴ缺乏症伴胡桃夹综合征患者的临床研究

目的:探讨遗传性凝血因子Ⅴ缺乏症伴胡桃夹综合征患者的临床特征及诊疗策略。方法:选择2017年5月27日,于中国医学科学院血液病医院收治的1例遗传性凝血因子Ⅴ缺乏症伴胡桃夹综合征患者为研究对象。采用回顾性分析法,对其病史、血常规、凝血功能、凝血因子活性及抑制物检查、泌尿系统超声检查结果等临床病例资料进行分析。对本例患者进...     

Lman1基因复合杂合突变导致的凝血因子Ⅴ、Ⅷ联合缺乏症

凝血因子Ⅴ和Ⅷ(FⅤ、FⅧ)联合缺乏症(F5F8D)是一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病。近年的研究发现,该病病因在于基因lman1或mcfd2的突变。本研究的目的是对1名F5F8D先证者及其家系成员的lman1、mcfd2基因进行扩增、测序,以查找潜在的致病突变。采集了先证者及其父母的外周血样本,进行了凝血功能相关检查,包括活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、血浆纤维蛋白原(Fg)、FⅤ促凝活性(FⅤ∶C)、FⅧ促凝活性(FⅧ∶C),并提取基因组DNA,通过PCR法对先证者lman1基因的13个外显子及侧翼序列、mcfd2基因的4个外显子及侧翼序列进行特异性扩增,产物经纯化后直接测序,以检测致病突变。根据先证者突变所在位点,选择性扩增其父、母的相应片段,纯化、测序,以便进行家系分析。结果表明:先证者APTT82.2秒、PT19.6秒、TT18.6秒,Fg2.9 g/l,FⅤ∶C 7.1%,FⅧ∶C 18.7%。先证者及其母亲lman1基因第8外显子区出现杂合性单碱基插入c.912_913insA,导致蛋白序列改变p.Glu305fsX20;先证者及其父亲lman1基因11外显子区出现杂合性无义突变c.1366CT,导致p.Arg456X。结论:先证者lman1基因的复合杂合突变c.912_913insA、c.1366CT是导致其发病的原因;前者继承自其母,后者继承自其父。这种复合杂合突变的组合方式尚未见有报道。     

遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症一例家系基因缺陷研究

目的 分析1例遗传性凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺陷症家系表型和分子遗传学特征,对凝血因子基因(F11)进行基因缺陷研究.方法 通过检测先证者及家系成员的活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、FⅪ促凝活性(FⅪ:C)和FⅪ抗原(FⅪ:Ag)等进行临床表型诊断,应用PCR对先证者F11基因15个外显子及其侧翼序列进行扩增,对PCR产物进行直接测序.对先证者及其父母、100名健康对照者DNA相应区域进行PCR扩增,内切酶BssSI酶切,以排除基因多态性并确认突变位点.应用分析软件SignalP对信号肽切割点及位置进行预测.结果 先证者APTT为69.5 s,PT为12.3 s,FⅪ:C为2.6%,FⅪ:AS为2.5%,交叉反应物质(CRM)为阴性;健康对照组APTT为35 s,PT为13 s,FⅪ:C为100%,FⅪ:Ag为100%.测序发现,先证者F11基因外显子区共有4处与GenBank AY191837序列不同的位点,其中外显子2的G3733C杂合变异导致编码信号肽的氨基酸G-1R替换,该突变同时导入1个新的BssSI酶切位点.100名健康对照者的BssSI酶切结果排除了该变异为F11基因多态性.外显子8的C16642T杂合突变导致1个终止密码(Q263Term)产生.结论 F11基因G-1R和Q263Term双重杂合突变是导致先证者遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症的分子发病机制.     

