异种移植血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠的建立

目的建立用于异种移植研究血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠。方法采用受精卵显微注射技术，将含有人ICAM-2启动子、人CD59基因第1个内含子、人CD59 cDNA、BGH polyA终止信号的外源基因导入小鼠受精卵的原核中。选取注射后仍健康的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。聚合酶链反应（PCR）及Southern blot确定外源基因整合阳性转基因小鼠。流式细胞术用于外源基因蛋白质水平表达检测。免疫组织化学方法观察人CD59在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏等器官表达分布情况。结果产仔130只，9只外源基因整合阳性。整合率6％（9／130）。6只获得蛋白质水平表达。蛋白质水平表达强度为人CD59在人白细胞表达强度的80％至95％，转基因效率5％（6／130）。免疫组织化学检测显示人CD59在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏组织有较强表达，且表达限于血管内皮细胞。结论成功地建立了用于异种移植研究血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠。     

异种移植领域转基因动物补体调节蛋白高效特异性表达研究进展

随着异种移植理论的发展，逐渐认识到转基因动物的修饰应主要针对其血管内皮细胞组织，并在建立转基因动物中构建特异的转录调控元件，获得补体调节蛋白在转基因动物血管内皮细胞组织特异性高效表达。本文就近几年有关异种移植领域转基因动物补体调节蛋白高效特异性表达方面研究进展作一综述。     

转人CRP基因在异种移植中的研究

目的：研究转入补体调节蛋白（CRP）DAF、MCP和CD59基因对抑制人补体激活从而克服超急性排斥反应的作用。方法：利用显微注射建立转人衰变加速因子（hDAF)小鼠和猪的模型和转梁hMCP及hCD59真核表达质粒的猪内皮细胞（EC）,研究小鼠和猪EC表达抑制人补体激活的人补体调节蛋白（CRP）对异种移植超急性排斥反应的抑制作用。结果（1）转人DAF基因小鼠心脏用新鲜人血连续丛外灌注,转基因组心脏搏动时间（174．6min)比对照组（106．5min)明显延延长。（2）转hDAF基因猪心脏异位移植给猕猴、移植心最长存活90h,受者死亡前移植心仍有功能,移植心病理检查未见超急性排斥反应病理改变。（3）转DAF基因基因猪EC死亡率在不同浓度血清时均明显低于对照组,在转hDAF基因猪EC上再分别转染hMCP及hCD59真核表达质粒,转hDAF hMCP或hDAF hCD59在不同血清浓度时EC死亡率较单纯hDAF组明显下降（P＜0．05）。结论,转人DAF及MCP、CD59补体调节蛋白基因能克服人对异种器官或组织的超急性排斥反应。     

携带人衰变加速因子基因转基因小鼠的建立

目的 通过建立转人衰变加速因子（ＤＡＦ）基因小鼠,为研究异种器官移植的超急性排斥反应提供有效的研究手段。方法 采用受精卵显微注射技术,将人ＤＡＦ基因导入小白鼠受精卵的原核中,Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交确定阳性围基因小鼠。以Ｎｏｒｈｅｒｎ杂交法检测人ＤＡＦ基因的表达情况。结果 基因注射后共生出小鼠２４只,４只为转基因小鼠,人ＤＡＦ基因在其中１只小鼠体内得到表达,结论 所导入ＤＡ     

异种移植领域转基因动物补体调节蛋白高效特异性表达研究进展

随着异种移植理论的发展 ,逐渐认识到转基因动物的修饰应主要针对其血管内皮细胞组织 ,并在建立转基因动物中构建特异的转录调控元件 ,获得补体调节蛋白在转基因动物血管内皮细胞组织特异性高效表达。本文就近几年有关异种移植领域转基因动物补体调节蛋白高效特异性表达方面研究进展作一综述     

