甲氨蝶呤对炎性细胞因子及丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

目的：探讨甲氨蝶呤（methotrexate,MTX）对类风湿关节炎（RA）发病起重要作用的炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的作用及其可能的机制.方法：用Ⅱ型胶原建立类风湿关节炎（CIA）动物模型,以MTX（0.2 mg/kg/W）进行处理,6周后处死大鼠,取血清进行IL-1β和TNF-α检测;分离大鼠膝关节取关节滑膜细胞（FLS）进行培养、鉴定,检测脂多糖（LPS）诱导的FLS培养上清中IL-1β和TNF-α的含量,并观察MTX对FLS分泌IL-1β和TNF-α的影响;在FLS的培养中加入不同剂量的MTX,用Westen Blot方法检测FLS中ERK蛋白及磷酸化蛋白的表达.结果：关节炎指数评分、关节肿胀度测定及关节病理显示造模成功,分离关节滑膜细胞经流式细胞仪检测FLS的血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的表达为85.5％.造模后,CIA大鼠血清IL-1β和TNF-α明显增加,与空白对照组比较有统计学差异（P＜0.05）,MTX能有效减少CIA大鼠血清中IL-1β和TNF-α的含量（P＜0.05）,但未能恢复至正常水平.MTX能抑制LPS诱导的CIA大鼠关节FLS分泌IL-1β和TNF-α.Western Blot检测显示,不同浓度的MTX对CIA大鼠FLS中ERK蛋白的表达与模型对照组相比无统计学差异（P＞0.05）.CIA大鼠FLS中p-ERK蛋白的表达明显高于空白对照组（P＜0.01）,MTX干预后,低剂量组对p-ERK蛋白表达无明显影响,而中、高剂量组可降低p-ERK蛋白的表达（P＜0.05）.结论：MTX既有免疫抑制作用,同时还通过抑制炎性细胞因子IL-1β和TNF-α而具有抗炎作用,其机制可能部分与其抑制MAPK信号通路中的ERK蛋白磷酸化有关.     

炎性细胞因子在继发性脑损伤中作用的研究进展

脑创伤(traumatic brain injury，TBI)尤其重型TBI是人类创伤死亡的第一原因。重型TBI后发生一系列继发性脑损伤，其中炎症反应尤其是炎性细胞因子．在继发性脑损伤中的作用已引起人们的重视，是近年来较为活跃、发展较快的研究领域之一。本文主要对脑创伤后TNF-α、IL-6、IL-8、ICAM-1、TGF-B、IL-10等炎性细胞因子在继发性脑损伤中的作用予以综述。     

阿魏酸对痴呆小鼠脑内胶质细胞活化与炎性细胞因子表达的影响

目的:探究阿魏酸(FA)对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠脑内炎症与胶质细胞活化及细胞因子表达的影响,揭示阿魏酸对小鼠大脑的保护作用及其机制。方法:将50只昆明种小鼠随机分为假手术组、AD模型组、FA低、中和高3个剂量组。采用脑定位向小鼠右侧海马CA1区注射1μL Aβ1-40建立AD模型,造模成功后第3天开始给药,阿魏酸低、中、高剂量组分别按20.0、40.0、80.0mg·kg-1剂量灌胃,假手术与模型组灌胃等体积生理盐水,用药时间为30 d。实验结束后,处死动物,剖取各组小鼠大脑,采用免疫荧光方法观察大脑皮层区GFAP的表达,用ELISA法测定脑组织中IL-1β、IL-6和TNF-α含量。结果:与假手术组相比,AD模型组小鼠大脑皮层区GFAP阳性细胞表达明显增多(P<0.01),且大脑组织中IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著升高(P<0.01、P<0.01、P<0.01);与模型组相比,阿魏酸3个剂量组小鼠皮层区域GFAP阳性细胞表达均明显减少(P<0.01),且大脑组织中IL-1β、IL-6和TNF-α含量也相应地减少(P<0.01、P<0.01、P<0.01)。结论:阿魏酸可能是通过抑制Aβ1-40对神经细胞的毒性和诱导小胶质细胞活化,使得胶质细胞合成的炎性细胞因子含量减少,进而减轻痴呆大脑组织中炎症的形成,从而达到治疗或改善AD患者的临床症状的目的。     