遗传性蛋白S缺陷症家系基因突变的研究

目的 对2个遗传性PS缺陷症家系进行临床表型诊断和基因突变检测.方法 PS:A测定采用发色底物法;TPS:Ag、FPS;Ag测定采用ELISA法;PS基因(PROS1基因)检测采用PCR方法 对先证者PROS1基因的15个外显子及其侧翼内含子序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序.结果 先证者1的PS:A为48.6%,FPS:Ag为41 mg/L,TPS:Ag为136 mg/L,PROS1基因2号外显子在c.C121T位点发生杂合碱基替换,导致编码的PS蛋白存在Arg-1 Cys(R-1C)杂合错义突变.先证者2的PS:A为29.2%,FPS;Ag为26 mg/L,TPS:Ag为83 mg/L,PROSl基因14号外显子在c.C1687T位点发生杂合碱基替换,导致编码的PS蛋白存在Gln522Stop杂合无义突变.结论 c.C121T是PROS1基因的一个新的突变位点,该杂合突变可以导致Ⅱ型遗传性PS缺陷症;c.C1687T杂合突变导致Ⅰ型遗传性PS缺陷症.     

遗传性蛋白S缺陷症家系基因突变的研究

Objective To identify the clinical phenotypic diagnosis and gene mutation detection of two kindreds with PS deficiency. MethodsPS: A was measured by chromogenic substrate method;TPS:Ag, FPS: Ag levels were measured by ELISA method; PS gene(PROS1 gene)was detected by amplifying 15 exons and flanking intron sequences from the propositus with PCR method. PCR products were purified and directly sequenced. Results For propositus 1,PS: A was 48.6% ,TPS: Ag was 136 mg/L, FPS : Ag was 41 mg/L, PROSI gene exon 2 was in c. Heterozygous base substitutions was detected in C121T locus, which led to Arg-1Cys (R-1C) heterozygous roissense mutation encoded in PS proteins. For propositus 2, PS: A was 29.2%, TPS: Ag was 83 mg/L, FPS: Ag was 26 mg/L, PROSI gene exon 14 was in c. Heterozygous base substitutions was identified in CI687T locus, in which Gln.522Stop heterozygous nonsense mutation was encoded in PS proteins. Conclusions c. C121T is a novel mutation locus detected in PROS1 gene. This heterozygous mutation could lead to type Ⅱ PS hereditary deficiency, while c. C1687T heterozygous mutation could bring about type Ⅰ PS hereditary deficiency.     

遗传性蛋白S缺陷症家系基因突变的研究

Objective To identify the clinical phenotypic diagnosis and gene mutation detection of two kindreds with PS deficiency. MethodsPS: A was measured by chromogenic substrate method;TPS:Ag, FPS: Ag levels were measured by ELISA method; PS gene(PROS1 gene)was detected by amplifying 15 exons and flanking intron sequences from the propositus with PCR method. PCR products were purified and directly sequenced. Results For propositus 1,PS: A was 48.6% ,TPS: Ag was 136 mg/L, FPS : Ag was 41 mg/L, PROSI gene exon 2 was in c. Heterozygous base substitutions was detected in C121T locus, which led to Arg-1Cys (R-1C) heterozygous roissense mutation encoded in PS proteins. For propositus 2, PS: A was 29.2%, TPS: Ag was 83 mg/L, FPS: Ag was 26 mg/L, PROSI gene exon 14 was in c. Heterozygous base substitutions was identified in CI687T locus, in which Gln.522Stop heterozygous nonsense mutation was encoded in PS proteins. Conclusions c. C121T is a novel mutation locus detected in PROS1 gene. This heterozygous mutation could lead to type Ⅱ PS hereditary deficiency, while c. C1687T heterozygous mutation could bring about type Ⅰ PS hereditary deficiency.     