补体在猪到猴异种心脏移植中的作用及机理

目的 探讨补体在异种大动物猪到猴心脏移植排斥反应中的作用及机理.方法 以梅山猪为供者,中国猕猴为受者,行异种腹腔异位心脏移植.随机将受者分为3组.A组(5只):为空白对照组,受者心脏移植后不作任何处理.B组(5只):为照射预处理组,受者于心脏移植前28 d、即1.5个月龄时接受60Coγ3 Gy全身剂量照射,其余同A组.C组(8只):为照射+胸腺注射预处理组,心脏移植前21 d,将供者的脾细胞(按照5×107个/只的数量)注入受者的两侧胸腺内,其余同B组.观察心脏移植术后各组移植心的存活时间;猪对猴单向混合淋巴细胞培养的刺激效应;采用双抗体夹心法检测补体C3和CD46的血清浓度;通过流式细胞术检测受者外周血细胞表面IgM、IgG阳性细胞百分比水平.结果 A、B、C三组移植心的存活时间分别为:(36.6±5.8)h、(65.6±6.5)h和(91.1±22.8)h,C组移植心的存活时间明显延长,与A组比较,P＜0.01,与B组比较,P＜0.05.C组在猪对猴单向混合淋巴细胞反应中的刺激效应较A、B组明显下降(P＜0.01).B、C组移植前补体水平(C3)无明显变化,但随着IgM、IgG水平的上升,发生排斥反应时C3和CD46水平显著降低.C组猕猴特异性抗猪抗体IgM及IgG的上升速度均较A、B组明显延缓.结论 对受者进行异种胸腺注射联合全身照射预处理在抑制T淋巴细胞免疫及体液免疫方面有重要作用,但无法抑制异种排斥反应中补体的激活,补体通过经典途径参与了延迟性异种排斥反应的发生.     

转基因在异种移植中的应用

由于供临床移植的器官严重缺乏,而且使用人体器官供移植也还存在各种伦理、法律问题,所以很久以来人们就试图使用动物的器官来替代丧失功能的人体器官。但一直无法克服跨物种间遇到的主要障碍即异种排斥反应,特别是超急性排斥反应,以及迟发性异种移植排斥反应,因此以往的一切尝试均未能成功。进入９０年代以来,由于对异种移植超急性排斥反应的发生机理有了更深入的研究,此外,分子生物学、基因工程等相关学科也得到飞速地发展,有可能通过各种基因工程的手段对供体动物的某些基因进行修饰,使动物有可能作为人体异种移植的供体。现在…     

小鼠血管内皮细胞表达人DAF和CD59对其心脏在人血清灌注下做功的影响

目的探讨联合转人衰变加速因子（DAF）和CD59基因对小鼠心脏在人血清灌注下做功及组织结构的影响。方法采用受精卵显微注射技术，将人DAF和CD59基因注入昆明小鼠受精卵的原核中，选取注射后仍健康的受精卵植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。提取足月产小鼠（G0代）基因组DNA，以聚合酶链反应（PCR）及Southern印迹杂交确定外源基因整合情况，应用流式细胞术检测人DAF和CD59在转基因小鼠白细胞上的表达，免疫组织化学染色检测人DAF和CD59在转基因小鼠心脏、肝脏及肾脏组织中的表达。取出转基因成功小鼠的心脏，在体外以人血清进行灌注，测定其做功能力，HE染色及免疫组化染色观察灌注后心脏的组织学变化以及补体C3c的沉积情况。以单一转DAF基因的小鼠为对照。结果共获得G0代小鼠135只，经PCR及Southern印迹杂交分析，11只（8．1%，11／135）整合有人DAF和CD59外源基因，其中6只的白细胞膜表面人DAF和CD59表达阳性，强度分别为（86±6）％和（85±8）%，单转人DAF基因者（87±7）%，差异无统计学意义。人DAF及CD59仅表达于转基因小鼠心脏、肝脏及肾脏组织中的血管内皮细胞上。在人血清灌注后60min内，普通小鼠的心脏做功急剧下降，接近40min时心脏停止搏动；转DAF基因小鼠的心脏做功也下降，但仍维持在最大值的20%以上；转DAF和CD59双基因小鼠的心脏做功维持在最大值的40％以上。在人血清灌注的10～60min，转基因小鼠心脏做功能力明显强于普通小鼠心脏（P〈0．05）；灌注20-60min时，转双基因小鼠的心脏做功能力明显强于转DAF基因小鼠心脏（P〈0．05）。普通小鼠心脏在人血清灌注后组织裂解较多见，肿胀严重，而转基因小鼠心脏组织的病理改变明显轻于普通小鼠，转双基因者的病理变化又明显轻于单一转DAF者，心肌血管中人C3c的沉积也明显少于单一转DAF者。结论血管内皮细胞特异性表达人DAF和CD59，可明显阻抑其心脏在异种血清灌注下的做功能力下降及C3c在血管中的沉积，这可能对抵御超急性排斥反应有一定帮助。     