原发性高血压病患者血清细胞因子水平变化及贝那普利对其影响的意义分析

目的探讨原发性高血压病患者细胞因子IL-8、TNF-α及IL-10的变化及临床意义。方法采用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测52例原发性高血压病患者及30例正常人血清细胞因子水平并进行比较。结果与正常对照组相比,原发性高血压病患者血清IL-8及TNF-α水平明显升高（P〈0.01）,IL-10明显降低（P〈0.01）;贝那普利治疗后患者血清IL-8和TNF-α水平明显下降（P〈0.01）,血清IL-10明显升高（P〈0.01）。结论原发性高血压患者血清细胞因子水平出现明显变化,并在疾病的发生发展过程中起重要作用。     

卡托普利、氯沙坦合用常规药物对冠心病患者细胞因子水平的影响

目的:观察卡托普利与氯沙坦合用对冠心病患者血清炎症细胞因子:TNF-αI、L-6和IL-8的影响。方法:62例冠心病患者被随机分为两组(每组31例),对照组给予常规治疗(硝酸酯类、β-受体阻滞剂及阿司匹林),治疗组在常规治疗基础上加用卡托普利(12.5 mg/次,2次/d)和氯沙坦(50 mg/次,1次/d),两组疗程均8周。结果:治疗组TNF-αI、L-6I、L-8比治疗前分别下降了30.7%、42.7%和39.5%(P<0.01);与对照组治疗后比较有显著性差异(P<0.05)。结论:卡托普利与氯沙坦合用能明显减少冠心病患者血清炎症细胞因子的水平。     

静脉血栓栓塞症与炎性细胞因子

静脉血栓栓塞症(VTE)包括深静脉血栓形成(DVT)及肺血栓栓塞症(PTE)两种临床表现形式，是临床常见疾病，致残率和病死率高。目前其发病机制尚不明确，研究认为VTE较明确的危险因素有制动、创伤、外科手术、恶性肿瘤、以及活化蛋白C抵抗、抗凝血蛋白C、蛋白S缺乏等遗传性病变。随着炎症反应与血栓形成的作用机制及炎症反应在动脉血栓性疾病中临床研究的深入，     

甲基强的松龙对严重肺挫伤患者炎性细胞因子的影响（附65例分析）

目的 观察甲基强的松龙对严重肺挫伤患者炎性细胞因子的抑制作用和临床疗效,确定其合适剂量.方法 65例严重肺挫伤随机分为三组,即小剂量组(A组,n=22,甲基强的松龙针80 mg/d),中等剂量组(B组,n=22,甲基强的松龙针500 mg/d),大剂量组(C组,n=21,甲基强的松龙针1 000 mg/d),治疗期3天,检测入院后治疗前、第4天、第7天血清细胞因子TNF-α、IL-β水平,并观察临床疗效.结果 B、C两组中TNF-α在治疗第4天始,IL-6在第7天始受到明显抑制,较A组同期有显著下降;B、C两组与A组比较血气分析指标改善,ARDS发生率明显降低,机械通气时间显著缩短;B、C两组间比较各指标无显著差异.结论 早期应用中等剂量甲基强的松龙对严重肺挫伤具有良好疗效,可显著抑制机体炎症介质的产生,但更高剂量的甲基强的松龙未见临床疗效的进一步改善.     

硬膜外腔注入利多卡因对血清细胞因子的影响

目的 观察硬膜外麻醉及术后硬膜外腔持续注入利多卡因对上腹部手术患者围术期血清TNF-α、IL-1、IL-4、IL-6变化的影响。方法 36例择期上腹部手术患者,随机分为硬膜外麻醉加术后硬膜外腔注入利多卡因组（Ⅰ组,n=12）,全麻加术后硬膜外腔注入利多卡因组（Ⅱ组,n=12）和全麻加术后硬膜外腔注入生理盐水组（Ⅲ组,n=12）。分别于术前0、5h、术后0h、24h和48h抽取血样测定白细胞计数（WBC）及血清TNF-α、IL-1、IL-4、IL-6浓度。同时记录体温（T）、心率（HR）和平均动脉压（MAP）。结果 ①各组患者体温、心率变化均不明显（P〉0.05）;平均动脉压变化：Ⅱ组术后0h及Ⅲ组术后0h、24h较术前明显增高;白细胞计数变化：3组患者白细胞计数术后0h均较术前明显升高（P〈0,01）,Ⅱ、Ⅲ组较Ⅰ组亦明显升高（P〈0、01）,随后均下降,术后24hⅢ组明显高于Ⅱ组。②3组TNF-α、IL-1在各时点均逐渐上升,术后0hⅡ组TNF-α明显高于Ⅰ组,术后24h、48hIll组TNF-α、IL-1均明显高于Ⅰ组,术后48hⅢ组IL-1明显高于Ⅱ组;3组IL-6水平术后0h均为最高,其中Ⅰ组变化无统计学意义,Ⅱ、Ⅲ组明显高于术前;3组IL-4水平术后0h均为最低,在术后的上升过程中,Ⅲ组较慢,术后48h明显低于Ⅰ组。结论 硬膜外麻醉及术后硬膜外腔持续注入利多卡因可有效抑制促炎细胞因子的释放．术后硬膜外腔注入利多卡因尚可促进术后抑类细胞因子的上升。     