凝血因子Ⅷ基因内四个短串联重复序列多态性及其在血友病A基因诊断中的应用

目的 调查中国人群凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子1、24、13和22中4个短串联重复序列(short tandern repeat,STR)的多态性,建立单管四重荧光PCR方法以用于血友病A的基因诊断.方法 采用单管四重荧光PCR扩增220名无血缘关系女性FⅧ基因内含子1、24、13和22内的STR片段,用ABI310型基因分析仪进行毛细管电泳分析片段长度,DNA测序检测二核苷酸重复数.用上述方法对96个血友病A家系进行基因诊断.结果 STR1、STR 24、STR13和STR22分别检出7、9、10和7种基因型;多态信息量(polymorphism information contents,PIC)分别为0.3789、0.4055、0.5239和0.4713;杂合度分别为34.55%(76/220)、38.18%(84/220)、49.55%(109/220)和43.64%(96/220).对96个血友病A家系进行基因诊断,STR1、STR24、STR13和STR22的单独可诊断率分别为38.54%(37/96)、38.54%(37/96)、54.17%(52/96)和42.71%(41/96),联合4个位点的可诊断率达79.17%(76/96).结论 采用单管四重荧光PCR同时检测4个STR位点,具有高效、简单快速的特点,是基因连锁分析进行血友病A基因诊断的有效方法.     

血友病A患者凝血因子Ⅷ基因内含子1及22倒位分析

目的 对血友病A(HA)患者及其家系携带者进行凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子1及22倒位分析,并探讨其与FⅧ抗体产生的相关性.方法 对157例HA患者进行FⅧ活性(FⅧ:C)及FⅧ抗体检测;同时采用双管多重PCR及长距离PCR(LD-PCR)技术对其中81例HA患者进行FⅧ内含子1及内含子22倒位分析;并对其中6例患者进行家系调查.结果 81例HA患者中3例为内含子1倒位,均为重型,占重型HA的4.6%(65例中3例);内含子1倒位患者中1例为FⅧ抗体阳性.用该基因信息对1个内含子1倒位患者家系的2名女性进行了检测,1例为携带者,1例为非携带者.81例HA患者中25例为内含子22倒位,均为重型,占重型HA的38.5%(65例中25例),内含子22倒位患者中发现1例为FⅧ抗体阳性.用该基因信息对5个内含子22倒位患者家系的9名女性进行了检测,7例为携带者,2例为非携带者.结论 内含子1倒位是继内含子22倒位外导致重型HA的另一重要分子发病机制.FⅧ内含子倒位检测不仅可用于血友病直接基因诊断、进行家系调查;同时还可纠正表型分型的偏差.FⅧ内含子1和内含子22倒位可能是抗体产生的高危因素之一.     

遗传性蛋白C缺陷症四个家系的分子发病机制研究

目的 对4个遗传性PC缺陷症家系进行临床表型诊断和基因型分析.方法 分别用发色底物法和凝固法测定4个家系先证者及家系成员的血浆PC:A、TPS:A和FPS:A;PC:Ag和FPS:Ag的测定采用ELISA法.采用凝血酶生成试验检测患者凝血功能的变化.PCR法扩增先证者PC和PS基因的全部外显子及其侧翼序列,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变.结果 先证者1的PC:A为36%,PC:Ag 为57%,TPS:A为48%,FPS:A为18%,FPS:Ag为23.7%,基因分析显示其PC基因2号、7号和8号外显子分别存在L-34P、K150del和A209V 的杂合突变,其中L-34P和A209V来自父亲,K150del来自母亲;先证者2的PC:A为46%,PC:Ag为64.4%,TPS:A为36%,FPS:A为19.5%,FPS:Ag为20.9%,其PC基因的2号和7号外显子分别存在T66C的多态性和R147W的杂合突变,PS基因的14号外显子存在Tyr519stop的杂合突变,其中PC突变来自母亲,PS突变来自父亲.凝血酶生成试验显示先证者2及其父母的抗凝功能减弱,其中PS缺陷的先证者和其父亲的外源性活化蛋白C抑制凝血酶生成的能力下降,而其母亲没有明显变化.先证者3的PC:A为33%,PC:Ag为48.42%,其PC基因同时存在R147W和R178W突变;先证者4的PC:A为21%,PC:Ag为18.36%,基因检测结果显示先证者4是R178W和D255H的双杂合子.结论 遗传性PC缺陷症或PC、PS联合缺陷症是导致4例先证者出现静脉血栓的原因.杂合PC基因突变(L-34P、A209V、R147W、R178W和D255H)是导致4例先证者遗传性PC缺陷症的原因.     