补体系统在异种移植中作用的研究进展

补体系统在异种移植超急性排斥反应中的作用已基本被阐明。通过转基因方法使猪血管内皮细胞表达人补体调节蛋白,可以避免发生异种移植超急性排斥反应。但移植过程中的缺血再灌注损伤却不可避免,补体介导的血管内皮细胞激活可以引起急性血管性排斥反应,并影响移植物的长期存活。本文就补体系统在异种移植领域的研究进展作一综述。     

转人CD59基因的猪胚胎成纤维细胞的建立

补体介导的超急性排斥反应(HAR)是异种移植成功应用的主要障碍。CD59 是一种补体活化调控蛋白,具有良好的抗超急性排斥反应作用。通过对猪胚胎成纤维细胞进行基因修饰,体细胞克隆,有希望克服上述问题。材料与方法一、猪胚胎的获取孕30 d实验用猪(购自中国农业科学院实验站)     

建立血管内皮细胞组织特异性表达人衰变加速因子的转基因小鼠

目的为了研究异种移植，建立血管内皮细胞组织特异性表达人衰变加速因子(DAF)的转基因小鼠。方法采用受精卵显微注射技术，将含有人内皮细胞粘附分子-2(ICAM-2)基因启动子、人DAF cDNA(插有人DAF基因第一个内含子)、SV40splice／polyA的外源基因导人小鼠受精卵的原核中；选取注射后仍健康的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。聚合酶链(PCR)技术及Southern印迹杂交法确定外源基因整合阳性转基因小鼠。RT-PCR方法和流式细胞术分别用于外源基因mRNA及蛋白质水平表达的检测。免疫组织化学方法观察人DAF在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏等器官的表达分布。采用Langendorff心脏灌流装置，用200g／L的稀释人血清灌注转基因小鼠离体心脏，检测其抗超急性排斥反应能力。结果共产仔鼠133只，21只整合有外源基因，整合率16％(21／133)。8只实现mRNA及蛋白质水平表达，蛋白质水平表达强度为人DAF基因在人白细胞表达强度的70％至95％，转基因效率60A(8／133)。免疫组织化学法显示人DAF在转基因小鼠器官组织切片上有较强表达，且表达限于血管内皮细胞。与普通鼠对比，转基因小鼠离体心脏存活时间明显延长，且60min灌注期间内做功仍维持在最大值20％以上。结论成功地建立了血管内皮细胞组织特异性表达人DAF的转基因小鼠。这种小鼠有一定的抗超急性排斥反应能力。     

异种移植超急性排斥机理的实验研究

为了研究补体经典和旁路途径在超急性排斥中的作用，选择猪血管内皮细胞为靶，人血清为天然抗体和补体源，用四唑盐法（MTT）行补体依赖的细胞毒反应（CDC）。人血清能溶解（58±5）％的猪血管内皮细胞；加入乙二醇四乙酸阻断经典途径后人血清的溶细胞率降为（51±3）％（P＜0．01）；入血清50℃加热20分钟，阻断旁路途径后，其落细胞率降为（42±5）％（P＜0．01）；将经典途径和旁路途径分别被阻断的人血清混合，血清的细胞毒作用恢复正常。在这一体外超急性排斥模型中，补体经典和旁路两条途径均参与超急性排斥。提示抑制猪-人之间的超急性排斥应考虑补体旁路途径激活的问题。     