板蓝根对脂多糖刺激鼠释放炎性细胞因子的影响

目的探讨板蓝根抗内毒素活性部位F022对脂多糖(LPS)刺激鼠单核细胞释放炎性细胞因子的影响。方法取BALB/C小鼠腹腔内单核细胞,实验设计为6组。其中,实验组根据F022浓度分为1%、0.5%、0.25%、0.125%4组,分别加入板蓝根F022部位液后再加入LPS液;LPS阳性组仅加入LPS液;阴性组加入1%F022液。之后检测细胞培养上清液中3种炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和一氧化氮(NO)水平。结果LPS可刺激鼠单核细胞过度释放炎性细胞因子TNF-α、IL-6和NO;与阳性组比较,实验组炎性细胞因子水平降低,且呈剂量依赖性。结论板蓝根抗内毒素活性部位F022对LPS刺激鼠单核细胞过度释放炎性细胞因子具有抑制作用。     

血清IL-8、TNF-α在COPD不同时期的变化及意义

目的探讨IL-8、TNF-α在COPD不同时期的变化和临床意义。方法选择48例COPD急性加重期患者分为非机械通气组与机械通气组,经治疗后为缓解期组与顺利脱机组,分别检测四组血清IL-8、TNF-α浓度进行比较分析。结果机械通气组IL-8、TNF-α水平在COPD急性发作期明显高于非机械通气组,经治疗后二者水平明显下降,但顺利脱机组仍明显高于缓解期组。结论 IL-8、TNF-α参与了COPD气道炎症过程,动态检测COPD急性加重期患者血清IL-8、TNF-α水平有助于判断病情的严重程度及预后。     

谷胱苷肽转移酶抑制剂高通量筛选模型的建立和初步应用

谷胱苷肽 - S-转移酶 -π( GST-π)的活性在某些类型的癌症患者中有显著的升高并且在癌症细胞对抗癌药物抗药性的形成过程中起着重要的作用。抑制过量表达的 GST-π酶的活性将有助于克服肿瘤细胞的耐药性 ,因此 ,GST-π被认为是一个潜在的药物作用的靶位点。为了筛选新的抗癌药物的增敏剂 ,我们建立了一个 GST-π酶抑制剂的高通量筛选模型 ,该模型以 CDNB和 GSH为底物 ,在 96 -孔板上通过对 340 nm处吸光度的变化来检测样品对 GST-π酶的抑制活性。经过初筛和复筛 ,从 4 80 0个微生物发酵提取物中筛选到10个阳性样品 ,阳性率为 0 .2 %。     

P-gp蛋白功能抑制剂高通量筛选模型的建立与应用

目的建立高通量筛选模型,寻找疗效好、毒副作用小的肿瘤多药耐药逆转剂。方法以罗丹明123荧光染料胞内积累实验为基础,建立基于细胞水平的高通量筛选模型,对480个中药样品进行了高通量筛选,并采用剂量—活性依赖实验和抗性增敏实验验证阳性样品。结果模型Z′因子为0.72,筛选得到2个中药样品。结论建立的P-gp蛋白功能抑制剂高通量筛选模型稳定性好,灵敏度高,筛选得到的2种中药样品具有较好的P-gp蛋白功能抑制活性。     

Amide derivatives as cytokine inhibitors

The two indicated patents describe benzamide derivatives that are designed to inhibit p38 MAP kinase. This enzyme plays a key role in the biosynthesis of the pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1. These patents report in vitro and ex vivo data for a small number of the compounds described therein.     

谷胱甘肽转移酶抑制剂的高通量筛选

谷胱甘肽转移酶(glutathione Stransferase,GST)是一组具有多种生理功能的同工酶家族,广泛分布于动植物体内,作为机体的II相解毒酶,参与机体的解毒作用[1].研究表明,GST的酶活性水平与肿瘤的耐药性密切相关[2～4].因此,GST可能是治疗耐药肿瘤的潜在药物作用靶点. 目前已知的GST抑制剂大多因毒性较大,限制了临床应用.研究发现,一些动植物体内含有对GST有抑制剂作用的成分[5～8].为了广泛寻找GST特异性抑制剂,本研究旨在建立一种快速、高效、稳定、经济的高通量筛选方法,以GST为靶点,通过高通量筛选技术,对自然界广泛存在着的抑制GST活性的物质进行筛选,以期为开发安全有效的、提高耐药肿瘤临床化疗敏感性的药物提供新的技术方法.     