凝血因子Ⅴ缺陷:血栓形成与出血转换的分子基础

第Ⅴ因子(FⅤ)是分子量为330KD的单链糖蛋白,与第Ⅷ因子(FⅧ)及铜蓝蛋白之间在结构上有许多相似之处。FⅤ参与凝血过程中凝血酶的生成,促进凝血,同时,活化的蛋白C(APC)通过灭活FⅤ来抑制凝血。FⅤ缺陷根据产生机制不同可导致对APC的抵抗(APCR)引起血栓病或遗传性FⅤ缺乏症,导致出血。目前已证实部分APCR和遗传性FⅤ缺乏症均存在分子缺陷。本文主要对FⅤ的结构、功能、活化蛋白C抵抗及遗传性FⅤ缺乏症研究的最新进展作一综述。     

一个遗传性凝血因子Ⅶ与X联合缺陷症家系的基因分析

目的 对1例遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)与因子X(FX)联合缺陷患者进行基因分析和家系调查,鉴定导致FⅦ与FX联合缺陷症的基因突变.方法 检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原、FⅦ促凝活性(FⅦ:C)、FX:C及FⅦ抗原(FⅦ:Ag)、FX:Ag等进行表型诊断;用DNA直接测序法分析先证者FⅦ、FX基因的全部外显子、侧翼、5’和3’非翻译区及家系成员相应的突变位点区域;选择106名健康体检者作对照.结果 先证者PT、APTT延长,分别为84.5 s和63.4 s,FⅦ:C、FⅦ:Ag和FX:C、FX:Ag分别为6％、7％和4％、30％;先证者父亲、母亲、姐姐的PT稍延长,FⅦ:C分别为72％、47％、42％,FX:C分别为76％、54％、47％,FX:Ag分别为100％、69％、58％,其APTT、FⅦ:Ag均无明显异常.先证者FⅦ基因外显子8的g.11267C→T纯合突变导致Arg277Cys,FX基因外显子8的g.28139G→T纯合突变导致Val384Phe;其父亲、母亲、姐姐均存在FⅦ基因g.11267C→T和FX基因g.28139G→T杂合子.结论 FⅦ和FX基因分别存在的Arg277Cys、VM384Phe纯合突变是导致先证者FⅦ与FX联合缺陷的分子机制;Val384Phe突变为国际首次报道,推测可能影响FX蛋白合成或分泌功能.     

X-连锁迟发性脊髓骨骺发育不良家系的基因诊断

目的 探讨一个X-连锁迟发性脊髓骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)家系发病的分子机制,建立基因诊断方法 .方法 采用身高测量、影像学检查殚及家系分析进行临床诊断.收集相关家系成员的外周血标本.提取基因组DNA后,采用PCR-SSCP和DNA测序分析家系中先证者、携带者和健康人SEDL基因的第3～6外显子.利用微卫星位点DXS16进行连锁分析.结果 PCR-SSCP检测到先证者第4外显子有异常泳动带;第4外显子的序列分析表明3例先证者均存在C.218C＞T突变,导致氨基酸序列S73L改变,3例携带者均存在该核苷酸位点的杂合突变,健康人未见突变;先证者的第3、5和6外显子核酸序列未见突变.序列分析证实家系中3名未婚女性Ⅲ10、Ⅳ6和Ⅳ7为致病基因携带者.结论 C.218C＞T突变是导致该家系发病的分子机制,可采用第4外显子序列分析对该家系进行基因诊断和产前基因诊断.     