联合转移人HT和DAF基因对模拟异种移植超急性排斥反应的抑制作用

目的探讨联合转移人α1，2-岩藻糖苷转移酶（HT）和衰变加速因子（DAF）基因对模拟异种移植超急性排斥反应的抑制作用。方法通过显微注射制备转人HT及DAF基因的子代小鼠，以聚合酶链反应和流式细胞仪筛选出人HT和（或）DAF基因整合与表达阳性的子代转基因小鼠。以同时表达人HT和DAF基因的小鼠为实验组，单一表达人HT或DAF基因的小鼠为HT对照组和DAF对照组，取其心脏，采用改良的Langendorff心脏灌注装置灌注心脏，先以KH液逆向灌注，30min后再以含15％（体积分数）人AB血清的Krebs—Henseleit液（KH液）灌注。记录不同灌注时间的心率、左心室收缩压及左心室舒张末压，计算左心室获得压，以心率与左心室获得压的乘积作为心脏左心室收缩功能的指标，免疫组化法观察灌注后的心脏血管内皮细胞和组织中IgM与C3c的沉积情况。结果KH液灌注过程中，各组间心脏做功能力的差异无统计学意义；KH液中加入人血清后，HT对照组和DAF对照组的心脏做功能力明显下降，在灌注60min时心脏做功分别为最大值的27％和23％，平均做功时间分别为118min和89min，普通小鼠心脏在灌注后50min时停止搏动，而实验组的心脏做功能力下降缓慢，至60min时心脏做功维持在最大值的67％以上，平均做功时间为225min，其心脏做功能力与搏动时间高于HT对照组和DAF对照组（P〈0．05）。免疫组化染色显示，实验组小鼠心脏血管内皮细胞与组织中未见IgM和C3c沉积，HT对照组可见C3c少量沉积，DAF对照组可见IgM沉积和C3c少量沉积，普通小鼠心脏可见IgM和C3c沉积。结论小鼠联合转移人HT和DAF基因后，其心脏在人血清灌注下的免疫损伤明显减轻，这可能对抵御异种移植超急性排斥反应有一定帮助。     

补体在抗体介导排斥反应中作用的研究进展

随着免疫抑制剂的发展及诊断手段的提高,器官移植后细胞性排斥反应得到很好的预防和治疗,但器官移植致敏患者数量不断增加,抗体介导排斥反应越米越受到关注.补体在抗体介导排斥反应中有重要作用,本文主要对补体在抗体介导排斥反应中的作用机制,补体在抗体介导排斥反应诊断中的应用,以及针对补体的抗体介导排斥反应治疗方案等方面的新进展作一综述.     

转人α1,2岩藻糖苷转移酶基因猪动脉内皮细胞抗人血清溶破实验

目的研究转入α1,2岩藻糖苷转移酶(HT)基因克服异种移植超急排斥反应(HAR)的作用。方法构建pcDNA3-HTcDNA重组质粒,体外培养猪动脉内皮细胞(PAEC),脂质体转染法将pcDNA3-HTcDNA转染PAEC,新霉素(G418)筛选具有抗性的细胞克隆,PCR检测重组基因的整合,流式细胞术(FCM)检测转染细胞H抗原和异种抗原α—Gal表达。分别以未转染的PAEC和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作对照。将转染细胞和正常细胞分别以20％、40％和60％人血清孵育2 h,比较溶破细胞百分数。结果重组质粒转染PAEC经筛选得到抗性细胞克隆,PCR扩增出人HT基因片段,FCM检测正常PAEC与转染PAEC,α-Gal平均荧光强度由1346．81降至194．44,H抗原平均荧光强度由9．10增至215．93;α—Gal M2区由99．98％降至37．180A,H抗原M2区由13．80％升至78．54％。转染细胞以人血清孵育后溶破细胞百分数较正常细胞降低,分别由(32．32±2．37)％、(59．54±4．56)％和(71．46±5．94)％降至(15．78±2．69)％、(30．16±1．46)％和(40．48±3．77)％,差异均有统计学意义(P值均<0．05)。结论转人HT基因PAECα—Gal表达明显降低,H抗原表达升高,对人血清溶破的耐受性增强。转人HT基因可以一定程度抑制HAR。     

人源肿瘤异种移植模型的研究进展

肿瘤细胞系培养技术的出现有力地推动了肿瘤生物学研究地发展,但在肿瘤新疗法地临床转化研究中,细胞系肿瘤模型地预测能力有限,且不稳定.人源肿瘤异种移植模型能高度保留原肿瘤内基质异质性、组织学特性和分子多样性,引起研究者关注并被广泛应用于肿瘤新疗法研究,有望为肿瘤患者个体化治疗带来新突破.     

异种肾移植超急性排斥反应时血液流变学的变化

采用猪-犬肾移植建立超急性排斥反应模型，以研究此时的血液流变学变化。分别在移植前、移植肾超急性排斥发生时和排斥肾切除后10～15分钟检测外周血的血液流变学参数变化。结果异种肾移植发生超急性排斥时，血小板聚集显著增高，移植肾切除后血中的血小板数和纤维蛋白原明显下降，血小板聚集也恢复原有水平。提示血小板、纤维蛋白原参与了异种移植超急性排斥反应的发生过程，而血小板聚集可能是诊断异种移植超急性排斥反应一个有价值的指标。