In silico prediction of SARS protease inhibitors by virtual high throughput screening

A structure-based in silico virtual drug discovery procedure was assessed with severe acute respiratory syndrome coronavirus main protease serving as a case study. First, potential compounds were extracted from protein-ligand complexes selected from Protein Data Bank database based on structural similarity to the target protein. Later, the set of compounds was ranked by docking scores using a Electronic High-Throughput Screening flexible docking procedure to select the most promising molecules. The set of best performing compounds was then used for similarity search over the 1 million entries in the Ligand.Info Meta-Database. Selected molecules having close structural relationship to a 2-methyl-2,4-pentanediol may provide candidate lead compounds toward the development of novel allosteric severe acute respiratory syndrome protease inhibitors.     

Assay in high throughput screening

HTS (High Throughput Screening) has been put into practice in recent years. HTS is aiming to discover lead compounds for medicinal drugs. High efficiency must be achieved in all the processes including sample preparation, assay procedure, automation and data management. This review will focus on the aspects concerned with the assay technology and the efficiency in HTS. One of the major trends in HTS is assay miniaturization using high-density microplates with 384 and 1536 wells. This allows us to increase the throughput and to decrease the cost. The so-called "mix and measure" or "homogeneous" assay system, which has no separation steps such as washing or filtration, is effective for this purpose. The homogeneous assays, such as scintillation proximity assay (SPA), fluorescence energy transfer (HTRF, LANCE) and fluorescence polarization (FP), are frequently used. The reporter gene assay or the cell proliferation assay can be adapted for the homogeneous assay using high-density plates. In addition, HTS measuring the intracellular Ca2+ influx is also possible using a CCD Imager. The assay quality as well as the efficiency is also important especially in HTS. The Z'-factor provides a good tool for evaluating the quality of assays.     

基于极化荧光方法的人LOX-1配体高通量筛选

目的建立以极化荧光为检测方法的高通量筛选技术，通过大规模筛选发现氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)的天然配体。方法密度梯度超速离心获得正常人血中低密度脂蛋白(LDL)，然后用CuSO₄(5 μmol·L^-1)修饰为氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)。FITC标记hLOX-1，以受体(LOX-1)和配体(oxLDL)的相互作用为基础建立筛选模型，用极化荧光检测方法，在激发光485 nm、发射光525 nm,对3 200个样品进行高通量筛选，并用Z′因子值评价实验。结果Z′因子值为0.75，根据建立的基于极化荧光的高通量筛选实验方法，发现3个化合物与hLOX-1有较高的结合活性，IC₅₀值小于31.6 μmol·L^-1。结论极化荧光检测方法适合于高通量筛选技术，具有较高的稳定性、灵敏性和可重复性。     

A novel HIV-1 antiviral high throughput screening approach for the discovery of HIV-1 inhibitors

Antiviral high throughput screens remain a viable option for identifying novel target inhibitors. However, few antiviral screens have been reduced to practice on an industrial scale. In this study, we describe an HIV-1 dual reporter assay that allows for the simultaneous evaluation of the potential antiviral activities and cytotoxicities of compounds in a high throughput screen (HTS) format. We validate the assay with known HIV-1 inhibitors and show that the antiviral and cytotoxic activities of compounds are reproducibly measured under screening conditions. In addition, we show that the assay exhibits parameters (e.g., signal-to-background ratios and Z' coefficients) suitable for high throughout screening. In a pilot screen, we demonstrate that non-specific or cytotoxic compounds represent a significant fraction of the hits identified in an antiviral screen and that these false positives are identified and deprioritized by the HIV-1 dual reporter assay at the primary screening step. We propose that the HIV-1 dual reporter assay represents a novel approach to HIV-1 antiviral screening that allows for the effective execution of industrial scale HTS campaigns with significantly greater returns on resource investment when compared to previous methods.     

药物高通量筛选的设计与实施

本文在简要介绍药物高通量筛选体系的基础上,就组建高效能的高通量筛选体系需要关注的因素,如作用靶点、测试方法、检测方法与作用靶点的匹配、关键参数、效能评价等进行了重点阐述,为高通量筛选体系的设计和实施提供了有益的借鉴。