X-连锁迟发性脊髓骨骺发育不良家系的基因诊断

ObjectiveTo investigate the molecular pathogenesis of a pedigree of X-linked spondyloepiphyseal dysplasia atarda (SEDL) and to establish methods of gene diagnosis. Methods Clinical diagnosis was made based on height measurement, radiological examination and pedigree analysis. Peripheral blood samples of relevant family members were collected. After genomic DNA extraction, single strand conformation polymorphism (SSCP) followed with DNA sequencing was used to detect SEDL gene exons 36. Microsatellite marker DXS16 was selected for linkage analysis. Results The abnormal electrophoretic bands were detected in exon 4 of probands by PCR-SSCP. A c. 218C ＞ T mutation in exon 4 of SEDL gene was found in three probands, which resulted in a change in amino acid sequence S37L. The heterozygous exon 4 mutation was identified in three carriers, but not in healthy individuals, and no mutations were detect in exon 3, 5 and 6 of probands. Three unmarried young females (Ⅲ10, Ⅳ6 and Ⅳ7) were found to harbor the mutation by DNA sequencing analysis. ConclusionsA c. 218C ＞ T missense mutation in exon 4 of SEDL gene is the cause of molecular pathogenesis of the pedigree. SSCP and DNA sequencing can be used for prenatal gene diagnosis.     

X-连锁迟发性脊髓骨骺发育不良家系的基因诊断

ObjectiveTo investigate the molecular pathogenesis of a pedigree of X-linked spondyloepiphyseal dysplasia atarda (SEDL) and to establish methods of gene diagnosis. Methods Clinical diagnosis was made based on height measurement, radiological examination and pedigree analysis. Peripheral blood samples of relevant family members were collected. After genomic DNA extraction, single strand conformation polymorphism (SSCP) followed with DNA sequencing was used to detect SEDL gene exons 36. Microsatellite marker DXS16 was selected for linkage analysis. Results The abnormal electrophoretic bands were detected in exon 4 of probands by PCR-SSCP. A c. 218C ＞ T mutation in exon 4 of SEDL gene was found in three probands, which resulted in a change in amino acid sequence S37L. The heterozygous exon 4 mutation was identified in three carriers, but not in healthy individuals, and no mutations were detect in exon 3, 5 and 6 of probands. Three unmarried young females (Ⅲ10, Ⅳ6 and Ⅳ7) were found to harbor the mutation by DNA sequencing analysis. ConclusionsA c. 218C ＞ T missense mutation in exon 4 of SEDL gene is the cause of molecular pathogenesis of the pedigree. SSCP and DNA sequencing can be used for prenatal gene diagnosis.     

成年人及儿童重型血友病A患者凝血因子Ⅷ的预防性应用指南

本指南以文献为依据,以专家共识为基础,介绍在重型血友病A的儿童和成年人患者中预防性使用凝血因子Ⅷ(FⅧ)的作用.指南就预防性使用FⅧ的起始时机、预防方案的选择、治疗过程中的监测、突发出血时的处理,以及患者和家属的教育等问题进行了讨论.     

蛋白C、抗凝血酶及凝血因子Ⅷ活性变化与肺癌合并肺栓塞后治疗的关系

目的探讨蛋白C(PC)、抗凝血酶(AT)及凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性变化与肺癌合并肺血栓栓塞[简称肺栓塞(PE)]后治疗的关系。方法选择肺癌合并PE患者(肺癌+PE组)98例及肺癌患者(肺癌组)100例。记录两组性别、年龄并检测脂蛋白(a)[Lp(a)]、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、C反应蛋白(CRP)、凝血酶时间(TT)、血小板数量(PLT)、纤维蛋白原(Fbg)等指标。检测肺癌+PE组治疗5~7 d及肺癌组入院时的PC、AT、FⅧ、D-二聚体水平。应用Logistic回归分析肺癌合并PE后治疗5~7 d凝血-纤溶状态的影响因素,并采用受试者工作特征(ROC)曲线分析影响因素的诊断效能。结果肺癌+PE组Lp(a)、TC、TG、TT均明显高于肺癌组(P0.05)。肺癌+PE组PC、AT、FⅧ、D-二聚体水平明显高于肺癌组(P0.01)。Logistic逐步回归及ROC曲线分析显示,PC、AT、FⅧ是肺癌合并PE后治疗5~7 d凝血-纤溶状态的影响因素,ROC曲线下面积均0.90。结论肺癌合并PE中期治疗需关注PC、AT、FⅧ对凝血-纤溶系统的影响,其活性水平可用来评估一定时期内的治疗效果和治疗方案。